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1.
应用RT-PCR技术从罗曼鸡脾淋巴细胞RNA中扩增鸡白细胞介素18(ChIL-18)全基因,并克隆和测序。结果表明,获得了ChIL-18全序列,其大小为597 bp。将其成熟蛋白基因(510 bp)亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下表达融合蛋白(GST-ChIL-18)。SDS-PAGE可检测到分子质量为约46 kDa的融合蛋白,Western blot证实该融合蛋白可与鼠抗鸡IL-18单克隆抗体发生特异性反应。用MTT法测定表明,重组蛋白能明显促进鸡T细胞转化的活性。 相似文献
2.
鸡IL-18基因的克隆表达及对新城疫疫苗诱导的HI抗体变化的研究 总被引：1，自引：1，他引：0
通过RT-PCR方法从新城疫Ⅰ系疫苗诱导的11日龄鸡胚脾脏细胞中扩增出鸡白细胞介素18(Chicken interleukin-18,ChIL-18)成熟蛋白基因的cDNA,并将其克隆到pMD18-T载体上。DNA序列测定表明,克隆得到ChIL-18全基因,其编码区大小为597bp,编码198个氨基酸多肽。将该基因片段克隆到原核表达载体pProEXTMHTb构建重组质粒pProEXTMHTb-ChIL-18转化大肠杆菌DH5α中,并用IPTG诱导。重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子量为28.6ku的重组蛋白。观察ChIL-18蛋白对新城疫疫苗诱导的HI抗体动态变化。结果表明,同时接种ChIL-18蛋白和活疫苗的免疫鸡在接种后,所产生的HI抗体效价高于PBS和活疫苗免疫组,并且,HI抗体效价在15d及热应激24h时表现差异显著(P<0.05)。表明ChIL-18蛋白对新城疫疫苗诱导的HI抗体有增强作用。 相似文献
3.
海兰鸡白细胞介素18成熟蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
通过RT-PCR方法从用植物血凝素(PHA)活化60日龄海兰鸡的脾脏淋巴细胞中扩增出海兰鸡白细胞介素18(IL-18)成熟蛋白基因的cDNA,并将其克隆到pGEM-T Easy Vector载体上, DNA序列测定表明, 克隆得到的海兰鸡ChIL-18 cDNA基因全序列包括终止密码子在内其编码区大小为510 bp,编码169个氨基酸多肽. 将该基因片段克隆到原核表达载体pQE30构建重组质粒pQE30-ChIL-18,转化大肠杆菌M15,并用IPTG 诱导. 重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量为19 000的重组蛋白. 相似文献
4.
IBDV VP2/4/3、ChIL-18共表达载体的构建及在Vero细胞上的表达 总被引：2，自引：0，他引：2
为提高传染性法氏囊病病毒(IBDV)多聚蛋白(VP2/4/3)DNA疫苗的免疫效果,应用重叠延伸剪切技术(splicing by overlapping extension)将IBDV VP2/4/3基因与鸡白细胞介素18(ChIL-18)基因分别经3次PCR获得融合基因片段VP2/4/3-ChIL-18和ChIL-18-VP2/4/3,将融合基因片段定向插入真核表达载体pCI中,获得重组质粒pCI-VP2/4/3-ChIL-18和pCI-ChIL-18-VP2/4/3;应用PCR法,在本实验室已成功构建的重组真核表达载体pCI-VP2/4/3和pCI-ChIL-18的基础上,构建VP2/4/3基因和ChIL-18基因的共表达载体co-pCI-VP2/4/3-ChIL-18。在脂质体介导下将上述重组真核表达载体转染Vero细胞,间接免疫荧光证实重组质粒能正常表达目的蛋白,表达的蛋白具有免疫反应性。这为进一步研究ChIL-18的分子免疫佐剂作用及研制高效、价廉的IBDV DNA疫苗提供了实验依据。 相似文献
5.
鸡白细胞介素2真核表达质粒的构建、表达及对AIV疫苗免疫增强作用研究 总被引：3，自引：1，他引：3
将鸡白细胞介素2(ChIL-2)基因亚克隆入pCI载体中,pEGFP-N1载体中的EGFP基因酶切后连入质粒pCI-ChIL-2中,构建真核表达质粒pCI-ChIL-2-EGFP,该载体表达ChIL-2-EGFP融合蛋白.重组质粒在脂质体作用下转染Vero细胞、鸡胚成纤维细胞(CEF)和外周血淋巴细胞(PBLC),荧光显微镜观察到融合蛋白在体外能稳定表达.HI试验显示,pCI-ChIL-2-EGFP与AIV疫苗共注射可明显提高AIV疫苗的免疫原性. 相似文献
6.
从pGEM-ChIL-18克隆质粒扩增获得鸡IL-18(ChIL-18)全基因片段,并将其重组到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/ChIL-18(简称pChIL-18).经PCR、酶切和基因测序证实,所获重组质粒含有目的片段,且连接、构建正确.pChIL-18转染Cos7细胞,转染细胞中含ChIL-18基因的mRNA,表达产物对鸡淋巴细胞具有明显诱导转化作用.pChIL-18对ND灭活苗免疫增强作用的研究表明pChIL-18能够提高ND灭活苗诱发的细胞免疫应答,为后续基因疫苗的研究奠定基础. 相似文献
7.
鸡IL-2全基因和去信号肽基因的原核表达 总被引：4，自引：1，他引：3
根据已发表的鸡白介素-2(ChIL-2)cDNA编码基因序列设计3条引物,利用RT-PCR技术从经诱导的卢氏鸡胚脾淋巴细胞中扩增出429 bp的ChIL-2全长基因cDNA和363 bp去除信号肽的ChIL-2基因cDNA.将ChIL-2全长和去信号肽的基因cDNA分别克隆到原核表达载体pET28a(+),构建原核重组表达质粒pET28a-IL-2和pET28a-△SIL-2,并分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE检测,在22 ku和18 ku处有2条清晰的蛋白带,相同条件下pET28a-△SIL-2表达量较高.RNAstructure软件分析表明,pET28a-IL-2的mRNA5′端序列形成了复杂且较为稳定的二级结构,不利于翻译的起始,证明信号肽序列的存在对ChIL-2基因在原核细胞中的表达有一定的影响. 相似文献
8.
根据GeneBank公布的鸡新城疫病毒(NDV)Lasota株F基因和鸡源性白细胞介素18(ChIL-18)基因序列分别设计特异性引物,且在鸡NDV F基因引物上游引入BamH Ⅰ位点、下游引入Sal Ⅰ位点,在Ch IL-18基因引物上游引入Sal Ⅰ位点、下游引入Hind Ⅲ、BamH Ⅰ位点.以鸡新城疫病毒Lasota株RNA为模板RT-PCR扩增其F基因,将F基因插入pMD18-T的BamH Ⅰ与Sal Ⅰ位点中.同时扩增上游带有Sal Ⅰ位点、下游带有Hind Ⅲ、BamH Ⅰ位点的ChIL-18基因,并将其插入到含有F基因的pMD18-T质粒的Sal Ⅰ、Hind Ⅲ位点之间,从而使NDV F基因与ChIL-18基因形成具有一个完整阅读框的融合基因,然后将融合基因片段定向克隆到pSFV单一启动子(CMV)下游,构建成F-ChIL-18融合基因重组"自杀性"质粒pSFV-F-ChIL-18. 相似文献
9.
[目的]克隆鸡干扰素基因刺激蛋白(STING)胞外区基因并进行原核表达,为了解STING蛋白的生物学功能及探讨禽类的固有免疫机制打下基础.[方法]采用RT-PCR扩增鸡STING胞外区基因,与原核表达载体pGEX-4T-1连接构建重组表达质粒,再转化BL21 (DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后进行12% SDS-PAGE和Western blotting鉴定分析.[结果]三黄鸡STING胞外区基因全长951 bp,与原核表达载体pGEX-4T-1可成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-STING,转化BL21 (DE3)感受态细胞后经1.0 mmol/L IPTG诱导表达4h,12% SDS-PAGE电泳检测得到一个带GST标签约62 ku的融合蛋白,采用抗GST多克隆抗体进行Western blotting鉴定,约在62 ku处可见一条明显的蛋白印迹条带,表明目的蛋白原核表达正确,且特异性较高.[结论]从三黄鸡外周血淋巴细胞中克隆获得的STING胞外区基因片段可在原核细胞中高效表达,且纯化后的融合蛋白可用于制备鸡STING多克隆抗体. 相似文献
10.
构建含有传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)VP2/4/3和鸡白细胞介素2(Chicken Interleukin 2,ChIL-2)融合基因的真核表达载体pCI-VP2/4/3-IL-2、pCI-IL-2-VP2/4/3,并在Vero细胞中进行表达.应用重叠延伸剪切技术(splicing by overlapping extension),分别经3次PCR获得融合基因片段VP2/4/3-IL-2、IL-2-VP2/4/3,定向插入真核表达载体pCI中,获得重组质粒pCI-VP2/4/3-IL-2、pCI-IL-2-VP2/4/3,在脂质体介导下,分别转染Vero细胞.RT-PCR检测证实导入的外源基因在Vero细胞中得到了转录;间接免疫荧光试验(IFA)和Western-blot检测证实重组质粒在Vero细胞中正确表达了插入的外源基因编码的融合蛋白,且表达的融合蛋白具有免疫反应性.重组真核表达载体pCI-VP2/4/3-IL-2、pCI-IL-2-VP2/4/3的成功构建及其在Vero细胞中的有效表达,为进一步探讨ChIL-2作为分子免疫佐剂对IBDV DNA疫苗的特异性免疫增强作用奠定了基础. 相似文献