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1.
【目的】 在黑曲霉（A.niger）中重组表达灵芝L菌漆酶基因，并对其发酵条件进行优化，旨在获得一株高产灵芝漆酶的黑曲霉基因工程菌。【方法】 从灵芝L菌克隆漆酶基因Lac-L，并根据黑曲霉密码子偏好性进行优化。选用黑曲霉糖化酶启动子（PglaA）、信号肽及终止子为表达原件，以米曲霉pyrG基因为筛选标记，构建漆酶表达盒，采用聚乙二醇-CaCl2法将其转化至黑曲霉X1（ΔpyrG）原生质体中。对转化子进行PCR验证及固态发酵酶活测定，筛选高产漆酶重组菌株，并对阳性转化子固态发酵培养基碳源、无机与有机氮源比例、Cu2+浓度及发酵时间进行优化。【结果】 经尿嘧啶缺陷及含2，2'-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2，2'-azinobis （3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid ammonium salt），ABTS）培养基筛选获得25株重组漆酶转化子，酶活复筛获得灵芝漆酶异源表达6号重组菌株，发酵72 h酶活可达3 532.6 U/kg，宿主菌株的酶活仅为58.37 U/kg。重组6号菌优化后的最适固态发酵条件为：以麸皮为基础培养基，添加2%麦芽糖、2%（NH4）2SO4、0.25 g/L CuSO4，发酵60 h时重组菌株产漆酶活力最高，达到6 255.47 U/kg。【结论】 在黑曲霉中成功实现灵芝L菌漆酶基因Lac-L的异源表达。 相似文献
2.
《饲料工业》2015,(13)
研究旨在克隆并表达嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)胞内具二硫键还原活性的酶蛋白。以Stenotrophomonas maltophilia基因组DNA为模板,扩增目的基因谷胱甘肽还原酶(Glr),构建重组质粒p ET-22b-Glr,并转化到表达菌株BL21(DE3)中得到重组菌,经IPTG诱导表达后,测定二硫键还原酶活性。结果表明,该重组酶基因大小为1 359 bp,酶活力为1.85 U/mg。酶学性质研究表明,重组谷胱甘肽还原酶的最适反应p H值为6.0,最适反应温度为40℃。对角蛋白酶K降解羽毛角蛋白的研究表明,该酶对其降解羽毛促进率为15%。结果揭示了Stenotrophomonas malto-philia胞内液具有促进胞外液角蛋白水解活性的内在机制。 相似文献
3.
一株高效木质素降解菌株LG-1的筛选、鉴定及酶活测定 总被引：1，自引：0，他引：1
《饲料工业》2016,(12)
试验筛选得到了一株对木质素具有较高降解作用的芽孢杆菌菌株LG-1。利用苯胺蓝平板脱色法从牛粪中初步筛选得到了14株降解菌株,利用管碟法复筛得到了1株对木质素降解活性较高的菌株LG-1,并对这株菌进行了菌落特征、菌体形态的观察及一系列生理生化试验和16S rDNA的序列测定,并对其产酶活性进行了测定。结果表明,菌株LG-1为一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),菌株LG-1在发酵60 h时,木质素过氧化酶达到1 773.3 U/l,锰过氧化酶达到610.8 U/l。对玉米秸秆发酵16 d后木质素降解率达到23.6%。枯草芽孢杆菌菌株LG-1是一株优良的木质素降解菌株。 相似文献
4.
木质素是农作物秸秆饲用化利用的主要限制因素,现仅有少数微生物产生木质素降解酶,且产量少、酶活低,不适合工业化生产,酶蛋白的高效异源表达是提高木质素降解酶产量的有效途径。工程菌ZHMX4和ZHQX1是分别从黄孢原毛平革菌和云芝栓孔菌中扩增出木质素过氧化物酶基因（lip）和漆酶基因（lac）,利用同源整合重组技术构建所得的工程菌。对前期构建的表达木质素降解酶工程菌ZHMX4和ZHQX1进行了部分生物学特性研究,包括木质素降解酶适宜反应条件、木质素降解酶基因拷贝数和工程菌降解天然木质素能力的测定及工程菌营养需要分析,了解2株工程菌特性的同时为后续研究工作奠定基础。结果显示：工程菌ZHMX4和ZHQX1产木质素降解酶最适反应温度和pH分别为30℃、3.0和30℃、4.5;2株工程菌各2 m L（添加量为109cfu/g）混合对100 g玉米秸秆进行发酵时,木质素的降解率达到50.12%;根据Biolog YT微孔板试验结果,可优化2株工程菌的培养基,在培养基中添加一些营养物质,可促进工程菌的生长。 相似文献
5.
生长激素与其靶细胞膜表面的生长激素受体(GHR)结合,可以促进动物生长发育和调节新陈代谢。为获得鸡GHR蛋白,试验通过PCR扩增获得GHR胞外区序列。经双酶切后连接入原核p ET-32a(+)表达载体,构建了鸡GHR胞外结构域的原核表达载体。将该重组质粒转入E. coli BL21(ED3)表达菌株。通过IPTG诱导其表达GHR重组蛋白,并探讨不同IPTG浓度、诱导时间和诱导温度等条件对鸡GHR重组蛋白表达的影响。结果表明:诱导GHR重组蛋白表达的最适条件为IPTG终浓度2.00 mmol/L、诱导时间为4 h、培养温度为37℃,在此条件下,GHR重组蛋白表达量最高。研究结果为后续GHR抗体制备奠定了基础。 相似文献
6.
为了实现牛支原体p30蛋白在大肠杆菌中的高效表达,试验根据GenBank发表的p30(登录号为AIA33998.1)基因序列,在不改变p30蛋白氨基酸序列的情况下优化基因序列,全基因合成p30基因,并将其克隆到pET28a(+)载体中,构建的重组质粒pET28a(+)-p30转化至BL21(DE3)工程菌中进行诱导表达,筛选重组菌pET28a(+)-p30/BL21(DE3)诱导表达的最适诱导温度、诱导时间及IPTG诱导浓度,利用His-tag镍柱纯化p30重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行鉴定。结果表明:当重组菌株pET28a(+)-p30/BL21(DE3)诱导条件为37℃、IPTG浓度为0.1 mmol/L、诱导4 h时,p30蛋白表达量最高;SDS-PAGE电泳显示经镍柱纯化后p30蛋白达到了电泳纯,经Western-blot分析,目的蛋白具有抗原特异性,在36 ku处有明显的蛋白印迹条带,与预期大小相符。说明成功实现了在大肠杆菌中高效表达牛支原体p30重组蛋白。 相似文献
7.
《畜牧与兽医》2017,(9):83-87
为获得体外表达的25型蓝舌病病毒(BTV)VP2蛋白,本研究以NCBI上发表的25型BTV L2基因序列为模版,设计3对引物,PCR扩增3段部分重叠基因。将3段基因克隆到原核表达载体p ET-28a(+)中,构建重组质粒。以1.0 mmol/L的IPTG诱导含有阳性质粒的重组菌p ET-28a(+)-VP2-A/BL21、p ET-28a(+)-VP2-B/BL21、p ET-28a(+)-VP2-C/BL21进行表达,获得3段VP2蛋白,分别命名为VP2-A、VP2-B、VP2-C。经SDS-PAGE鉴定结果表明,重组蛋白以包涵体形式表达,大小依次为50 ku、48 ku、48 ku,与预期蛋白大小一致。经Western blot分析,VP2-A、VP2-B、VP2-C与His-Tag单抗发生特异性结合,证明其具有较好的反应原性。25型蓝舌病病毒VP2蛋白的分段表达为VP2蛋白的功能研究和制备蓝舌病的诊断试剂奠定了基础。 相似文献
8.
本试验旨在研究β-1,3-1,4葡聚糖酶双拷贝基因毕赤酵母工程菌株的构建及发酵。首先,通过对质粒pGAP-glu-opt进行PCR扩增获得密码子优化的β-1,3-1,4葡聚糖酶基因glu-opt,用EcoR I和Not I双酶切后与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,获得重组质粒p9K-glu-opt。该重组质粒经Sac I线性化后转化毕赤酵母GS115菌株,利用不含组氨酸的MDS平板和摇瓶培养,筛选重组菌株,命名为GS115/9K-glu-opt。制备GS115/9K-glu-opt感受态细胞,再用线性化的重组质粒pPIC-glu-opt二次转化,在含有抗生素Zeocin的YPDS平板上筛选glu-opt基因双拷贝重组菌株GS115/2xglu-opt。双拷贝重组菌在10 L发酵罐中进行高密度发酵培养及甲醇诱导表达,β-1,3-1,4葡聚糖酶最高酶活达到21 600 U/mL,约为单拷贝工程菌株X33/pPIC-glu-opt发酵活力的1.44倍;蛋白表达量达8.4 g/L,约为X33/pPIC-glu-opt的1.68倍。 相似文献
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10.
《饲料研究》2016,(10)
利用甲醇营养型毕赤酵母对柞蚕溶菌酶进行高效重组表达。首先根据毕赤酵母密码子偏爱性对柞蚕溶菌酶成熟肽基因进行密码子优化,将优化后的基因序列ApLyz克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA中,构建重组表达载体pPICZαA-ApLyz。重组载体经电转化整合入毕赤酵母菌株GS115基因组中,并利用高质量浓度Zeocin(500μg/mL)抗性平板筛选得到高拷贝转化子。摇瓶发酵显示,甲醇诱导72 h后,高拷贝菌株发酵液中溶菌酶活性为450 U/mL(313 U/mg总蛋白),酶活约为单拷贝菌株的3.1倍。纯化后的重组柞蚕溶菌酶分子质量约14 kDa,酶活为3 870 U/mL,比酶活为20 262 U/mg。酶学性质分析显示,重组柞蚕溶菌酶的最适反应温度为40℃,最适反应pH为4.5,具有较好的热稳定性。 相似文献