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复制缺陷型慢病毒载体法高效制作转基因家禽 总被引：2，自引：0，他引：2
基于慢病毒的第三代复制缺陷型载体由于可侵染分化及未分化细胞，在细胞增殖、分化中没有转录沉默现象，且高效整合，具有高安全性，因而倍受关注。在我们以绿色荧光蛋白（GFP）为标记基因，用慢病毒载体制作转基因鸡，PCR检测显示有67%的个体为转基因阳性，其中2只可从活体体表直接发现较强的绿色荧光信号。 相似文献
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随着生物制药业的迅速发展,转基因鸡已逐渐成为生物领域研究的热点之一。为建立和优化逆转录病毒法制备转基因鸡技术平台,以pHIT-Myc3为载体,以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为标记基因,采用共转染法包装泛嗜性VSV-G假逆转录病毒,浓缩后分别体外侵染鸡胚胎成肌细胞和体内胚盘下腔接种新生种蛋并孵化出雏。分别抽提成肌细胞、孵化5d的全胚和新生雏鸡不同脏器的基因组DNA进行PCR鉴定分析,结果分别在细胞和5d全胚胎及新生雏鸡的胸腺和皮肤中检测到了标记基因EGFP的存在,表明逆转录病毒法成功制备出转基因鸡,同时转基因鸡技术平台中的方法技术条件也得到了有效优化,为转基因鸡的进一步研究提供参考。 相似文献
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《吉林农业科学》2014,(4):50-53
为利用核移植法获取转基因克隆猪提供供体细胞,体外分离培养猪胎儿成纤维细胞并进行了绿色荧光蛋白基因转染。首先采用组织块贴壁法分离培养猪胎儿成纤维细胞,绿色荧光蛋白表达载体以脂质法介导转染猪胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,利用荧光显微镜检测荧光蛋白的表达。结果表明,组织块贴壁后9 d可获取原代成纤维细胞,基因转染后利用G418筛选9 d即可获得转基因细胞,对转基因细胞进行传代,PCR检测显示荧光蛋白基因整合到细胞基因组中,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,为下一步通过核移植方法获得转基因猪提供了基础。 相似文献
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曾培育出我国首例成体体细胞。克隆”东北民猪的东北农业大学教授刘忠华带领的课题组，2006年12月22日又成功培育出国内首例绿色荧光蛋白“转基因”克隆猪，这是世界上继美国、韩国．日本之后第4例绿色荧光蛋白转基因猪。 相似文献
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[目的]探索利用慢病毒生产转基因鸡的适宜方法。[方法]以增强型绿色荧光蛋白为报告基因构建慢病毒载体,包装病毒后感染鸡早期受精卵,并检测不同注射操作和不同接种滴度对鸡胚存活率的影响,同时对接种病毒鸡胚的GFP表达情况进行检测。[结果]采用105、106和107IU/ml的慢病毒滴度,鸡胚孵化率分别为87%、72%和66.7%。以雏鸡血液基因组为模板PCR鉴定转基因阳性率为45.5%;冰冻切片技术发现GFP基因在鸡体内不同组织的表达强度差异显著,免疫系统内表达最强,生殖系统和肌肉组织中GFP基因无表达。[结论]试验初步筛选出较适宜的慢病毒感染滴度,该结果为研制蛋鸡生物反应器和转基因鸡抗病新品系奠定了基础。 相似文献
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慢病毒法生产转基因鸡的初步研究(英文) 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]探索利用慢病毒生产转基因鸡的适宜方法。[方法]以增强型绿色荧光蛋白为报告基因构建慢病毒载体,包装病毒后感染鸡早期受精卵,并检测不同注射操作和不同接种滴度对鸡胚存活率的影响,同时对接种病毒鸡胚的GFP表达情况进行检测。[结果]采用105、106和107IU/ml的慢病毒滴度,鸡胚孵化率分别为87%、72%和66.7%。以雏鸡血液基因组为模板PCR鉴定转基因阳性率为45.5%;冰冻切片检测技术发现GFP基因在鸡体内不同组织的表达强度差异显著,免疫系统内表达最强,生殖系统和肌肉组织中GFP基因无表达。[结论]试验初步筛选出较适宜的慢病毒感染滴度,该结果为研制蛋鸡生物反应器和转基因鸡抗病新品系奠定了基础。 相似文献
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【目的】采用睾丸注射慢病毒的方法生产转基因鸡以提高转基因效率,使转基因鸡的批量生产变得简单可行。【方法】用磷酸钙沉淀法包装慢病毒,对慢病毒包装体系中的质粒总量和HN Buffer的pH值进行优化,以包装出滴度较高的慢病毒;然后将慢病毒注射到受精鸡蛋的胚胎中验证其活性;最后,将慢病毒注射到8日龄公鸡的睾丸内,待其性成熟以后,将精液DNA呈阳性的公鸡与非转基因母鸡进行交配生产出转基因鸡。【结果】当90mm培养皿中质粒总量为50μg、HN Buffer的pH值为7.05时慢病毒的包装效率最高,在该条件下包装出的慢病毒滴度高达7.5×107 TU/mL;采用慢病毒胚胎注射途径成功地生产出增强绿色荧光蛋白(enhanced Green Fluorescent Protein,eGFP)转基因鸡;采用慢病毒睾丸注射途径生产的转基因鸡后代中能检测到eGFP目的基因,但未检测到其相关的表达。【结论】慢病毒睾丸注射途径能够将外源基因整合到精原干细胞中,并遗传给后代。 相似文献
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探索建立一种用绿色荧光蛋白对鸡原始生殖细胞进行标记分离的方法.克隆并测序鸡原始生殖细胞特异表达基因cvh1.6kb启动子序列.序列分析表明它含有类似于TATAbox和CAATbox的元件,在其远端上游区域还有多个GC富含区.将cvh基因启动子亚克隆到绿色荧光蛋白表达栽pegfp-1的多克隆位点,成功构建表达栽体pcvh-egfp.重组质粒在脂质体Lipofectamine<''TM>2000介导下分别转染鸡X期胚盘细胞和鸡胚成纤维细胞,并于转染后12h在荧光显微镜下观察转染效果.实验结果显示:在胚盘细胞转染后12h可观测到绿色荧光表达,转染后24h荧光细胞增多,细胞形态均呈圆形、体积较大;在鸡胚成纤维细胞未检测到gfp表达.实验结果说明,由cvh基因启动子控制下的gfp可在X期胚盘细胞特异表达,为利用流式分离技术PGCs标记分离、纯化研究奠定基础. 相似文献
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【目的】从表达M2e-EYFP融合蛋白转基因柔嫩艾美耳球虫的稳定性,及其在环境中的传播能力、竞争能力和存活能力方面,分析转基因球虫对生态环境的潜在风险。【方法】稳定性试验包括:转基因球虫感染非靶动物,观察临床症状和卵囊产出情况;转基因球虫继代繁殖,检测荧光率;转基因球虫与毒害艾美耳球虫混合感染,PCR检测卵囊中的外源基因。传播能力试验主要是分析感染鸡和不感染同居鸡的卵囊产量和荧光率。竞争性试验则是用不同混合比例的2种球虫感染鸡,检测卵囊产量和荧光率;存活能力试验是用不同处理方式的卵囊感染鸡,检测卵囊是否产出以分析卵囊存活能力。【结果】转基因球虫不感染小鼠和家鸽,与野生型柔嫩艾美耳球虫宿主特异性相同;连续繁殖传17代后外源基因稳定表达。与毒害艾美耳球虫混合寄生时在异种球虫体内未检测出外源基因。传播能力试验中,46d攻毒时转基因球虫感染与不感染同居组的卵囊产量差异不显著,但与不感染对照组相比均显著减少,且1∶1感染和不感染同居组卵囊荧光率检测结果维持在51.6%67.9%。竟争性试验中,攻毒时各比例感染组卵囊产量均极显著少于不感染攻毒对照组,荧光率检测结果各比例组变化幅动不大,且1∶1组哨兵鸡卵囊荧光率检测结果为41.2%61%。存活能力试验,转基因球虫与野生型球虫在夏季室温条件下均不能存活90d,且与其他不同方式处理的卵囊外界存活时间接近。【结论】说明转基因球虫具有良好的稳定性,在环境中的传播能力、竞争能力和存活能力未呈现显著优于野生球虫的趋势。 相似文献
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慢病毒载体介导外源基因在不同细胞及鸡体不同组织中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为标记基因构建复制缺陷型慢病毒载体生产病毒,以病毒感染不同来源、不同分化特征的细胞,并进行鸡囊胚注射,观测外源基因的表达情况。试验结果表明,在所有类型细胞中均可检测到EGFP较高水平的表达,其中在HeLa、293FT细胞中的转染效率约1×10^8TU·mL^-1（TU：转染单位）,在C127细胞中为5×10^7TU·mL^-1,在鸡胚胎成纤维细胞（CEF）中约为1×10^6TU·mL^-1,病毒在鸡原生殖细胞（cPGC）中转染效率最低为1×10^2TU·mL^-1。病毒的感染可引起细胞表型的不利改变。用该病毒载体注射鸡囊胚获得了可直接活体观察绿色荧光信号的转基因鸡,转基因效率约53％;外源基因在鸡体不同组织如表皮、消化道等器官中检测到不同水平的表达,并表现出不同的分布特征。 相似文献
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将鸡Igλ轻链信号肽与pEGFP-C1载体的绿色荧光蛋白N端融合产生带有信号肽的中间载体pEGFP-C1-SP,通过对鸡Igλ轻链基因的定向克隆,构建了带有纯化标签的鸡Igλ轻链绿色荧光蛋白真核表达载体.转染COS7细胞后,荧光显微镜观察及Western blotting检测均证明融合蛋白在COS7细胞的分泌表达. 相似文献
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分别将鸡Igλ轻链信号肽、小鼠纤溶酶原信号肽与pEGFP-C1载体的绿色荧光蛋白N端融合,产生带有信号肽的中间载体pEGFP-SPc和pEGFP-SPm。对鸡Igλ轻链基因的定向克隆,构建了带有纯化标签的鸡Igλ轻链绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-SPc-λ和pEGFP-SPm-λ。转染COS7细胞后,荧光显微镜观察及Western blotting检测融合蛋白的分泌表达,结果显示,鸡Igλ轻链信号肽能引导鸡Igλ轻链绿色荧光蛋白融合分子的分泌表达;而小鼠纤溶酶原信号肽不具备引导该重组蛋白分泌表达的功能。表明信号肽在蛋白分泌表达中的关键作用,重组蛋白的分泌表达要选择合适的信号肽。 相似文献
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[目的]为建立稳定、高效的绿色荧光蛋白转基因小鼠超数排卵技术提供依据。[方法]将30只5~8周龄的绿色荧光蛋白转基因小鼠随机平均分成3组,分别腹腔注射5、7.5、10 IU的PMSG,48 h后腹腔注射7.5 IU的HCG,比较不同剂量PMSG对绿色荧光蛋白转基因小鼠超数排卵效果的影响。[结果]PMSG剂量为7.5 IU处理组获得的胚胎数明显高于PMSG剂量为5、10 IU处理组,且差异显著(P<0.05)。PMSG剂量为5、7.5、10 IU处理组的小鼠见栓率分别为70%、80%、90%,处理间差异不显著(P>0.05)。随着PMSG剂量的加大,小鼠的子宫充血程度和卵巢体积逐渐增大。[结论]绿色荧光蛋白转基因小鼠超数排卵技术中所用PMSG的最佳剂量为7.5 IU。 相似文献
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随着生物制药业的迅速发展,转基因鸡输卵管生物反应器正逐渐成为人们关注的焦点,转基因鸡以其卓越的优势必将成为科学研究的热点和生物制药领域的新兴产业之一。目前,转基因鸡最成功的制备方法即逆转录病毒介导法,并已成功制备出表达标记基因的转基因鸡。通过综述鸡作为生物反应器的优势、转基因鸡发展历程、逆转录病毒载体制备转基因鸡的方法过程和转基因鸡的研究进展,同时也讨论了转基因鸡的意义和可能存在问题。 相似文献
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李建平 《山西农业:致富科技版》2008,(1):49
本刊讯 从东北农业大学获悉,我国首例绿色荧光蛋白转基因克隆猪日前成功产下2头具有绿色荧光遗传特征的小猪。有关专家称,这次试验的成功标志着我国通过体细胞核移植技术生产转基因猪已经发展成熟。 相似文献
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制备转基因小鼠特有的DIG标记探针，应用染色体荧光原位杂交（FISH）技术，对转基因小鼠外周血细胞的遗传性状进行分析，检测其合子类型，以挑选纯合子小鼠用于保种。结果杂合型小鼠61％的细胞有一个荧光信号，而纯合型小鼠约24％的细胞有两个荧光信号，48％的细胞有一个荧光信号，野生型小鼠无荧光信号。因此染色体荧光原位杂交技术可作为检测转基因小鼠遗传特性的一种方法。 相似文献