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1.
【目的】探讨烟酰胺（nicotinamide, NIC）和罗格列酮（rosiglitazone, RSG）对猪前体脂肪细胞凋亡的作用及分子机制,寻找通过凋亡方式调控脂肪细胞数目进而控制生脂的新途径。【方法】分别用含有 0、0.2、0.4、0.6、0.8 和 1.0 mmol•L-1 RSG的培养基处理猪前体脂肪细胞,在处理后的48 h,对不同处理组细胞进行Hoechst33258和Annexin-V-FITC/PI染色以观察细胞形态,流式细胞仪分析细胞凋亡情况;并收集细胞总蛋白,用Western blotting方法检测细胞凋亡关键基因的蛋白表达水平;基于RSG促凋亡的浓度梯度结果,选用1.0 mmol•L-1 RSG分别与含0、0.1、0.2和0.3 mmol•L-1 NIC的培养基共处理细胞,在处理后的48 h,染色并观察细胞形态,流式细胞仪分析细胞凋亡情况;并收集细胞总蛋白、细胞质蛋白和细胞核蛋白,检测细胞凋亡关键基因的蛋白水平。【结果】 RSG以浓度依赖方式诱导猪前体脂肪细胞凋亡,减少了细胞数目;Bcl-2和cleaved Caspase-3凋亡关键蛋白水平随RSG浓度增加而上升,Bax则下降;0.1（P＜0.05）、0.2（P＜0.01）和0.3 mmol•L-1 （P＜0.01）NIC显著削弱1 mmol•L-1 RSG诱导猪前体脂肪细胞凋亡,Bcl-2和cleaved Caspase-3水平显著被下调（P＜0.05）,Bax则被上调（P＜0.05）;0.3 mmol•L-1 NIC明显有助于1 mmol•L-1 RSG处理的猪前体脂肪细胞中的Sirt1由细胞质向核转移,且抑制核中cleaved Caspase-3水平。【结论】NIC通过促进Sirt1由细胞质到核的转位以及下调核中cleaved Caspase-3水平削弱RSG诱导的猪前体脂肪细胞凋亡。 相似文献
2.
[目的]对新疆自育的4个春小麦品种新春8号、新春9与、新春11号和新春14号的Waxy蛋白亚基在籽粒灌浆过程中的动态表达进行分析,研究扬花期后籽粒贮藏蛋白中Waxy蛋白亚基的动态累积规律,为小麦淀粉的品质改良提供理论依据.[方法]利用Waxy蛋白亚基特异分子标记,通过SDS-PAGE电泳进行Waxy蛋白亚基的检测.[结果]4个品种Waxy蛋白亚基的组成不尽相同,新春8号和新春11号Waxy蛋白3个亚基都存在,而新春9号和新春14号为Wx-B1亚基的缺失类型.新春8号亚基出现的时期较晚,花后20 d开始检测到;新春14号Wx-D1亚基的表达要晚于Wx-A1亚基;新春9号和11号亚基于花后15 d检测到,但在籽粒灌浆各时期表达强弱也不尽一致.[结论]Waxy蛋白亚基形成具有时间性,且各亚基在籽粒灌浆过程中的表达规律品种间也不尽一致. 相似文献
3.
钙对大蒜生理特性及主要矿质元素吸收的影响 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】研究不同钙水平对大蒜生理特性及N、P、K、Ca、Mg吸收的影响,为大蒜合理施肥和提高钙肥利用率提供参考。【方法】设定6个钙浓度,在设施拱棚内对大蒜进行水培试验。【结果】钙浓度在0—3.0 mmol•L-1内,大蒜的生长量（株高、假茎粗、假茎鲜质量及叶片鲜质量）、色素含量、净光合速率（Pn）、蒸腾速率（E）及气孔导度（Gs）均随钙浓度的升高而增大,当钙浓度在3.0—5.0 mmol•L-1时,这些指标随钙浓度的升高而减小;另外,大蒜叶片中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、硝酸还原酶（NR）活性以及大蒜的根系活力均随钙浓度的升高呈现先增强后减弱的趋势,在3.0 mmol•L-1钙浓度下达到最强,而叶片中丙二醛（MDA）含量的变化趋势与之相反;同时,大蒜蒜薹和鳞茎的鲜质量及N、P、K、Mg的吸收量也在3.0 mmol•L-1钙浓度下最大,而Ca的吸收量与钙浓度呈显著正相关。【结论】水培条件下,对大蒜生长发育最有利的钙浓度为3.0 mmol•L-1。 相似文献
4.
【目的】克隆斜纹夜蛾受翻译控制肿瘤蛋白（TCTP）基因,分析其序列特征,为深入研究该基因奠定基础。【方法】利用RACE末端快速扩增技术,在斜纹夜蛾卵巢细胞中克隆TCTP基因的全长。根据不同物种间TCTP基因的同源性来构建进化树,并在原核细胞中对斜纹夜蛾TCTP进行表达。【结果】克隆得到斜纹夜蛾TCTP基因全长cDNA,登录号为HQ896486.1。序列分析表明,该基因cDNA全长829 bp,开放阅读框长519 bp,编码含172个氨基酸的蛋白,蛋白分子质量19.67 kD。生物信息学分析表明,斜纹夜蛾TCTP基因属于受翻译控制肿瘤蛋白家族,与其它物种TCTP基因有很高相似性。构建重组质粒 pET32a(+)-TCTP,在大肠杆菌中表达重组蛋白,确定了1 mmol•L-1 IPTG诱导4 h为重组蛋白表达的最佳条件,在短期内能得到大量稳定性好的TCTP蛋白。【结论】从斜纹夜蛾卵巢细胞中克隆得到斜纹夜蛾TCTP基因全长cDNA,并且成功在原核细胞中进行表达。本研究为深入研究斜纹夜蛾TCTP的功能以及针对斜纹夜蛾TCTP基因RNAi干扰的生物防控提供了理论依据和技术支持。 相似文献
5.
【目的】克隆Tri101并通过原核表达获得纯化蛋白,通过免疫SPF大白兔获得高效价、高灵敏度的多克隆抗体,为Tri101蛋白及转Tri101作物的检测提供抗体基础。【方法】以禾谷镰刀菌（Fusarium graminearium）F3210为材料,PCR法获得Tri101并连接至表达载体pET29a（+）,将重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）后利用IPTG进行诱导表达。利用纯化表达产物制备多克隆抗体。【结果】SDS-PAGE分析结果表明,Tri101在大肠杆菌BL21（DE3）中得到表达,重组蛋白大小为50 kD左右,以包涵体形式存在。利用HisTrap亲和柱纯化重组蛋白,最佳咪唑洗脱浓度为200 mmol•L-1。采用烟草蚀纹病毒蛋白酶切除重组蛋白中的His标签,酶切产物经HisTrap亲和柱再次纯化后免疫SPF大白兔,制备多克隆抗体。经ELISA法检测抗体效价为1﹕12 000,检测灵敏度为0.05×10-6 µg•mL-1。Western blotting结果证明制备的多克隆抗体对Tri101具有较好的专一性。【结论】通过Tri101的克隆及原核表达,获得了纯化的融合蛋白,通过免疫动物制备了兔源多克隆抗体,可用于Tri101蛋白及转Tri101小麦的检测。 相似文献
6.
小麦Waxy蛋白亚基缺失类型组合后代糯小麦材料选择的研究 总被引：10，自引：0，他引：10
选用小麦糯性(Waxy)蛋白亚基缺失类型"江苏白火麦"、"内乡白火麦"、"Kanto 107"等为试材,配制组合.在后代群体中鉴定糯性变异材料,结果表明,全糯质籽粒的分离比例在组合间存在差异.讨论了糯性蛋白亚基缺失类型组合早期时代糯小麦材料鉴定方法等问题. 相似文献
7.
中华猕猴桃褐斑病病原鉴定及抑菌药剂筛选 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】确定引起中华猕猴桃褐斑病病原菌种类,研究常用杀菌剂对该病原菌菌丝生长的抑制作用。【方法】对病原菌进行分离、纯化、致病性测定以及形态学、分子生物学鉴定,确定病原菌种类;选用常用的18种杀菌剂分别对病原菌进行抑菌效果测定,并建立毒力回归方程;筛选出有效的抑菌药剂,为防治该病的发生提供理论依据。【结果】从不同病斑上分离出了3个纯化菌株,其形态特征相同。通过病原菌rDNA-ITS克隆测序、比对分析,3个菌株为同一致病菌,应用BLASTn比对结合形态学特征确定该致病菌为链格孢（Alternaria alternata (Fr.:Fr.) Keissler）。在10 μg•mL-1含药PDA平板上,7种杀菌剂对链格孢菌菌株的抑菌率均大于80%,分别为400 g•L-1氟硅唑、500 g•L-1异菌脲、80%戊唑醇、10%多抗霉素B、12.5%烯唑醇、33.5%喹啉酮和10%苯醚甲环唑。【结论】确定中华猕猴桃褐斑病由链格孢引起,400 g•L-1氟硅唑、500 g•L-1异菌脲、10%多抗霉素B和10%苯醚甲环唑对链格孢抑菌效果较强。 相似文献
8.
【目的】克隆甘蔗可溶性酸性转化酶基因（SoSAI1）全长cDNA序列和5?侧翼启动子序列,并分析其序列特征和基因表达模式。【方法】利用RACE技术克隆SoSAI1的全长cDNA序列,应用生物信息学软件分析SoSAI1预期编码蛋白特征;采用Genome Walking技术克隆SoSAI1的启动子序列;采用实时荧光定量PCR分析不同生长期SoSAI1在甘蔗叶和茎中的表达,以及PEG 6000、100 mmol•L-1 NaCl和6℃胁迫下,SoSAI1在甘蔗苗期根和叶中表达模式。【结果】SoSAI1的cDNA序列全长为2 387 bp,ORF长2 058 bp,编码685个氨基酸,预测其分子量和等电点分别为74.44 kD和5.6,GenBank登录号为JQ406875。5?侧翼启动子序列长417 bp,含有胚乳特异表达顺式作用元件和参与干旱诱导的MYB结合位点,GenBank登录号为KC862314。SoSAI1表达在生理成熟期的花序和花序轴中较高,而在成熟茎和老茎中较低。15%PEG和6℃能诱导叶中SoSAI1表达,而15%PEG和NaCl能诱导根中SoSAI1表达。【结论】获得SoSAI1全长cDNA序列和部分启动子序列,SoSAI1在甘蔗生长发育和蔗糖积累,并在应对环境胁迫中发挥作用。 相似文献
9.
【目的】构建整合素(Integrin)β1和β2亚基胞内区原核表达载体,高效表达整合素β1和β2亚基胞内区蛋白,为进一步研究其在细胞迁移和信号传导中的定位及其多克隆抗体的制备奠定了基础。【方法】采用PCR技术,从cDNA中扩增出整合素β1和β2亚基胞内区基因片断,并将其克隆到pGEX-4T2原核表达载体上,构建了GST-β1和GST-β2质粒,然后将GST-β1和GST-β2质粒分别转化E.coliBL21(DE3)表达菌,用IPTG诱导,成功表达了整合素β1和β2亚基胞内区蛋白,并利用Glutathione SepharoseTM4B对表达产物进行纯化。【结果】利用PCR扩增得到了整合素β1和β2亚基胞内区基因片段,并成功构建了GST-β1和GST-β2质粒;对GST-β1和GST-β2诱导表达发现,这2种融合蛋白均为可溶性蛋白,具有良好的生物学活性。通过纯化得到了高纯度的GST-β1和GST-β2融合蛋白。【结论】整合素β1和β2亚基胞内区基因可以高效表达,并具有良好的生物学活性。 相似文献
10.
玉米大斑病菌STK1原核表达载体的构建及其表达 总被引：3，自引：3，他引：0
【目的】构建玉米大斑病菌STK1原核表达载体并进行表达,以期得到带有His标签的目的蛋白。【方法】根据GenBank中STK1(AY849317)的cDNA序列及原核表达载体pET28a(+)中的多克隆位点设计引物,进行STK1的克隆和原核表达载体的构建。将重组载体在原核表达体系中进行表达。通过SDS-PAGE电泳鉴定蛋白的表达,并利用Western blot技术验证该蛋白是否为目的蛋白。【结果】STK1在大肠杆菌中的表达主要以包涵体形式存在;蛋白的分子量约为40.8kD;经1mmol·L-1 IPTG在37℃下诱导,9h后蛋白产量达到最高;经Western blot检测该表达产物具有His-6抗原性。【结论】玉米大斑病菌MAPK信号转导途径中的STK1在大肠杆菌中获得了表达,为今后STK1蛋白的多克隆抗体制备及功能研究奠定基础。 相似文献
11.
绿盲蝽水溶性海藻糖酶ALTre-1基因原核表达、 纯化与酶学特性 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】在前期克隆了绿盲蝽水溶性海藻糖酶（ALTre-1）基因的基础上,以获得具有酶活性的重组蛋白,明确酶促反应的最佳pH值及最适温度,为绿盲蝽海藻糖酶分子调控机制及其抑制剂的应用研究奠定基础。【方法】将含有绿盲蝽ALTre-1基因的T载体经Nde I和Not I双酶切,构建ALTre-1基因原核表达载体（pET28a-ALTre-1）,表达载体经诱导表达和蛋白纯化,获得ALTre-1功能区纯化蛋白。在蛋白浓度为0.3 mg•mL-1的条件下,以海藻糖为底物,对纯化得到的重组Tre-1蛋白进行活性检测,确定其酶促反应的最佳pH值和最佳温度。【结果】ALTre-1基因在大肠杆菌中BL21中能够高效表达,纯化获得的重组蛋白在试验条件下有较高的海藻糖酶水解活性（（184.83±13.39）nmol•μg-1•min-1）。重组ALTre-1蛋白活性最适pH值为7.0（酶活性为（202.04±13.76）nmol•μg-1•min-1）,表明重组ALTre-1蛋白是1个在中性环境中具有最佳活性的海藻糖酶,同时重组ALTre-1蛋白酶活性最适温度为55℃（酶活性为（228.59±4.62）nmol•μg-1•min-1）。【结论】本研究克隆得到了ALTre-1全长基因,获得了具有海藻糖酶活的重组蛋白,该重组蛋白在pH 7.0、温度55℃条件下酶活性最高。 相似文献
12.
【目的】研究普通小麦不同品种的类燕麦贮藏蛋白（avenin-like）基因序列的多样性及其表达产物的加工品质效应。【方法】利用特异性引物对来源于不同地区的12个小麦品种（系）进行PCR扩增、克隆、测序及序列分析;构建JN542444原核表达载体后转入表达菌株Escherichia coli Rosetta gami B(DE3),IPTG诱导融合蛋白表达,并通过His-Trap HP柱纯化蛋白后进行微量掺粉试验。【结果】克隆获得22条avenin-like新基因序列（GenBank登录号JN542443-JN542464）,长度均为855 bp,且均具有可编码284个氨基酸残基的完整的开放阅读框,无内含子;半胱氨酸数目及位置相对保守,除JN542452含有17个Cys外,其余avenin-like所编码的蛋白质序列均含有18个Cys,且位置相同,预测可能形成7个分子内二硫键和4个分子间二硫键;发现3条罕见的avenin-like假基因（JN542448、JN542455和JN542456）,均因终止密码子的提前出现引起基因沉默;7份小麦品种共享一条avenin-like亚基,并与GenBank中来自普通小麦的HM027636完全一致,暂将该亚基命名为“Avenin-likeⅠ”;系统演化分析表明avenin-like编码蛋白与LMW-GS关系最近,与ω-gliadin的亲缘关系最远;SDS-PAGE检测融合蛋白成功表达,对纯化蛋白进行微量掺粉试验,发现Avenin-likeⅠ型蛋白亚基对小麦加工品质具有显著的正向效应。【结论】avenin-like在供试小麦品种中具有很低的多态性,且Avenin-likeⅠ型亚基能提高面粉加工品质。 相似文献
13.
【目的】在中国大豆品种上建立以苹果潜隐球形病毒（apple latent spherical virus,ALSV）为载体的基因沉默体系,为中国大豆品种的基因功能和遗传育种提供一种简便、省时、易操作的技术体系。【方法】构建以农杆菌介导接种的ALSV病毒侵染性克隆载体。从大豆品种威廉姆斯82（Williams 82）中特异扩增327 bp的八氢番茄红素脱氢酶（GmPDS）基因cDNA片段,插入病毒载体pALSV2。通过农杆菌浸润法将病毒载体导入模式植物本氏烟（Nicotiana benthamiana）,17 d后富集病毒粒子,摩擦接种大豆第一轮真叶,以接种病毒空载作为对照组,持续观察测试大豆植株系统叶表型,并结合逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）或荧光定量PCR（qRT-PCR）检测ALSV衣壳蛋白基因（CP）和GmPDS的表达水平。【结果】ALSV﹕GmPDS接种大豆品种威廉姆斯82和南农1138-2,20 d后,前者系统叶未见白化表型,而后者系统叶出现明显的白化表型;qRT-PCR检测结果表明,发生白化的南农1138-2植株中GmPDS的表达水平显著降低,未出现白化表型的威廉姆斯82中GmPDS的表达水平没有出现显著变化。在此基础上,采用相同的方法,测试了ALSV在其他9种大豆品种中诱导GmPDS的沉默效率,发现在南农47、安豆203、祥斗4号、中黄13、山宁29、齐黄34等大豆品种上接种ALSV﹕GmPDS后植株系统叶均产生白化表型,而菏豆12、中黄311和山宁16等3个品种的GmPDS均不能诱导有效沉默。【结论】构建了农杆菌介导的ALSV病毒载体,利用本氏烟扩繁富集ALSV病毒,将提纯的病毒粒体摩擦接种大豆真叶,在多个中国大豆品种上成功建立了基因沉默体系。 相似文献
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天女木兰种子蛋白双向电泳体系的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】探索一套适用于天女木兰种子蛋白的双向电泳体系,为研究其种子萌发过程中的蛋白表达差异奠定基础。【方法】比较蛋白的不同提取方法(酚提取法、三氯乙酸-丙酮-酚提取法、三氯乙酸-丙酮法和Tris-HCl法)、IPG胶条pH梯度(pH3～11NL、pH3～10和pH4～7)、裂解液中的尿素浓度(6,7,8,9mol/L)和分离胶浓度(10%和12.5%)等条件,对天女木兰种子蛋白双向电泳结果的影响,筛选适宜的双向电泳条件。【结果】以Tris-HCl法提取种子蛋白,在IPG胶条pH为4～7、裂解液中尿素浓度为9mol/L、分离胶浓度为12.5%的条件下,可以获得分辨率高、背景清晰、重复性好的天女木兰种子蛋白双向电泳图谱。【结论】建立了适用于天女木兰种子蛋白的双向电泳体系。 相似文献
16.
小麦质膜蛋白基因TaPM19-1的克隆及其对非生物胁迫的响应 总被引：3，自引：2，他引：1
【目的】分析小麦质膜蛋白基因TaPM19-1的特征及其对非生物胁迫的响应,并探讨其在小麦抗逆调控过程中的生物学功能。【方法】利用RACE技术克隆了该基因cDNA全长,采用生物信息学方法分析克隆基因编码蛋白的特性,并通过半定量RT-PCR分析该基因在非生物胁迫条件下的表达特性。【结果】TaPM19-1的cDNA全长1 090 bp,无内含子,编码蛋白包含182个氨基酸,分子量为19.02 kD,包含有典型的AWPM19保守域;依据氨基酸序列将来源于不同植物的16个AWPM19类蛋白分为3组,TaPM19-1与2个来源于大麦及1个二穗短柄草的AWPM19类蛋白亲源关系最近,同属于第三组。高级结构分析显示,TaPM19-1可形成4个由α-螺旋组成的跨膜域,N端位于膜内,包含由27个氨基酸组成的信号肽,C端近40个氨基酸位于膜内。表达分析显示,TaPM19-1除在发育后期的种子中有较高水平表达外,其它组织中未检测到表达;在所检测的2个小麦品种根系中,TaPM19-1的表达受ABA诱导,但在叶片中的表达量极低;水分胁迫条件下,该基因在根系和叶片中均呈现较强的诱导表达特性;在高盐和高温胁迫条件下,该基因在洛旱2号小麦中均可诱导表达,而在中国春小麦中未检测到该基因表达;在低温胁迫条件下,未检测到TaPM19-1的表达。【结论】获得了小麦质膜蛋白基因TaPM19-1的cDNA全长,其编码蛋白可形成典型的跨膜结构特征;该基因受植物激素ABA的诱导,在洛旱2号中也可被干旱、高盐和高温胁迫诱导,但在中国春中对高盐和高温胁迫无响应。推测TaPM19-1在洛旱2号和中国春中存在不同的转录调控机制。 相似文献
17.
【目的】对家蚕浓核病毒镇江株非结构蛋白2（NS2）基因进行克隆、表达,并测定表达产物的生物活性。【方法】利用PCR技术从家蚕浓核病毒镇江株（BmDNV-Z）基因组中扩增得到非结构蛋白2(NS2)基因片段,将其克隆到表达载体pET28a得到重组表达质粒pET28a-NS2,在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达,SDS-PAGE和Western blot检测,表达产物经Ni柱纯化,经过复性检测其Helicase和ATPase活性。【结果】克隆获得了BmDNV-Z NS2基因,并在大肠杆菌中得到了成功表达,表达产物经Ni柱纯化获得了目的蛋白NS2。纯化的NS2蛋白具有Helicase活性,能将双链DNA底物解旋成为单链,并且具有一定的底物极性选择性,对于极性底物表现出更高的解旋活性。同时,纯化的NS2蛋白具有ATPase活性,其酶活力可达到0.276 μmol?μg-1?h-1。【结论】BmDNV-Z NS2基因编码的病毒非结构蛋白具有Helicase和ATPase活性,并且Helicase活性具有一定的底物极性选择性,推测该基因在病毒DNA的复制过程中发挥重要作用。 相似文献
18.
[目的]通过表达和纯化捻转血矛线虫新功能基因He38最大开放阅读框ORF1,确定完整的Hc38蛋白天然表达形式、分子量大小和免疫学活性鉴定,为研究该基因功能和基因工程应用奠定基础.[方法]参照本实验室在GenBank上登录的捻转血矛线虫ZJ株的He38基因序列(AY594263)设计引物,PCR扩增目的基因并克隆到表达载体中,重组表达载体转化大肠杆菌后IPTG诱导表达,SDS-PAGE和薄层扫描检测分析表达产物,通过亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western bloting和ELISA方法检测其抗原性.[结果]Hc38基因在大肠杆菌中高效表达,表达的融合蛋白相对分子量约为68 KD,表达量占菌体蛋白总量的30;,亲和层析柱纯化出目的蛋白,并能被捻转血矛线虫病绵羊阳性血清和重组表达产物免疫小鼠血清识别,具有反应原性.[结论]实现了Hc38基因的原核表达和纯化,验证了Hc38基因在虫体内的表达形式和抗原性. 相似文献