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1.
【目的】流感病毒是一种人兽共患病原,常引起大流行,给人类健康造成巨大威胁,且流感病毒易发生变异,能不断逃逸宿主细胞的免疫反应,对现有抗流感药物产生耐药性,因此寻找抵抗流感的新方法迫在眉睫。研究通过探索NMRAL1(NmrA-like family domain-containing protein 1)对流感病毒复制的影响,并揭示其发挥作用的分子机制,为抗流感药物研发提供潜在靶点。【方法】采用siRNA干扰技术在A549细胞中下调表达NMRAL1,并通过Western Blot检测siRNA干扰后NMRAL1的表达水平;在下调表达NMRAL1的细胞中,分别感染A/Anhui/2/2005 (AH05) (H5N1)和A/WSN/33 (H1N1) 两株不同亚型流感病毒,利用蚀斑试验检测感染病毒后24和48 h细胞上清中的病毒滴度。为确定NMRAL1影响流感病毒复制的具体阶段,在HEK293T细胞中瞬时转染NMRAL1-Myc-pCAGGS质粒过表达NMRAL1,通过双荧光素酶报告系统检测过表达NMRAL1对流感病毒聚合酶活性的影响;使用免疫荧光技术对流感病毒NP蛋白进行染色,通过激光共聚焦试验观察下调表达NMRAL1对感染病毒后3、4、5、6和8 h NP蛋白在被感染细胞中的定位情况的影响,判断下调表达NMRAL1是否影响流感病毒的入核和出核过程;利用Western Blot检测下调表达NMRAL1对流感病毒各病毒蛋白表达的影响和对流感病毒激活I型干扰素通路下游IFN刺激基因（ISGs）表达的影响,利用间接免疫荧光试验进一步研究NMRAL1对流感病毒复制的影响。【结果】Western Blot检测发现NMRAL1 siRNA能显著下调NMRAL1表达,在下调表达NMRAL1的A549细胞中分别感染H5N1和H1N1病毒,并通过蚀斑试验检测感染病毒后细胞上清中的病毒滴度,结果显示在下调表达NMRAL1的细胞中,感染流感病毒后24和48 h收取的细胞上清中病毒滴度显著下降,表明NMRAL1能促进不同亚型流感病毒的复制;为进一步探索NMRAL1调控流感病毒复制的具体机制,利用双荧光素酶报告系统检测流感病毒聚合酶活性,发现过表达NMRAL1对流感病毒聚合酶活性无明显影响;激光共聚焦试验结果显示下调NMRAL1表达不影响NP蛋白的入核和出核过程,同时Western Blot检测表明下调NMRAL1表达不影响各病毒蛋白的表达;但荧光定量PCR试验结果显示下调NMRAL1表达能够促进流感病毒感染诱导的IFN-β mRNA水平上升,且Western Blot检测发现下调表达NMRAL1促进I型干扰素通路下游的MxA和IFITM3抗病毒蛋白的表达,与此同时,间接免疫荧光试验结果显示下调NMRAL1表达可显著抑制流感病毒复制。【结论】在流感病毒感染过程中,NMRAL1不影响流感病毒的入侵以及转录翻译过程,而是通过抑制I型干扰素通路激活从而抑制MxA、IFITM3等抗病毒因子的表达,最终促进流感病毒复制。研究证实宿主因子NMRAL1正调控流感病毒的复制,丰富了参与流感病毒复制的宿主因子网络。 相似文献
2.
为研究宿主细胞核糖体蛋白L12(RPL12)在猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respir-atory syndrome virus,PRRSV)复制中的作用,本研究通过荧光定量PCR和Western-blotting等方法,检测了PRRSV感染对Marc-145细胞中RPL12表达的影响,以及过表达或敲减RPL12对PRRSV复制的影响.结果显示,PRRSV感染可上调Marc-145细胞中RPL12基因的表达.过表达RPL12可促进PRRSV的复制,而敲减RPL12可抑制PRRSV的复制.通过免疫共沉淀和共聚焦显微镜检测,进一步研究发现RPL12蛋白与PRRSV GP2b蛋白存在相互作用,并共定位于细胞质中.本研究首次发现了宿主蛋白RPL12能够促进PRRSV复制,并与PRRSV GP2b蛋白存在相互作用,为进一步研究PRRSV的感染与复制机制以及与宿主的相互作用提供了新的切入点,为抗病毒药物的研发提供了有益的探索. 相似文献
3.
【目的】为探明JEV病毒复制与宿主蛋白的关系。【方法】首先构建非结构蛋白质粒,然后将构建成功的非结构蛋白的质粒转染至Vero细胞中,24 h在荧光显微镜下观察蛋白表达情况,再分别与pCMV-MYC-hnRNP K质粒同时转染至Vero细胞中,培养24 h,收取细胞蛋白样,进行Co-IP试验相关步骤,用Western-blot实验进行结果呈现,得出试验结果。【结果】构建的非结构蛋白质粒在Vero细胞中可以表达,通过与表达hnRNP K蛋白的质粒共转染,通过Co-IP试验经Western-blot结果分析能够得出JEV的NS1与hnRNP K之间存在相互作用,JEV的NS2a、NS3、NS5与宿主hnRNP K之间不存在相互作用。【结论】JEV的NS1蛋白与宿主蛋白hnRNP K存在相互作用,为JEV非结构蛋白的研究进一步拓宽了思路,同时为JEV病毒在宿主细胞中的生命活动周期的研究提供了基础,为深入研究JEV病毒复制提供了新方向。 相似文献
4.
为研究与猪瘟病毒NS3蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,采用PCR方法获得NS3基因,将其定向克隆至pCMV-Myc真核表达载体,经酶切鉴定及序列测定分析,将鉴定为阳性重组表达质粒命名为pMycNS3。采用脂质体介导法将pMyc-NS3转染至PK-15细胞和293T细胞,Western blot和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达。结果表明,成功构建重组表达质粒pMyc-NS3,Western blot表明,NS3蛋白在PK-15细胞和293T细胞中均得到表达,NS3在PK-15和293T细胞质中呈弥散性分布。说明,成功构建的猪瘟病毒NS3基因与Myc融合表达质粒,为验证NS3蛋白与宿主细胞蛋白相互作用奠定基础。 相似文献
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猪瘟病毒蛋白NS3被认为与培养细胞发生病变存在紧密联系,为了进一步探讨NS3蛋白单独作用及其表达水平对培养细胞CPE发生的影响,本研究构建了2种携带NS3基因的真核表达载体,分别在牛源细胞MDBK中表达NS3蛋白,利用荧光显微镜观察宿主细胞形态学变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western-blot检测目的蛋白表达情况。研究结果表明,2种载体均在MDBK中成功表达NS3蛋白;其中pCD-NA3.1-NS3质粒所表达的目的蛋白量较大,并使宿主细胞表现出明显的形态学变化;细胞凋亡检测结果表明NS3蛋白大量表达的宿主细胞凋亡率显著高于对照组。猪瘟NS3蛋白可以不需要猪瘟病毒其他蛋白的参与,具有直接造成宿主细胞发生病变的能力,但较低的蛋白存在水平并不能对宿主细胞造成可检测的损伤,推测活体内若能有效干扰瘟病毒NS3蛋白的产生或其功能可能会降低猪瘟或牛病毒性腹泻-黏膜病的发病率或使临床表现减轻。 相似文献
6.
为阐明甘加型藏羊(Ovis arise)发情周期下丘脑-垂体-卵巢(hypothalamic-pituitary-ovarian axis, HPO)轴中雌激素受体β(estrogen receptor β,ERβ)mRNA和蛋白的表达及分布,本试验选取健康且在发情周期内的甘加型藏羊32只,运用qRT-PCR、Western blot 技术和免疫组织化学染色法检测甘加型藏羊发情周期ERβ mRNA及蛋白在HPO轴中的表达和分布差异。结果显示,甘加型藏羊整个发情周期(发情前期、发情期、发情后期及间情期)ERβ mRNA及其蛋白在HPO轴中均有表达和分布。下丘脑中ERβ mRNA及其蛋白在下丘脑中发情前期表达最多,显著高于其他3个时期(P<0.05);垂体中ERβ mRNA及蛋白均在发情前期表达最高,与其他3个时期差异显著(P<0.05);在卵巢中间情期表达最高,显著高于其他3个时期(P<0.05)。免疫组织化学染色结果显示,ERβ阳性表达主要分布在下丘脑大神经元胞体和轴突中;在垂体中多分布在远侧部及中间部嗜酸性细胞胞浆中,胞核中分布较少;在卵巢中,生长卵泡颗粒细胞胞浆和胞核、卵泡内膜细胞及黄体细胞胞浆中均有分布。ERβ mRNA及其蛋白在甘加型藏羊发情周期HPO轴的差异性表达表明雌激素受体β参与调节甘加型藏羊的生殖生理活动。 相似文献
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[目的]探究猪ESD蛋白的抗病毒功能,通过构建猪ESD真核表达质粒,研究其是否能够抑制口蹄疫病毒在PK-15细胞中的复制。[方法]从PK-15细胞中提取总RNA,反转录为c DNA,PCR扩增出猪的ESD基因,构建到pc DNATM3.1/Myc-His A真核表达载体上。通过Western blotting和实时定量PCR检测ESD蛋白的表达情况及其抗病毒功能。[结果]获得了猪ESD真核表达载体,转染后能够正常表达。FMDV感染PK-15细胞后,ESD转录水平显著上调;过表达ESD蛋白显著抑制FMDV的复制;下调表达ESD蛋白显著促进FMDV的复制。[结论]猪ESD蛋白能够抑制FMDV在PK-15细胞中的复制。 相似文献
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试验旨在克隆表达羊口疮病毒安徽株023基因,对该基因进行PCR扩增、亚克隆及表达,通过蛋白表达纯化后进行SDS-PAGE和Western blot鉴定,并利用生物信息学软件预测该基因编码的蛋白的理化性质、二级结构、信号肽、跨膜结构域等。结果显示,023基因全长819 bp,编码272个氨基酸,蛋白大小约为42 ku,主要以包涵体的形式表达且有良好的反应原性。生物信息学分析表明,该蛋白是亲水稳定蛋白,其中α-螺旋(h)占27.57%,延伸链(e)占17.28%,β-转角(t)占12.13%,无规则卷曲(c)占43.01%,无信号肽区域和跨膜结构域,可能存在30个磷酸化位点,4个B细胞抗原表位,3个CTL表位和3个Th表位。研究结果不仅有助于了解羊口疮病毒023基因的结构与功能,还能为建立快速诊断的检测方法提供参考。 相似文献
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为了研究新型鸭呼肠孤病毒(new-type duck reovirus,NDRV)在鸡胚成纤维细胞DF-1中的增殖特性,将NDRV JDM10毒株接种到DF-1细胞,连续传代后,通过观察病毒对细胞的致病变效应,测定半数组织感染量(TCID50)、RT-PCR检测、间接免疫荧光(IFA)及Western-blot免疫学检测,探索NDRV对DF-1细胞的作用效果。结果表明,NDRV JDM10毒株在DF-1细胞中能有效增殖,产生明显的致病变效应;RT-PCR检测成功扩增出1条大小为1 001 bp的条带;病毒蛋白在细胞中获得了良好的表达,并与抗NDRV σC单克隆抗体发生特异性反应;NDRV JDM10毒株在感染DF-1细胞后会经历潜伏期、快速增长期、稳定期3个时期,并在72 h病毒效价达到峰值,TCID50为1×10-7.90·(0.1mL)-1。本研究为进一步研究NDRV的致病机理和研制细胞疫苗奠定了基础。 相似文献
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利用PCR方法扩增猪细小病毒7型(porcine parvovirus 7,PPV7)的Cap基因,将扩增产物克隆至pGEX-6P-1原核表达载体,构建重组质粒pGEX-6P-1-Cap,并进行测序鉴定。经鉴定正确后的重组质粒转化至E. coli Rosetta感受态细胞进行IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE和Western-blot进行鉴定。同时使用生物信息学软件预测该基因编码的蛋白的理化性质、二级结构、信号肽和跨膜结构域等。结果表明,成功从病料中扩增到Cap基因并构建获得重组质粒pGEX-6P-1-Cap,诱导表达出大小约为78 ku的Cap蛋白,与预期相符。诱导获得的Cap蛋白能够与GST单抗发生特异性反应,具有良好的反应原性。生物信息学分析结果显示,该蛋白是亲水稳定蛋白,二级结构中以无规则卷曲(c)结构居多,占62.90%,α螺旋(h)、β转角(t)、延伸链(e)分别占11.09%、4.05%、21.96%,无信号肽区域和跨膜结构域,存在62个磷酸化位点,12个B细胞抗原表位,2个CTL表位和3个Th表位。本研究成功表达了PPV7 Cap蛋白并预测其生物学特性,为该蛋白质的生物学功能相关研究提供参考。 相似文献
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葡萄糖调节蛋白78(Glucose regulated protein 78ku, GRP78)又称免疫球蛋白重链结合蛋白(Immunoglobulin heavy chain binding protein, Bip),是位于内质网上的一种重要分子伴侣,属热休克蛋白70家族的一员,GRP78分子及其DNA分子序列结构在许多生物物种中高度保守.GRP78在内质网中参与阻止内质网新生肽聚集、调节内质网钙稳态、抗内质网相关性细胞凋亡以及启动未折叠蛋白反应等.近年来发现,GRP78与多种疾病发生发展密切相关,GRP78生物学功能研究已经引起广泛关注. 相似文献
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Yuan PAN Xiu-hong ZHOU Shuai LI Ming-feng FENG Man-ling SHI Deng-pan ZUO Xi-zi JIANG Jing CHEN Ya-hui HU Xiang-xiang ZHANG Tong JIANG 《农业科学学报》2018,17(9):2031-2041
Strawberry vein banding virus(SVBV)-infected strawberry cells contain cytoplasmic inclusions with isometric particles.To identify the components of the inclusions,green fluorescent protein(GFP)was fused to the carboxy-terminus(C-terminus)of SVBV open reading frames,these constructs were separately transformed into Agrobacterium tumefaciens and infiltrated into Nicotiana benthamiana leaves.Results showed that the SVBV P6 protein assembled into prominent and amorphous inclusion bodies(IBs).To investigate P6 subcellular localization,P6-GFP was ectopically expressed in N.benthamiana leaves by agroinfiltration and then stained with 4′,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI).We found the P6 protein accumulated in the nuclei and also formed cytoplasmic IBs with different sizes.To further determine the location of P6 IBs in the cytoplasm,and explore whether the P6 IBs move freely or depend on cytoskeleton and endoplasmic reticulum(ER),the microfilament marker protein(GFP-ABD2-GFP),microtubules marker protein(m Cherry-MAP65-1)and ER marker protein(m Cherry-HDEL)were separately coexpressed with P6-GFP and into N.benthamiana leaves by agroinfiltration,exhibiting that P6 IBs aligned with cytoskeleton and endoplasmic reticulum.Meanwhile,coinfiltration of P1 and P6 indicated the P6colocalized with the P1 protein at periphery of cells.The P6 protein contains one C-terminal nuclear localization signal(NLS)region,a P6 protein mutant with a deleted NLS did not localize in the nucleus,did not form IBs,and was unable to facilitate exogenous GFP expression.These results demonstrate that the deleted NLS region is an important P6 domain required for biological functions.In summary,the mobile P6 IBs are associated with ER,microfilaments and microtubules and move along microfilaments to the SVBV P1 protein in the PD. 相似文献
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Hetz C Bernasconi P Fisher J Lee AH Bassik MC Antonsson B Brandt GS Iwakoshi NN Schinzel A Glimcher LH Korsmeyer SJ 《Science (New York, N.Y.)》2006,312(5773):572-576
Accumulation of misfolded protein in the endoplasmic reticulum (ER) triggers an adaptive stress response-termed the unfolded protein response (UPR)-mediated by the ER transmembrane protein kinase and endoribonuclease inositol-requiring enzyme-1alpha (IRE1alpha). We investigated UPR signaling events in mice in the absence of the proapoptotic BCL-2 family members BAX and BAK [double knockout (DKO)]. DKO mice responded abnormally to tunicamycin-induced ER stress in the liver, with extensive tissue damage and decreased expression of the IRE1 substrate X-box-binding protein 1 and its target genes. ER-stressed DKO cells showed deficient IRE1alpha signaling. BAX and BAK formed a protein complex with the cytosolic domain of IRE1alpha that was essential for IRE1alpha activation. Thus, BAX and BAK function at the ER membrane to activate IRE1alpha signaling and to provide a physical link between members of the core apoptotic pathway and the UPR. 相似文献
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Coupling of stress in the ER to activation of JNK protein kinases by transmembrane protein kinase IRE1 总被引：2，自引：0，他引：2
Urano F Wang X Bertolotti A Zhang Y Chung P Harding HP Ron D 《Science (New York, N.Y.)》2000,287(5453):664-666
Malfolded proteins in the endoplasmic reticulum (ER) induce cellular stress and activate c-Jun amino-terminal kinases (JNKs or SAPKs). Mammalian homologs of yeast IRE1, which activate chaperone genes in response to ER stress, also activated JNK, and IRE1alpha-/- fibroblasts were impaired in JNK activation by ER stress. The cytoplasmic part of IRE1 bound TRAF2, an adaptor protein that couples plasma membrane receptors to JNK activation. Dominant-negative TRAF2 inhibited activation of JNK by IRE1. Activation of JNK by endogenous signals initiated in the ER proceeds by a pathway similar to that initiated by cell surface receptors in response to extracellular signals. 相似文献
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【目的】研究细胞分裂素受体在细胞内定位分布的具体信号及其机制。【方法】构建拟南芥细胞分裂素受体蛋白——组氨酸蛋白激酶3(Arabidopsis histidine kinase 3,AHK3)的一系列亚细胞定位相关表达载体,转化到拟南芥原生质体细胞中进行瞬时表达后,采用激光共聚焦显微镜观察研究AHK3的亚细胞定位信号。【结果】AHK3定位于内质网(Endoplasmic reticulum,ER);AHK3的N端和C端均含有ER定位序列。【结论】AHK3在ER中实现对细胞分裂素的感知及受体蛋白之间的相互应答,并进行下游的信号转导;AHK3含有多段ER驻留信号。 相似文献
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为探究葡萄糖调节蛋白94(GRP94)对伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)增殖的影响,以及GRP94与PRV结构蛋白之间的相互作用。利用慢病毒转染构建GRP94基因过表达的BHK-21细胞,以及CRISPR/Cas9技术构建GRP94基因敲除的BHK-21细胞,检测PRV感染不同细胞的增殖水平,比较内质网应激相关蛋白表达水平,探索GRP94与PRV结构蛋白之间的互作关系。结果表明,GRP94基因过表达细胞株显著有利于PRV增殖,而GRP94基因缺失细胞株对PRV增殖无显著影响。蛋白免疫印迹结果显示,在GRP94基因缺失细胞株中,GRP78表达水平显著上调。免疫共沉淀结果表明,GRP94与gB、gD、gL具有相互作用。GRP94基因过表达有利于PRV增殖,检测未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)相关蛋白,研究GRP94在病毒增殖过程中的具体作用,可为PRV与内质网应激提供分子方面的研究基础,于对抗PRV病毒的感染具有重要意义。 相似文献
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The endoplasmic reticulum (ER) supports disulfide bond formation by a poorly understood mechanism requiring protein disulfide isomerase (PDI) and ERO1. In yeast, Ero1p-mediated oxidative folding was shown to depend on cellular flavin adenine dinucleotide (FAD) levels but not on ubiquinone or heme, and Ero1p was shown to be a FAD-binding protein. We reconstituted efficient oxidative folding in vitro using FAD, PDI, and Ero1p. Disulfide formation proceeded by direct delivery of oxidizing equivalents from Ero1p to folding substrates via PDI. This kinetic shuttling of oxidizing equivalents could allow the ER to support rapid disulfide formation while maintaining the ability to reduce and rearrange incorrect disulfide bonds. 相似文献