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3种病原菌多重IMS-荧光RPA检测体系的建立及初步应用 总被引：3，自引：0，他引：3
建立一种同时检测沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和布氏杆菌的快速、灵敏、高通量的检测方法。利用特异性免疫磁珠,在37℃条件下从200 mL样液体系中循环捕获目标致病菌。磁珠液提取DNA后,对3种病原菌进行多重IMS-荧光RPA检测。结果表明:针对沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和布氏杆菌的检测限分别达到3.0、4.5和8.7 CFU/mL。使用新建多重IMS-荧光RPA方法对人工感染60份皮张、毛皮纺织品DNA样本进行扩增,结果显示与预期结果一致;对60份公共场所收集的皮张、毛皮、纺织品DNA样本进行扩增,结果显示有2个样本沙门氏菌阳性、1个样本大肠杆菌O157:H7阳性,3份阳性样品送测序,测序结果与GenBank检索沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7 DNA序列一致。得出结论:建立的多重IMS-荧光RPA检测体系灵敏度、特异性、准确度符合要求,能够在2 h内完成对3种病原菌检测,可以作为快速应对此三类病原菌安全突发事件的检测手段。 相似文献
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目的建立一种能同时检测沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的双重荧光PCR方法,应用于动物源性食品的快速检验。方法根据沙门氏菌invA基因和大肠杆菌O157:H7 RFBE基因的保守序列,设计引物和探针,通过优化反应条件,建立可同时检测沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的双重荧光PCR方法,应用于动物源性食品的检验,并与miniVIDAS快速初筛方法和SN标准方法进行比较。结果本研究建立的双重荧光PCR方法可同时快速检测沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7,对纯菌的检测灵敏度均低于10CFU/双重荧光PCR反应体系。应用本方法检测36株标准/参考菌株,结果只有9株目的菌标准/参考菌株出现特异性扩增,其余27株非目的菌均呈阴性反应。定量检测重复性试验结果,批内和批间的变异系数均小于2%。应用本方法检测人工染菌样品,结果与miniVIDAS和SN方法检测结果一致,但检测时间比miniVIDAS快了3倍,比SN标准快了10多倍。结论本研究建立的双重荧光PCR方法具有快速、灵敏、特异、重复性好的优点,可在8小时内完成样品沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的检验。 相似文献
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为了研制一种快速、准确诊断大肠杆菌O157:H7的PCR方法,试验根据GenBank收录的大肠杆菌O157:H7全基因组序列,设计并合成了2对可扩增rfbE(O157)和Flic(H7)基因片段的特异性引物,建立双重PCR快速检测大肠杆菌O157:H7的方法,并研制出检测试剂盒。结果表明:该检测试剂盒对大肠杆菌O157:H7能特异性地扩增出rfbE和Flic基因的目的片段;对大肠杆菌O157:H30、O157:H9、O157:H25、O157:H19只能扩增出rfbE而不能扩增出Flic基因的目的片段;对大肠杆菌DH5α、猪链球菌2型和副猪嗜血杆菌没有扩增出任何目的片段;细菌DNA的最低检测极限是50 pg;在-20℃条件下保存1,3,6,9,12个月后,其敏感性都没有发生改变,均能检测到50 pg的大肠杆菌O157:H7DNA模板。 相似文献
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李鹏 《中国草食动物科学》2019,(1):52-54
为初步了解并分析酒泉市部分地区羊肉制品中食源性致病菌的污染情况,于2015—2017年对酒泉市5个县市随机采集羊肉制品827份,参照食品国家安全标准对采集的样品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7、副溶血性孤菌和单核细胞增生李斯特菌污染情况进行了调查。结果显示:共有116份样品被检测出携带食源性致病菌,检出率14.03%,其中金黄色葡萄球菌74份(8.95%)、沙门氏菌23份(2.78%)、副溶血性孤菌12份(1.45%)、单核细胞增生李斯特菌7份(0.85%),没有检出大肠杆菌O157:H7;2015—2017年检出率分别为24.05%、12.09%和7.75%;不同羊肉制品中以油炸肉检出率最高(48.65%),生肉最低(5.67%)。说明酒泉市羊肉制品中食源性病菌污染较为严重,其中主要以沙门氏菌和金黄色葡萄球菌为主,给消费者健康造成潜在的威胁,相关部门需要提高食品安全监管力度。 相似文献
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多重荧光PCR检测水产品致病菌方法的建立与应用研究 总被引：1，自引：0，他引：1
根据沙门氏菌invA基因、副溶血性弧菌toxR基因和大肠杆菌O157：H7 RFBE基因的保守序列,设计引物和探针,通过优化反应体系,测定其灵敏度和特异性,建立了可同时检测上述三种致病菌的多重实时荧光PCR方法。该方法对纯茵的检测灵敏度均低于1O cfu／PCR反应体系。人工染菌样品经6h增菌,检测的灵敏度可低于10c... 相似文献
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应用测试片快速检测食品中的大肠杆菌O157：H7 总被引：1，自引：1，他引：0
目的应用大肠杆菌O157:H7测试片快速检测食品中的大肠杆菌O157:H7。方法对大肠杆菌O157:H7测试片的各项指标及影响因素进行测试,并将其应用于食品检测。结果大肠杆菌O157:H7测试片的检测灵敏度高,其对纯菌的检测低限可达3cfu/mL;特异性较强,与鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌等21种非目的菌无交叉反应;快速,24h内可报告阴性检测结果。应用该测试片检测各种食品206份,检测结果与SN标准的符合率达到98.5%。结论应用测试片检测食品中的大肠杆菌O157:H7具有快速、方便、经济、无需昂贵设备等优点。该测试片可适应于食品中大肠杆菌O157:H7的快速初筛。 相似文献
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肠出血性大肠杆菌O157:H7是一种重要的人畜共患传染病病原菌.为建立一种特异、灵敏的O157:H7新型检测技术,以O157抗原基因(rfbE基因)为模板设计特异性引物,利用叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)处理菌液,沸水浴法制备细菌裂解液,优化PCR条件,建立一种快速、有效的O157:H7活菌EMA-PCR检测方法.结果显示:EMA-PCR可从rfbE基因阳性菌株CVCC248和两株临床分离菌株cd0912、cd0803中扩增出大小为495 bp的特异性条带,检测灵敏度可达12 CFU/mL.经EMA处理,从含有1％～100％O157:H7 CVCC248活菌混合悬液制备的DNA中均可扩增出目的片段.因此,成功建立了肠出血性大肠杆菌O157:H7的EMA-PCR检测方法;该方法可避免因分析的样品中含有死细菌而造成的假阳性检测结果,检测的准确性和真实性较传统PCR大大提高.O157:H7 EMA-PCR技术的建立为O157:H7的临床诊断提供了新的方法,具有重要的实际应用价值和良好的应用前景. 相似文献
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为了能同时检测到新疆褐牛乳房炎乳中无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌四种致病菌,试验根据GenBank中的金黄色葡萄球菌nuc、大肠杆菌phoA、无乳链球菌ef-tu和沙门氏菌invA基因保守序列设计了4对特异性引物,提取新疆褐牛77份乳样DNA,采用单一PCR和多重PCR方法进行扩增,统计琼脂糖凝胶电泳结果并计算相应感染率,比较两种检测方法的符合率,并检测多重PCR方法在牛场中的应用效果。结果表明：单一PCR方法中以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌感染为主,感染率分别为93.5%和76.6%。多重PCR方法中,以大肠杆菌+金黄色葡萄球菌+无乳链球菌的混合感染为主,感染率为24.7%;其次是大肠杆菌+金黄色葡萄球菌的混合感染,感染率为16.9%。对两种检测方法的结果进行比较,大肠杆菌+金黄色葡萄球菌+无乳链球菌及大肠杆菌+金黄色葡萄球菌混合感染的符合率分别为95%和93%;大肠杆菌+沙门氏菌+无乳链球菌的混合感染符合率为0,但多重PCR检出数量仅有2份;其余致病菌混合感染的符合率为100%。结合牧场的DHI报告及兽医诊断确认新疆褐牛中的乳房炎主要致病菌为大肠杆菌的单一感染和无乳链球... 相似文献
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根据基因库中沙门氏菌、空肠弯曲杆菌、单核细胞增生李斯特菌和大肠杆菌O157：H7的invA、MapA、hlyA和O gene cluster基因分别设计了4对引物,通过对反应条件的优化,建立了同时检测4种病原菌的多重PCR方法。结果表明,该多重PCR方法可扩增出四条特异性条带,并且任意两条产物片段长度相差大于20％。多重PCR反应体系检测四种病原菌混合模板最低含量为100 CFU。该多重PCR检测方法具有快速、准确和特异性强的优点,可用于快速检测食品中的病原菌。 相似文献
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应用多重PCR方法检测出血性大肠杆菌O157:H7 总被引：2，自引：0，他引：2
选择O157：H7的产志贺样毒素基因stx1、stx2和β-葡糖醛酸糖苷酶基因(uidA)分别设计引物,在同一扩增体系中进行PCR反应。在优化好的多重PCR反应条件下,对菌株及其它肠道菌进行检测。试验结果为：O157：H7菌株在250,207,179bp处均出现特异条带。试验结果表明,选择3对引物的多重PCR方法可特异、快速而且灵敏地对大肠杆菌O157：H7进行检测。 相似文献
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根据GenBank公布的大肠杆菌O157:H7的Flic(H7)基因序列进行同源性比较分析,选择保守序列设计一对特异性扩增引物,通过优化反应条件,建立一个用于大肠杆菌O157:H7快速定量检测的实时定量PCR方法.该方法的最低检测极限是103CFU/mL,敏感性比常规PCR提高10倍.方法重复性好、特异性强,重复性检测的变异系数均小于2%;只能检测大肠杆菌O157:H7,对非大肠杆菌O157:H7血清型细菌、猪链球菌2型、副猪嗜血杆菌无反应.利用此方法对模拟样本进行定量检测,其结果与平板细菌计数基本一致,表明此方法可作为大肠杆菌O157:H7快速诊断和疫情监测的一种快速、准确、简便的检测工具. 相似文献
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《畜牧与兽医》2016,(8):73-76
根据肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic E.coli,EHEC)O157∶H7的O抗原编码基因rfb E和H抗原编码基因fli C分别设计引物,建立双重PCR方法。饲料样品人工污染EHEC O157∶H7后进行增菌培养,利用双重PCR进行检测EHEC O157∶H7。结果表明:建立的PCR方法能够特异性扩增出目的条带,敏感性可达到100 cfu细菌。双重PCR方法可以有效地检测出饲料中人工污染的EHEC O157∶H7,人工污染饲料样品经4 h预增菌处理后,该方法的检测下限为20 cfu细菌。本研究建立的双重PCR方法可快速、特异地检测出饲料中污染的EHEC O157∶H7,可用于饲料中EHEC O157∶H7的检测及流行病学调查。 相似文献
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肠出血性大肠杆菌O157∶H7是一种重要的人畜共患传染病病原菌。为建立一种特异、灵敏的O157∶H7新型检测技术,以O157抗原基因(rfbE基因)为模板设计特异性引物,利用叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)处理菌液,沸水浴法制备细菌裂解液,优化PCR条件,建立一种快速、有效的O157∶H7活菌EMA-PCR检测方法。结果显示:EMA-PCR可从rfbE基因阳性菌株CVCC248和两株临床分离菌株cd0912、cd0803中扩增出大小为495 bp的特异性条带,检测灵敏度可达12 CFU/mL。经EMA处理,从含有1%～100%O157∶H7 CVCC248活菌混合悬液制备的DNA中均可扩增出目的片段。因此,成功建立了肠出血性大肠杆菌O157∶H7的EMA-PCR检测方法;该方法可避免因分析的样品中含有死细菌而造成的假阳性检测结果,检测的准确性和真实性较传统PCR大大提高。O157∶H7 EMA-PCR技术的建立为O157∶H7的临床诊断提供了新的方法,具有重要的实际应用价值和良好的应用前景。 相似文献
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为建立肠出血性大肠埃希菌O157:H7的多重PCR检测方法,针对O157菌特异性eaeA基因、fliC基因、志贺毒素基因(stx1和stx2)及rfbE基因设计5对引物,构建多重PCR反应体系,优化反应的引物浓度和温度检测其特异性和敏感性,并对牛、猪、鸡及犬等不同动物来源的样品进行了大肠埃希菌O157检测。结果显示,该方法具有良好的特异性和敏感性,敏感性达到5×10~3CFU。从检测阳性样本中均分离到目的菌。应用建立的方法在确定样品中是否含有大肠埃希菌O157的同时,还能对菌株毒力进行初步判定。成功建立了肠出血性大肠埃希菌O157:H7多重PCR检测方法,为该病原菌感染的预防和监测提供了简便、快速的技术手段,具有良好的应用前景。 相似文献
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《中国兽医杂志》2015,(5)
为了了解新疆不同牛场中大肠杆菌O157:H7的流行情况,对新疆乌鲁木齐、伊犁地区、塔城地区多个牛场采集的粪样及水样样本的检测,样品经EC肉汤增菌、免疫磁珠富集后,用SMAC平板和MUG培养基进行初步筛选,再用rfb E和fli C基因对筛选后的疑似大肠杆菌O157:H7菌株做PCR检测,同时结合生化试验的方法进行符合性检验。结果从新疆3个地区不同牛场的208份样品分离得到5株肠出血性大肠杆菌O157:H7,检出率为2.4%。其中粪样检出5株,检出率为2.4%;水样未检出。生化试验结果表明,5株分离出的大肠杆菌O157:H7菌株与国标规定的O157:H7特性相同。表明,部分被检牛场存在大肠杆菌O157:H7威胁,应该引起重视。 相似文献
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