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1.
为研究耐辐射动球菌Rec O和RecR蛋白的抗紫外辐射损伤效应,本研究通过PCR扩增耐辐射动球菌rec O和recR基因的全长序列,构建重组质粒p GEX-2T-rec O和p GEX-2T-recR并转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导重组蛋白表达,Western Blot检测蛋白表达,测定紫外辐照前后E.coli BL21(DE3)、空载菌株及表达菌株的生存率,并采用实时荧光定量PCR技术检测工程菌中耐辐射动球菌rec O、recR基因及E.coli BL21(DE3)中Rec FOR途径相关基因(rec F、rec O、recR、rec A、rec G、ruv A、ruv B、ruv C、ssb)的表达情况。结果表明,Rec O和RecR融合蛋白在大肠杆菌中成功诱导表达;当紫外辐照剂量大于8 J·m-2,导入p GEX-2T-rec O和p GEX-2T-recR的工程菌存活率均高于对照组,说明耐辐射动球菌RecR和Rec O蛋白能增强E.coli BL21(DE3)对紫外辐射的抵抗能力;Rec O工程菌中rec F、recR、rec A、rec G、ruv A、ruv B、ruv C、ssb的表达明显高于对照组,RecR工程菌中Rec FOR途径其他相关基因的表达与对照组差异均不显著,表明耐辐射动球菌recR和rec O基因可通过不同的调控路径提高E.coli BL21(DE3)的抗紫外辐射能力。本试验结果为耐辐射动球菌的耐辐射机制研究提供了一定的科学依据。 相似文献
2.
Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)是一种Ⅰ型跨膜蛋白,广泛表达于哺乳动物细胞表面,在抗感染免疫中发挥重要作用.为探讨TLR4基因在大肠杆菌(Escherichia coli引起的小尾寒羊(Ovis aries)乳房炎的乳腺组织中的表达情况,本实验以大肠杆菌(O113型)人工感染小尾寒羊乳房,建立乳房炎病理模型,采用qRT-PCR检测TLR4基因在正常乳腺组织和感染大肠杆菌后乳腺组织中的相对表达量,用蛋白免疫印迹(Western blot,WB)和免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)SP法研究了正常乳腺组织和感染大肠杆菌后乳腺组织中TLR4蛋白的表达量和组织内分布.结果显示,正常乳腺组织和感染大肠杆菌后乳腺组织中均有TLR4的表达,而感染后48 h时TLR4 mRNA和蛋白相对表达量最高,96 h时TLR4mRNA和蛋白相对表达量显著低于48 h(P＜0.05),正常对照组TLR4的相对表达量最低(P＜0.05).免疫组织化学染色发现,正常乳腺组织和感染大肠杆菌后的乳腺组织中乳腺腺泡上皮均有TLR4阳性表达,与对照组相比,感染后阳性表达明显增强(P＜0.05).本研究结果表明,小尾寒羊感染大肠杆菌后乳腺组织中TLR4的表达明显上调,这为进一步研究TLR4在绵羊乳房炎发病过程中的作用机制提供了基础资料. 相似文献
3.
通过PCR的方法从丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)ICMP2189中克隆到了乙烯形成酶基因efe,并且在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中利用T7强启动子进行了高效表达,表达蛋白占总蛋白的45%。气相色谱分析表明,含有efe基因的大肠杆菌可以高效地产生乙烯。 相似文献
4.
叶绿体依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)的硫氧还蛋白还原酶含有还原酶结构域和硫氧还蛋白结构域,每个结构域含有两个催化的Cys残基.利用RT-PCR克隆了编码成熟的依赖NADPH硫氧还蛋白还原酶基因,分别将还原酶结构域以及硫氧还蛋白结构域活性中心两个催化的Cys残基定点突变成Ser残基,将野生型和突变型基因分别插入大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET-28b,转化至大肠杆菌BL21(DE3),表达的重组蛋白N端含有组氨酸标签.电泳检测显示野生型硫氧还蛋白还原酶的可溶性表达水平受诱导温度和共表达分子伴侣GroEL、GroES和GrpE影响,而蛋白突变体主要表达为包涵体.纯化的重组野生型蛋白SDS-PAGE上显示亚基分子量为52kD,分别以DNTB(6,6′-Dinitro-3,3′-dithiodibenzoic acid)和胰岛素为底物,确定了硫氧还蛋白还原酶两个结构域的催化活性.本研究结果表明,玉米NTRC在大肠杆菌可溶性表达,纯化的重组蛋白具有硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶活性. 相似文献
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潮霉素磷酸转移酶（hpt）基因的原核表达、蛋白纯化及其抗体制备 总被引：2，自引：0，他引：2
从转基因玉米(Zea mays)基因组上成功地克隆出潮霉素磷酸转移酶基因(hpt),通过BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切将hpt基因与pET30a进行粘性末端连接,成功构建了pET30a-hpt质粒,并转化到大肠杆菌(Eschenchia coli)BL21中进行蛋白表达.在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,pET30a-hpt融合表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中以可溶性蛋白的形式高效表达了HPT蛋白,并通过金属鏊和层析纯化了目的蛋白.用肠激酶切除了融合蛋白的融合部分之后再一次通过金属鏊和层析,经过透析后获得了HPT纯品,并且使用纯化的HPT蛋白免疫兔制备了特异性强、灵敏度高的多克隆抗体. 相似文献
6.
为了使猪源抗菌肽Protegrin-1(PG-1)在原核表达载体中获得高效表达,在不改变PG-1氨基酸的基础上,根据大肠杆菌偏好密码子表,替换PG-1部分密码子,设计两段互补的引物,利用搭桥PCR技术扩增完整的PG-1成熟肽基因,重组至融合表达载体pGEX-4T-1中,构建成抗菌肽PG-1基因融合表达载体pGEX4T-PG-1,转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)plyS中,筛选得到阳性克隆,并用1.0 mmol/L的IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE电泳图谱显示在28 kD处有特异性的蛋白条带出现,经Western blot检测表明重组子已经成功地在大肠杆菌中表达了融合蛋白.纯化得到的GST-PG-1用凝血酶切割后,经用亲合层析得到分子量约为2 kD抗菌肽PG-1蛋白1.38 mg/L.对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抑菌试验结果表明,重组抗菌肽PG-1具有明显的抑菌效果. 相似文献
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脂肪特异性磷脂酶A2基因(adipose-specific phospholipase A2,A dPLA)在脂肪组织甘油三酯水解过程中发挥着重要的调节作用,为了构建黄牛AdPLA基因原核表达系统,本研究通过Overlap PCR方法从黄牛(Bos taurus)基因组DNA中得到了AdPLA基因编码区全长,将其克隆到pGM-T载体上,阳性克隆经测序表明,与NCBI公布的序列(GenBank No.NM_001075280)完全一致.阳性质粒经BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切后,将其定向重组到pET28a(+)原核表达载体上,转化感受态大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)中,用IPTG诱导融合蛋白表达.SDS-PAGE电泳表明,融合蛋白His-AdPLA在大肠杆菌中表达,证明成功构建了AdPLA基因原核表达系统,为进一步研究黄牛AdPLA基因的功能和AdPLA蛋白产品开发提供了依据. 相似文献
8.
从6周龄的胎牛(Bos taurus)原始生殖嵴中提取总RNA,通过RT-PCR扩增nanog基因,将其克隆到PMD-18T载体,然后再亚克隆到pGEX-KG表达载体上,获得原核表达质粒pGEx-KG-nanog,限制性内切酶分析和DNA测序证明所插入片段为牛nanog基因编码序列.重组质粒转化大肠杆菌JM109(Escherichia coli),在不同的培养温度(25、30和37℃)和不同浓度的IPTG(0.10、0.25、0.50、1.00和2.00mmol/L)诱导下均获得了表达,结果表明,培养温度和IPTG浓度对GST-Nanog融合蛋白在大肠杆菌中的表达影响甚微;经Western blot检测证实该蛋白约60kD,并具有GST抗原活性,证实目的蛋白为Nanog蛋白. 相似文献
9.
从Bacillus sp.110-2基因组上分离得到的耐碱锰超氧化物歧化酶基因(Mn-sodA),将其连接到原核表达载体pET-30a(+),得到重组载体pET-sodA,重组载体在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导得到表达.SDS-PAGE分析显示,融合表达产物的分子量大小为26.5 kD.对含有sodA基因工程菌的表达情况研究表明,重组蛋白全部以可溶性形式存在;重组酶的比活力252 U/mg,为原始菌株的2.1倍,目的基因在大肠杆菌中实现了高效表达;而且,重组酶还保留了野生型酶强的耐碱能力.BL21(pET-sodA)基因工程菌的构建提供了一种可利用的耐碱蛋白资源,同时探索了一种极端酶的生产方法. 相似文献
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利用克隆的新疆荒漠昆虫准噶尔小胸鳖甲(Microderapunctipennisdzhungarica)抗冻蛋白基因MpAFP5的全长序列设计PCR引物,构建原核表达质粒pMALp2x-MpAFP5,以麦芽糖融合蛋白(MBP)方式在大肠杆菌(Escherichiacoli)TB1中进行表达,经Amylose树脂亲和层析纯化获得了较高纯度的MBP-MpAFP5融合蛋白。Westernblot结果证明,MBP-MpAFP5融合蛋白在大肠杆菌中得到特异性的正确表达。细菌抗冻实验结果表明,导入MpAFP5基因的大肠杆菌经诱导表达在低温处理时抗冻能力无显著提高,而外加纯化的MBP-MpAFP5融合抗冻蛋白对细菌有明显保护作用,并随浓度升高而保护作用增强。 相似文献
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将从胡杨中克隆的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因（PeALD）构建到pGEX-4T—1载体上,经IPTG诱导成功获得融合蛋白GST：PeALD,并将蛋白进行纯化,其大小约为52kD,转化大肠杆菌的耐盐性实验表明,PeALD基因的成功表达有利于提高大肠杆菌菌株的耐盐性。为研究该基因编码蛋白在植物细胞中的定位,将基因的ORF区构建到定位表达载体pMDC85上,通过PEG介导的拟南芥瞬时转化法观察融合蛋白PeALD：GFP在细胞中的定位情况,结果显示该蛋白定位于胞质中,由此说明实验克隆得到的该胡杨果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因编码的是胞质蛋白。烟草种子在盐培养基上的萌发实验结果显示转基因烟草具有更高的耐盐性;烟草水培苗经200mmol／LNaCl处理一周后,可溶性糖的质谱检测结果显示转基因植株中葡萄糖的含量有很大提高。表明胡杨果糖-1,6-二磷酸醛缩酶通过促进糖酵解和有氧呼吸途径来提高植物对盐胁迫的适应性。 相似文献
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为研究氯化胆碱和海藻糖对油菜蕾薹期干旱胁迫的缓解效应,本试验以5个油菜栽培品种为研究对象,在蕾薹期设置干旱胁迫、干旱胁迫下添加氯化胆碱及干旱胁迫下添加海藻糖3个处理,通过考察15个耐旱指标,探究不同处理对油菜蕾薹期形态、生长发育和生理特性的影响,并对3种处理下的油菜耐旱性进行综合评价和耐旱指标筛选。结果表明,干旱胁迫导致油菜株高、茎粗、总鲜重、地上部鲜重、超氧化物歧化酶(SOD)活性显著下降,可溶性蛋白、脯氨酸、丙二醛(MDA)含量极显著上升。添加氯化胆碱后,可溶性蛋白含量显著下降(34.96%);添加海藻糖处理后,SOD、过氧化物酶(POD)活性极显著升高(77.22%和183.93%),MDA和可溶性蛋白含量均极显著降低(64.68%和27.68%)。耐旱性效应综合评价表明,干旱胁迫下,淮油18号耐旱性最强(D=0.706),南农油3号耐旱性中等(D=0.476),秦优33、秦油10号和美国油王999耐旱性最差(D=0.364~0.404)。添加氯化胆碱(D值平均提高40.00%)较海藻糖(D值平均提高13.95%)起到更好的抵御干旱逆境的作用。本研究筛选出的根长、茎粗、总鲜重、根鲜重、地上部干重和总干重等指标,可作为油菜抗旱特性快速鉴定的指标(R2=0.992)。综上所述,外源氯化胆碱对干旱胁迫下蕾薹期油菜有更好的缓解作用,这为油菜的耐旱栽培提供了理论依据。 相似文献
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盐胁迫下AM菌侵染的棉花幼苗根系蛋白质组分析 总被引：1，自引：0，他引：1
研究了盐胁迫对棉花幼苗生长的抑制作用和AM真菌侵染根系对盐胁迫的缓解作用。分别以水(对照),0.5% NaCl(盐胁迫组)和AM组(盐胁迫组中加入AM接种剂,浓度为12g/L)培养棉花幼苗30d,取根部进行外观比较,并提取各组根系中的蛋白质,利用双向电泳技术分析棉花幼苗根系蛋白质组的变化。结果表明,盐胁迫组的幼苗根系主根稍细,侧根很少,而对照和AM组主根饱满且侧根丰富,说明AM真菌能抑制盐对幼苗根部的胁迫作用。通过扫描分析3组胶图,发现有4个蛋白质斑点表现出显著的变化,盐胁迫组中均表现为表达量下降,在AM真菌与盐共处理时,这4个蛋白质点的表达均有不同程度的恢复;经鉴定分析,其中2个蛋白质斑点(S1,S2)分别被鉴定为葡萄糖磷酸变位酶与异黄酮还原酶类;同时在AM组还出现3种对照中没有的蛋白质(S5、S6、S7),可能与AM提高作物耐盐性途径相关。 相似文献
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盐生植物海马齿常年生长在海边沙地,能忍耐高盐干旱。本研究对从海马齿植物盐胁迫下的差减文库（SSH文库）中分离的3个全长基因SRTG152-I、SRTG152-Ⅱ和SRTG152-Ⅲ（GenBank：FJ457924,FJ457925和FJ457926）进行了微生物表达和耐盐分析。3个全长基因分别插入pET-22bf＋）表达载体,经过1mmol／L的IPTG在37℃下诱导3h,它们均获得了成功表达。耐盐性功能分析表明,3个基因对Ca^、Mg^2＋和Na^＋离子没有抗性,而在900mmol／L高浓度U离子的胁迫下与对照相比赋予菌株一定的U离子抗＋性。所以,我们初步推测这3个全长基因SRTG152-I、SRTG152-Ⅱ和SRTG152-Ⅲ是一类与U离子的抗性相关的基因。 相似文献
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针对目前国家对盐渍地开发利用的重大技术需求,选用8株具有农药潜力的海洋微生物菌株,以番茄为主要目标植物,在盐害胁迫下对海洋微生物诱导番茄植株抗盐活性及植物体内外的Na＋、K＋浓度平衡进行了研究。结果表明,4株海洋微生物菌株具有较明显的诱导植物抗盐和缓解盐害的作用,但表现各有差异,其中FC02菌株对发芽率、发芽指数诱导作用最为明显,发芽指数提高了38.3%,幼苗的株高、叶长、展开叶数、茎粗分别提高82.2%、66.7%、30.76%和50%,CAT酶活性最高为3.03U.mg-1.min-1FW,比对照提高了144.1%;YM菌株促使番茄幼苗叶绿素总含量增加的作用最大,比对照提高了88.9%;B9987菌株在使番茄幼苗丙二醛含量降低48.6%的同时,显著改善了植物体内的K＋、Na＋浓度平衡,K＋含量比对照提高了36.09%,Na＋比对照降低了39.5%。上述研究结果显示,一些海洋微生物菌株具有良好的诱导植物抗盐作用。 相似文献
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为确定以Na_2CO_3,和NaHCO_3为主要成分的苏打盐碱胁迫对甜高梁叶片结构及抗性影响,研究了盐碱胁迫下甜高粱品种314B和M-81E叶片结构与幼苗生理指标的变化。结果表明：针对应试的两个甜高粱品种,苏打盐碱胁迫可极显著减小叶片厚度、中脉厚度和最大导管直径,极显著增加叶片上下角质层及下表皮厚度（P〈0．01）。增加叶绿体中淀粉粒和嗜锇滴颗粒数,且发生叶绿体被膜和基质分离现象;使线粒体内膜上嵴数量减少,甚至消失。株高和茎基周长均比对照极显著减小,叶绿体色素极显著增加（P〈0．01）;叶片质膜相对透性和脯氨酸含量极显著升高,品种间丙二醛含量的变化差异较大。过氧化物酶（POD）活性和过氧化氢酶（CAT）活性均极显著升高,超氧化物歧化酶（SOD）的活性极显著降低（P〈0．01）。比较叶片结构和抗性生理指标变化可知,品种M-81E比314B抗盐碱性强。 相似文献
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为研究马铃薯蔗糖非发酵-1-型相关蛋白激酶-1基因StSnRK1对于调控植物耐盐性的促进作用,以过表达StSnRK1的烟草株系及野生型为试验材料,研究盐胁迫下StSnRK1对植株生长的影响。耐盐性鉴定结果表明,过表达StSnRK1基因显著提高烟草植株的耐盐性。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析显示,StSnRK1基因显著上调脯氨酸生物合成相关基因(吡咯琳-5-羧酸合酶NtP5CS)、胚胎发育后期丰富蛋白基因(NtLEA5)和活性氧清除系统相关基因(超氧化物歧化酶NtSOD和过氧化物酶NtPOD)。同时,转基因烟草植株的SOD活性、POD活性和脯氨酸含量显著高于野生型烟草植株,丙二醛(MDA)含量和过氧化氢(H2O2)含量显著低于野生型植株。由此可见,StSnRK1基因在改良植物耐盐性方面具有重要作用,为耐盐马铃薯生物技术育种提供了理论基础。 相似文献
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转玉米ZmMPK7基因烟草响应高盐胁迫的光合特性和抗氧化酶系统分析 总被引：2，自引：1，他引：1
以烟草NC89品种野生株系(WT)和转玉米ZmMPK7基因株系为材料,在NaCl胁迫条件下,对其光合特性和抗氧化酶活性进行分析,以探讨转ZmMPK7基因烟草的耐盐性。结果表明,随盐胁迫加重,转基因烟草植株比野生型具有更高的净光合速率(Pn)、PSⅡ最大光化学效率（Fv/Fm）和叶绿素含量（Chl）,并且转ZmMPK7基因株系能提高烟草叶片抗氧化酶活性,诱导抗氧化酶 (SOD、APX、CAT和POD)活性之间协调变化。与野生型相比,转基因烟草植株MDA含量及电解质外渗量较低,膜脂过氧化较轻,其耐盐性得到改善。 相似文献