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丝毛乌骨鸡胸肌和肝脏cDNA文库的构建与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
了解肌肉组织和肝脏组织的基因类型,构建鸡肌肉组织和肝脏组织的功能基因表达谱在动物遗传育种中具有重要的意义.为比较基因组学的研究、功能基因组学的研究、QTLs定位等的动物分子育种做前期基础科研工作,研究以丝毛乌骨鸡(Gallus gallus)的胸肌和肝脏为实验材料,以Lambda ZAPⅡ为载体,构建了胸肌和肝脏的cDNA文库.同时,对这两个cDNA文库进行了噬菌体PCR鉴定和所提质粒的EcoRⅠ和XhoⅠ的双酶切鉴定.结果表明,胸肌和肝脏mRNA的OD260/OD280分别为1.92和1.90.胸肌cDNA文库的滴度在3.6× 107 pfu/mL以上,重组率92%以上,插入片段平均大于1.5 kb.肝脏cDNA文库的滴度在3.4× 107pfu/mL以上,重组率90%以上,插入片段平均大于1.4kb. 相似文献
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华东葡萄白河-35-1株系抗霜霉病基因cDNA文库构建及EST分析 总被引：1，自引：0，他引：1
以中国原产抗霜霉病葡萄野生种华东葡萄（Vitis pseudoreticulata）白河-35-1为材料,用SMARTTM技术构建葡萄霜霉菌（Plasmopara viticola）诱导的葡萄叶片cDNA文库。经检测,原始文库滴度0.92×106 pfu/mL,重组率97%,插入片段500～2 200 bp,扩增文库滴度为5×109 pfu/mL。随机挑取克隆5'端测序,获得254条有效EST序列（GenBank登录号：FG269201~FG269449和FG396006~FG396010）。经BlastX分析,有56.3% ESTs与GenBank中功能已知基因有较高同源性,14.6%ESTs与功能尚未确定的假设蛋白或未知蛋白同源性很高,20.9%ESTs在GenBank中无匹配的同源产物。 相似文献
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采用人工土壤法，研究重金属镉(Cd2+)对成熟赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）的急性毒性,表明蚯蚓对镉具有较强的耐受性。Trizol法提取蚯蚓RNA后，采用Clontech公司的CreatorTM SMARTTM cDNA文库构建试剂盒，成功构建了低剂量Cd2+（200 mg•kg-1）诱导的蚯蚓cDNA文库，其库容量为3.02×105 pfu/mL,扩增后滴度为8.67×109 pfu/mL，重组率为97.3％, 绝大多数的cDNA插入片段≥0•5 kb,平均长度≈1•0 kb。所够建的cDNA质粒文库容量及插入片段大小符合合格文库要求, 为进一步筛选蚯蚓体内解毒、免疫相关基因，寻找生物标志物奠定了基础。 相似文献
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摘要：了解肌肉组织和肝脏组织的基因类型，构建鸡肌肉组织和肝脏组织的功能基因表达谱在动物遗传育种中具有重要的意义。为比较基因组学的研究、功能基因组学的研究、QTLs定位等的动物分子育种做前期基础科研工作，研究以丝毛乌骨鸡(Gallus gallus )的胸肌和肝脏为实验材料，以Lambda ZAPⅡ为载体，构建了胸肌和肝脏的cDNA文库。同时，对这两个cDNA文库进行了噬菌体PCR鉴定和所提质粒的Eco RⅠ和XhoⅠ的双酶切鉴定。结果表明，胸肌和肝脏mRNA的OD260/OD280 分别为1.92和1.90。胸肌cDNA文库的滴度在3.6× 107 pfu/mL以上，重组率92%以上，插入片段平均大于1.5 kb。肝脏cDNA文库的滴度在3.4× 107 pfu/mL以上，重组率90%以上，插入片段平均大于1.4 kb。 相似文献
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从广西巴马小型猪的卵巢中提取总RNA，并以其为模板，应用逆转录一聚合酶链式反应(RT—PCR)，在合成的特异性引物引导下，扩增得到巴马小型猪卵泡抑素(Follistatin) cDNA的全序列，长度为1035bp。该扩增片段经纯化后，连接到pMD18-T载体上扩增。经序列分析结果表明，本研究中克隆的猪卵泡抑素cDNA序列与GeneBank中已报道的家猪卵泡抑素同源性高达99．4％，与奶牛、家鼠、挪威鼠和马等其他物种的卵泡抑素cDNA序列间同源性也大于89％。 相似文献
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两轮多重反转录巢式PCR方法扩增全长GalUR基因 总被引：2，自引：0，他引：2
研究了两轮多重反转录巢式PCR扩增全长基因的方法.先用多重巢式引物和cDNA进行第1轮PCR扩增;再用纯化的第1轮PCR产物和相同的引物进行第2轮扩增;最后通过改变Mg^2＋浓度、退火时间和退火温度进行PCR条件的优化,以增加PCR扩增的产量,用于克隆.结果显示该方法方便和快速地扩增出了草莓（Fragaria ananassa cv.SweatCharlie）高产量和高质量的全长GalUR基因,也非常快速地扩增出了用于基因构建的带有酶切位点的全长GalUR基因.该方法也可以用于其它全长基因的克隆. 相似文献
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质粒制备绝对定量PCR标准曲线方法的建立 总被引：7，自引：2，他引：5
用质粒制备绝对定量PCR标准曲线存在着作为标准品的双链环状质粒分子与待测样品单链线性cDNA分子结构不一致的问题.为了消除二者之间的差异,确保绝对定量PCR测定方法的准确性,我们在用质粒制备标准曲线和测定未知样品中特定基因mRNA分子拷贝数时进行了两个改进:1)用酶切的方法使环状质粒线性化,用线性质粒制备标准曲线;2)将未知样品cDNA扩增出一条正义链,再与作为标准曲线的质粒标准品同时开始荧光定量PCR循环.实验结果表明,1)具有相同拷贝数的环状和线性质粒在一起进行定量PCR测定时,环状质粒所得的Ct值大于线性质粒所得的Ct值(P＜0.05);2)本研究测定的cDNA样品中先扩增一次测出的起始拷贝数均大于未先扩增一次的测定结果.样品起始拷贝数两次测定结果的差异分析表明5个样品中有3个样品的测定差异达到了显著水平(P＜0.05).应用该方法改进的鸡GATA5基因绝对定量PCR的标准曲线能够准确地反应目的产物扩增.经改进的质粒制备绝对定量PCR标准曲线的方法更为简便易行,并提高了测定的准确性. 相似文献
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GDA2基因的克隆、原核表达与融合蛋白的纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
摘要：GDA2（G2 pea dark accumulated gene）是与G2豌豆（Pisum sativum L.）短日照条件下不衰老现象紧密相关的基因之一。实验用cDNA差示分析法（representational difference analysis, RDA）得到一个短日照下特异表达的G2豌豆cDNA，并命名为 GDA2。核酸序列分析表明，该cDNA全长1 120 bp，最大的开放阅读框为642 bp，编码一个由213个氨基酸构成的分子量约为24 kD的蛋白质，与GDA1的同源性为36%。在GDA2的cDNA两端分别引入Bgl Ⅱ与XhoⅠ的酶切位点，用PCR方法将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中，经过酶切筛选和测序鉴定，得到所需的表达载体pGEX-GDA2。将pGEX-GDA2导入E.coli BL21菌株，经IPTG诱导，得到分子量约51 kD的 GST-GDA2融合蛋白，并利用Glutathione Sepharose 4B亲和柱对该融合蛋白加以纯化。GDA2-GST融合蛋白的表达和纯化工作，为深入研究GDA2蛋白的结构与功能以及该基因同衰老的关系打下良好的基础。 相似文献
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应用反向斑点杂交技术从转录序列的选择性捕获中筛选副猪嗜血杆菌表达差异基因 总被引：1，自引：1，他引：0
通过对靶DNA的种类和浓度、探针浓度、紫外交联时间等反向斑点杂交条件优化,建立了一种从选择性捕获的转录序列（selective capture of transcribed sequences,SCOTS）库中筛选副猪嗜血杆菌在体内、外差异表达的基因的方法。通过反向斑点杂交技术从10个样品中筛选出的6个样品被证明是副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）在体内上调表达或者是特异表达的基因。结果表明：SCOTS技术能够有效地获得一个可能存在差异表达基因的cDNA文库,而反向斑点杂交技术可以有效地从中筛选到差异表达基因。 相似文献
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