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含组氨酸标签的枯草杆菌5-氨基酮戊酸脱水酶的高效表达 总被引：1，自引：0，他引：1
以枯草杆菌基因组为模板,通过PCR扩增枯草杆菌编码5-氨基酮戊酸脱水酶基因hemB.将NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切的纯化产物插入同样处理的pET-28a中构建成表达载体.表达蛋白的N端含有6个组氨酸标签.构建的表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下,重组蛋白获得高效表达.SDS-PAGE检测到41 kD的特异带,表达菌株的上清检测到ALAD的比活为337 mU·mg-1,表明组氨酸标签不显著影响酶活. 相似文献
2.
利用基因重组技术,以油松PAL基因(TaPAL) CDS区(2 157 bp)作为外源基因的同源重组片段,构建了pET-28a-TaPAL重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中融合表达并进行分析.经SDS-PAGE电泳检测,在分子量80 KD处获得一条特异蛋白的表达条带,且其大小与预期相符.在温度28℃,IPTG浓度1.5 mmol· L-1,时间3h条件下,重组质粒的表达量最大.可溶性分析表明,在最佳诱导条件下,该蛋白主要以包涵体形式存在.粗酶活性测定表明,粗酶(在20℃、IPTG浓度1 mm01·L-1条件下诱导10 h)比活力为55.3μmol·min-1·gpro-1,即55.3U·g-1.构建的pET-28a-TaPAL重组载体能够在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出具有生物活性的融合蛋白. 相似文献
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利用多聚酶链反应技术,扩增出编码结构域Tt APuX21的基因Tt apux21,然后将Tt apux21克隆到表达载体pET21a( )中.得重组质粒.重组质粒命名为pEX21,并转化到表达宿主菌大肠杆菌Tuner 中.30℃、O-1mmol·L-1 IPTG诱导5h后.SDS-PAGE检验表明Tt APuX21获得高效表达.将表达产物加入到TalonTM树脂中,进行金属离子亲和层析,得纯化产物. 相似文献
4.
依据鸡γ-干扰素基因(ChIFN-γ)的氨基酸序列,采用油菜偏嗜性的密码子,人工合成ChIFN-γ,构建原核表达载体pET32a-ChIFN-γ,并转化到E. coli BL21中.1 mmol·L-1 IPTG 37℃诱导表达12h ChIFN-γ表达量达到菌体总蛋白的37%.SDS-PAGE电泳检测表明,ChIFN-γ重组蛋白分子量约为33kDa.研究为下一步制备ChIFN-γ抗体进行真核表达研究奠定了基础. 相似文献
5.
本试验设计了M基因的特异性引物,扩增了M基因,成功构建了重组质粒,并转化至Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中,优化了异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达条件.结果表明,重组表达的融合蛋白Pet-32a-M大小约为43 ku,与预期大小相符.十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表明,M蛋白为包涵体蛋白,且在IPTG浓度为0.8 mmol·L-1,温度为37℃,诱导时间为8 h的条件下,蛋白表达效果最佳.蛋白免疫印迹检测结果进一步显示,重组蛋白Pet-32a-M在体外可以被成功表达. 相似文献
6.
《甘肃农业大学学报》2020,(3):71-77
【目的】探究苦荞蔗糖合酶结构与功能的关系,构建表达载体以实现SuSy基因在大肠杆菌中的表达,并经亲和层析纯化后得到重组SuSy蛋白,为进一步研究该酶的结构和功能奠定基础.【方法】以苦荞(Fagopyrum tataricum)cDNA文库中克隆得到的蔗糖合酶基因重组质粒为模板,PCR扩增得到SuSy编码序列,将其与原核生物表达载体pET28a相连接构建了重组表达载体pET28a-SuSy,经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切及测序鉴定正确后将其转入大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达SuSy重组蛋白,并对其诱导表达条件进行优化.【结果】在37℃、1.2 mmol/L IPTG诱导10 h时,SuSy蛋白表达量最高,分子量大小约为53.4 ku,超声破碎后经SDS-PAGE检测到该蛋白以包涵体形式存在.【结论】利用Co~(2+)亲和柱层析纯化和His-tag鉴定得到了高纯度的重组SuSy蛋白,为该酶结构与功能的研究及多克隆抗体制备奠定了基础. 相似文献
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内切葡聚糖酶基因工程菌pET-C36表达条件的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为了提高内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达量,通过实验研究了重组菌Pet-C36的表达条件,结果表明重组菌的培养条件为:最适培养温度43℃,最适培养时间5 h,IPTG诱导终浓度0.1 mmol/L或乳糖诱导终浓度0.1%。基因工程菌在此条件下诱导培养后酶活力比未优化表达条件时提高了2倍,可达141.22 U/mL。 相似文献
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OjCHS原核表达载体的构建及重组蛋白的纯化 总被引：1，自引：1，他引：0
查尔酮合酶（chalcone synthase,CHS）是类黄酮生物合成过程中的第一个关键酶,也是限速酶,它直接影响并限制类黄酮的合成与积累。在克隆得到日本蛇根草CHS基因（OjCHS）基础上,将该基因插入原核表达载体pET-28a,完成重组表达质粒pET28a-CHS的构建。随后,利用冻融法将上述质粒转入大肠杆菌BL21感受态细胞中用于重组蛋白的表达。选择不同IPTG 浓度、诱导温度及诱导时间对重组菌进行诱导,确定了可溶性重组蛋白的最佳诱导表达条件。最后,通过洗脱、纯化、透析与浓缩完成重组蛋白的纯化。结果显示,成功构建原核表达载体pET28a-CHS,可溶性重组蛋白最佳诱导条件为：IPTG 浓度0.45 mmol·L-1,25 ℃下诱导12 h。最后大量制备并纯化获得符合预期大小的可溶性蛋白,为深入研究OjCHS的生物学功能奠定了基础。 相似文献
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利用RT-PCR技术从甘蓝型油菜宁油16号(Brassica napus L.)中克隆到乙酰羟基酸合酶基因BnAHAS1的cDNA序列,该序列含有1个1 968 bp的开放阅读框,编码蛋白质655个氨基酸,分子量约为7.1×104,预测等电点为6.16。将该基因克隆到原核表达载体pCold II中,经酶切和测序鉴定后,将正确的重组质粒pCold IIBnAHAS1导入大肠杆菌BL21(DE3)。在15℃下以终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导12 h后,获得预期大小的重组蛋白质His-BnAHAS1,并用Western blot确定此重组蛋白质为目的蛋白质。 相似文献
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为进一步了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在国内的分子遗传进化情况,对中国大陆1996～2008年间33株PRRSV分离毒株(29株来自GenBank)的GP5序列与国外部分代表毒株进行了分析比较.结果表明,所选PRRSV中国分离毒株中有32株属于北美洲型(NA),并大致可分为2个基因亚群,1株属于欧洲型(EU).其中,自2006年在我国暴发的高致病性蓝耳病病毒(H-PRRsV)属于亚群1,且与YA株亲缘关系较近;亚群2毒株则与Ingelvac的弱毒疫苗株及其亲本株VR-2332具有较高的同源性. 相似文献
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为了保持土地利用数据的现势性,北京市在土地利用数据库建立之后每年都会以区县为单位进行土地利用数据库变更工作。以北京市为例,采用SPOT-5遥感影像作为数据源,基于GPS的精确定位功能,结合GIS数据操作、管理、显示等的良好功能以及背景数据知识,对北京市的土地利用数据库进行了变更。该方法发挥了航空遥感技术的优势,在GPS实地测量和土地利用数据库的支持下,用GIS集成数据,从而完成了对北京市土地资源的动态监测和数据库的及时更新。 相似文献
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猪内源性反转录病毒5''非编码区启动子活性的分析 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]构建以缺失不同功能区的猪内源性反转录病毒(PERV)5'非编码区(5'UTR)为启动子的萤光素酶表达载体,分析5'UTR的转录调控规律.[方法]将含有不同功能域的PERV的UTR克隆至萤光素酶表达载体上,转染瞬时表达细胞Cos-7,检测萤光素酶的表达.[结果]缺失R区的5'UTR显示出很强的启动子活性,U3重复区序列缺失的5'UTR启动子活性显著下降.UTR显示出较之LTR强的启动子活性.缺失整个U3区的UTR比仅缺失U3重复区的UTR启动子活性强.[结论]在R区有转录因子的结合位点可引起转录活性下降;U3重复区序列表现出增强子的活性.在5'UTR的下游序列中,包括引物结合区(PBS)和前导序列(Leader)可能有某些转录因子的结合位点引起转录增强,同时在U3重复区的上游和下游序列可能存在某些转录因子的结合位点可减少5'UTR的转录活性. 相似文献
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雏鸵鸟脾脏的显微与超微结构及脾内5-HT的分布定位 总被引：3，自引：0，他引：3
【目的】观察雏鸵鸟脾脏的解剖学、显微和超微结构特点，探明5-HT免疫反应阳性细胞在脾内的分布规律。【方法】采用光镜和电镜制片及染色技术，并结合免疫组化SABC法对5-HT在脾脏内的表达进行定位。【结果】雏鸵鸟脾脏被膜较薄，小梁不发达；白髓内动脉周围淋巴鞘薄，偶见脾小结，但无生发中心；淋巴细胞内含较多的线粒体、游离核糖体及少量RER，核膜双层，有明显的核膜孔；椭球体积小，其周围淋巴鞘较厚，且数量多，椭球与周围淋巴组织之间有强嗜酸性均质物形成的明显界限，鞘毛细血管外细胞胞质内富含RER、线粒体和游离核糖体。5-HT免疫反应阳性细胞呈圆形或卵圆形，胞体较大，胞质较多，核多位于细胞一侧，阳性产物位于胞质内；红髓内阳性细胞数量最多，阳性产物表达最强；动脉周围淋巴鞘内阳性细胞数量较少，但阳性产物表达较强；而椭球内有弱阳性产物表达。【结论】雏鸵鸟椭球周围淋巴鞘数量远比动脉周围淋巴鞘的多；椭球与周围淋巴组织之间界限明显，其间的强嗜酸性物质主要由纤维构成；5-HT免疫阳性细胞数量较多，主要位于红髓、动脉周围淋巴鞘和椭球，阳性产物表达强；脾脏是合成外周5-HT的重要场所，可能主要由浆细胞和原浆细胞合成分泌；外周5-HT可能参与机体的体液免疫应答反应。 相似文献
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PRRSV浙江株ORF5基因的原核表达与免疫原性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中公布的PRRSV基因序列(EU709837),设计一对PCR引物,以浙江分离株为模板,通过RT-PCR扩增出ORF5基因全序列.以PCR技术构建了缺失信号肽及三处跨膜区的重组ORF5基因,命名为g-ORF5.将g-ORF5基因定向克隆到原核表达载体pET-28a中,转化入E.coli菌株BL21.经酶切和测序鉴定后,阳性菌株用1 mol/L IPTG诱导表达,用Ni-NTA纯化表达的重组蛋白.结果表明,重组GP5蛋白在大肠杆菌中获得表达.纯化后经ELISA和Dot-ELISA分析,表达蛋白具有免疫反应性,能与PRRSV阳性猪血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应. 相似文献
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用MM5中尺度数值模式模拟鲁西南一次辐射雾和平流雾过程,检验对雾有较大影响的近地层湿度、风、温度等要素预报效果。结果表明,48 h内相对湿度模拟结果与实况变化趋势基本一致,模拟逆温层对预报雾有较好参考价值,地形对10 m风场的影响24 h内模拟效果也较好。 相似文献
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不同日龄猪小肠黏膜5-HT分布特征的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】研究猪小肠黏膜中5-HT分布与小肠发育之间的关系,为阐明5-HT在发育过程中对小肠调节作用机理提供形态学依据。【方法】选用0、5、15和100日龄英系大白猪,采用免疫组织化学染色结合显微镜观察计数对猪小肠各段5-HT的分布进行定性和定量研究。【结果】5-HT免疫反应阳性细胞广泛分布于0、5、15和100日龄猪小肠各段的绒毛中段和底端以及肠腺上皮细胞之间。由0日龄至100日龄,小肠5-HT免疫反应阳性细胞密度呈先增加后递减的趋势,小肠各段5-HT免疫反应阳性细胞密度呈现由十二指肠至回肠显著递减的趋势;各日龄各肠段肠腺5-HT免疫反应阳性细胞数量均显著高于绒毛。【结论】猪小肠黏膜5-HT主要分布于肠腺上皮细胞间,5-HT免疫反应阳性细胞密度随日龄改变而发生变化,且各肠段分布规律不尽相同。 相似文献
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利用遥感技术进行土地利用动态监测是利用多源多时相的遥感数据,利用栅格数据和矢量数据相结合对土地进行全面性的调查与监测,掌握其数量、质量、权属、利用现状等各种信息,它能够主动发现土地利用变化的信息,使我们可以及时掌握有关土地变更的各种信息。可是当我们发现了疑似变更了属性的非法建设用地等图斑时,这些变化图斑或不确定图斑,我们很难在影像上获取它们的准确的空间位置。本文以SPOT-5遥感影像为数据源,通过图像匹配技术来解决在土地利用动态监测中的非法建设用地变化图斑的空间定位的问题。 相似文献