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1.
用丝心蛋白轻链基因构建转基因家蚕基因打靶载体 总被引：4，自引：0，他引：4
家蚕（Bombyx mori)的丝心蛋白启动子是自然界中最强的启动子之一，若能使外源基因在丝心蛋白启动子控制下得到重要的意义。研究从天蛹中提取家蚕基因组DNA，用PCR的方法克隆了丝心蛋白轻链基因的5kb和0.5kb两个片段。DNA序列分析表明，不同蚕品种2－7外显子范围内DNA序列源性达95．7％。用PCR的方法在GFP基因前端加上凝血酶的识别序列，并克隆到轻链基因的5kb和0.5kb两个片段中间，使GFP基因具有正确的读码框，能和轻链蛋白融合表达。将这一融合的DNA大片段克隆到pBacPAK8转移载体上，构建成一种新型的转基因家蚕打靶载体pBacFL53TG，用于家蚕丝腺生物反应器的研究。 相似文献
2.
以首次克隆的家蚕Bombyx mori 肌动蛋白（actin4, A4）启动子、红色荧光蛋白基因DsRed1和多聚腺苷酸识别序列SV40为元件，经多次克隆将其插入到 piggyBac转座载体中，构建成pBacA4DsRed1转基因表达载体。将该载体显微注射到胚盘形成前期的蚕卵中，在荧光显微镜下观察其发光情况，结果发现：在胚胎早期发育的第三天，检测到蚕卵内发出较强的红色荧光。由于蚕卵没有红色自发荧光，用DsRed1标记背景干扰小，对注射蚕种无特别选择，在荧光显微镜下观察到明显的红色荧光，表明pBacA4DsRed1载体构建正确且能在蚕卵中表达。红色荧光蛋白(RFP)基因丰富了报告基因的种类，并且与绿色荧光蛋白(GFP)基因一样，可以作为理想的报告基因应用于家蚕的功能基因研究。 相似文献
3.
向日葵肌动蛋白基因的cDNA克隆及进化分析 总被引：9，自引：0，他引：9
本研究以向日葵（Helianthus annuus)为材料，提取其总RNA，根据植物肌动蛋白基因编码区的5′和3′末端设计简并引物，利用RT-PCR技术，用5′RACE试剂盒扩增出向日葵肌动蛋白基因编码区全长，以豌豆肌动蛋白cDNA作探针的Southern杂交检测表明扩增出了肌动蛋白基因，将所获片段克隆到pGEM-T载体后进行测序，所得序列与GenBank已知肌动蛋白基因序列的相似性均在60%以上，其中与之相似性最高的锦葵为85%；与主要高等植物肌动蛋白氨基酸序列的相似性达80%以上，根据氨基酸序殖的相似性绘制主要高等植物肌动蛋白的系统树（种系树），表明向日葵肌动蛋白与锦葵肌动蛋白可能由同一祖先进化而来。 相似文献
4.
设汁两对引物，PCR扩增香蕉乙烯受体基因cDNA序列自AUG启始密码子起长538bp区段的正向(记为5‘I)、反向(记为AI’)DNA区段。构建含该正、反向互补重复序列DNA片段的中间载体，经测序证实连接正确后。克隆到植物表达载体pCAMBIA-1301中的GUs基因位置并经双酶切证实。在所得表达载体pCAMBIA-1301-S5’I-AI’中，该插入正反互补重复片段处于35S启动子之后，由此转录的mRNA因两端序列反向互补而形成发夹式RNA，因此可应用于RNA干扰研究。同时，文中对构建含正、反向重复序列插入片段植物表达载体过程中出现的插入片段链内退火引起连接困难等问题进行了分析讨论。 相似文献
5.
摘要:将一个2.8 kb的CaMV35S启动子/SchiA编码区/Nos终止区融合基因插入到植物转化载体pCAMBIA1301的多克隆酶切位点，得到1个14.6 kb的新植物转化质粒pBG1112,用花器介导法转化水稻（Oryza sativa ），经PCR检测，初步证实已将目的基因整合到受体植物的基因组中。一部分转基因T3代潮霉素抗性阳性植株对水稻纹枯病(Rhizoctonia solani )和稻瘟病（Pyricularia oryzae）的抗性较非转化对照增强。RT-PCR表明抗病性植株为阳性，而不抗病的植株为阴性。将RT-PCR产物测序后，用BLAST软件分析序列可知，该序列为细菌几丁质酶基因核苷酸序列而不是植物几丁质酶基因的核苷酸序列。T4代转基因水稻的几丁质酶活力高于对照未转基因植株，表明转入的外源几丁质酶基因能正常表达。 相似文献
6.
通过基因工程手段加强八氢番茄红素合成酶（Psy）基因的表达和通过RNAi抑制番茄红素β-环化酶（Lcy）基因（该基因是调控番茄红素转化为其他类胡萝卜素的主要的基因）的表达是培育高番茄红素品种的重要手段之一。根据GenBank中拟南芥的Psy基因序列（NM-121729），通过聚合酶链式反应（PCR）从拟南芥的cDNA中扩增出了长1296的Psy基因。根据GenBank中番茄的Lcy基因序列（X86452）和Pds启动子序列（U46919）分别设计特异引物从番茄中扩增出了Lcy基因的高度保守的长302bp的DNA片段和长1790的Pds启动子片段。根据RNAi的原理，将Lcy基因的长302bp的DNA片段以正反两个方向通过一段内含子序列连接在一起形成RNAi片段插入到抗Kan的pVCT2020的表达载体中，并通过具有果实特异性特点的启动子——八氢番茄红素去饱和酶基因（Pds）启动子控制该干扰片段的表达，同时将Psy基因在Pds启动子调控下插入到同一载体中，从而构建成了能同时加强Psy基因的表达和抑制Lcy基因表达的植物表达载体。 相似文献
7.
采用高保真PCR技术从尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）基因组中分离了β-肌动蛋白（β-actin）基因片段。序列分析显示该片段包括长为1643bp的β-肌动蛋白（β-actin）基因5,端侧翼区的启动调控区和90bp的部分转录区序列。启动调控区包括一段长为108bp的β-actin基因上游调控序列、β-actin基因不翻译的第一个外显子和第一个内含子。上游调控序列中含有与转录活性密切相关的作用元件：CAAT Box,TATA Box和CArG Box,分别位于转录起始位点上游的-92,-29,-62处。将尼罗罗非鱼β-actin基因的启动调控区定向克隆到不含启动子的红色荧光表达载体pDsRed2-1中,构建了重组荧光表达载体。重组载体经EcoRⅠ线性化后,采用显微注射技术将其注射到唐鱼的受精卵中,利用荧光显微镜观察外源基因增强型红色荧光蛋白基因（DsRed2）在唐鱼中的表达。结果表明在荧光显微镜下以及普通解剖镜下均可观察到红色荧光,说明本实验分离到的罗非鱼β-actin基因启动子序列具有有效的驱动功能。该实验为下一步进行转自源基因尼罗罗非鱼的研究奠定了基础。 相似文献
8.
以CMV-PAAV载体为基础载体,以皮肤特异人K14（人角蛋白14）基因启动子替换原质粒中的CMV启动子后,在其多克隆位点区依次插入鼠c-Myc基因的cDNA序列和gfp基因的编码序列,构建了高效表达c-Myc基因的真核表达载体。通过双原核显微注射技术,将线性化的载体DNA注入到C57BL/6小鼠受精卵的两个原核中,然后将注射后状态良好的胚胎移植到代孕鼠的输卵管中,共移植了256枚受精卵,6只受体怀孕,最终获得44只成年小鼠。通过PCR和Southern blot分析证明2只为阳性转基因小鼠,转基因阳性率为4%。Southern杂交结果分析显示外源片断是以多拷贝串联重复的形式整合到鼠染色体中 相似文献
9.
为了剔除冗余且有潜在安全问题的选择标记基因,本研究通过PCR扩增出ubiquitin启动子序列、lox P序列、Cre-GR融合基因和NPTⅡ抗性基因的编码区序列,采用酶切连接的方法将其引入载体p BRACT806,从而构建一个新的可诱导剔除选择标记基因及重组酶基因的表达载体p BLCK,测序结果显示其构建成功。该载体含有Gateway组件,可进行外源目标基因的高效重组整合;具有NPTⅡ基因,利于转基因植株的筛选;具有可诱导剔除外源基因的Cre-GR组件,诱导处于lox P位点之间的抗性标记基因NPTⅡ和Cre-GR融合基因的剔除,保留目标基因表达元件。此外,目标基因、Cre-GR融合基因和NPTⅡ基因都由ubiquitin强启动子控制,可在农作物中组成型超量表达外源基因。本研究为农作物转基因安全性研究提供了新的载体系统,具有一定的育种价值。 相似文献
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采用高保真PCR技术从尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）基因组中分离了β-肌动蛋白（β-actin）基因片段（GenBank登录号：EF026001）。序列分析显示该片段包括长为1643bpβ-actin基因5＇端侧翼区的启动调控区和90bp的部分转录区序列。启动调控区包括一段长为108bpβ-actin基因上游调控序列、β-actin基因不翻译的第1个外显子和第1个内含子。上游调控序列中含有与转录活性密切相关的作用元件：CAAT box,TATA box和CArG box,分别位于转录起始位点上游的-92、-29和-62处。将尼罗罗非鱼β-actin基因的启动调控区定向克隆到不含启动子的红色荧光表达载体pDsRed2-1中,构建了重组荧光表达载体。重组载体经EcoRⅠ线性化后,采用显微注射技术将其注射到唐鱼（Tanichthys albonubes）的受精卵中,利用荧光显微镜观察外源基因增强型红色荧光蛋白基因（DsRed2）在唐鱼中的表达。结果表明,在荧光显微镜下以及普通解剖镜下均可观察到红色荧光,说明本实验分离到的罗非鱼β-actin基因启动子序列具有有效的驱动功能。 相似文献
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Zhang HK Cao GL Zhang XR Wang XJ Xue RY Gong CL 《Journal of agricultural and food chemistry》2012,60(12):3173-3179
The pupal stage of the silkworm Bombyx mori Linnaeus lasts for approximately two weeks. However, prolongation of pupal duration would reduce the labor required to process and dry fresh cocoons. This study investigated the effects of BmKIT(3)(R) gene (from the Chinese scorpion Buthus martensii Karsch) transfer on the pupal development of B. mori using a Gal4/UAS binary transgenic system. Gal4 driven by a pupa-specific promoter BmWCP4 (from a B. mori wing-cuticle protein gene) or PDP (from a B. mori cocoonase gene), and BmKIT(3)(R) driven by a UAS cis-acting element were used to construct novel piggyBac-derived plasmids containing a neomycin-resistance gene (neo) controlled by the Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV) ie-1 (immediate-early gene) promoter and a green fluorescent protein gene (gfp) under the control of the B. mori actin 3 (A3) promoter. The vector was transferred into silkworm eggs by sperm-mediated gene transfer. Transgenic silkworms were produced after screening for neo and gfp genes, and gene transfer was verified by polymerase chain reaction and dot-blot hybridization. The larval development of the hybrid progeny of Gal4- and UAS-transgenic silkworms was similar to that of normal silkworms, but some pupae failed to metamorphose into moths, and the development of surviving pupae was arrested as a result of BmKIT(3)(R) expression. Moreover, Gal4 driven by the BmWCP4 promoter delayed pupal development more effectively than that driven by the PDP promoter in the Gal4/UAS binary transgenic system. Pupal durations of hybrid transgenic silkworm progeny with BmWCP4 and PDP promoters were approximately 5, 2, and 4 days longer, respectively, compared to corresponding normal silkworms, BmWCP4/Gal4, and UAS/BmKIT(3)(R) transgenic silkworms, respectively. These results suggest new avenues of research for prolonging the pupal duration of silkworms. 相似文献
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家蚕真核细胞翻译起始因子(BmeIF4E)基因的克隆、表达及功能分析 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究从自建的家蚕(Bombyx mori)蛹期cDNA文库中筛选到一条cDNA序列,发现其在序列和结构上与其他物种的真核细胞翻译起始因子钮基因(BmeIF4E)具有较高的相似性,推测可能是家蚕eIF4E基因,将该序列命名为BmeIF4E,GenBank登录号为DN443192.为研究BmeIF4E的生物学功能,将该基因插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)-BmeIF4E,转化感受态细胞BL21(DE3),IPTG诱导表达并纯化该重组蛋白,制备多克隆抗体.利用家蚕Bm5细胞进行亚细胞定位研究结果表明,BmeIF4E既存在于细胞质中也存在于细胞核中.荧光定量PCR和Westem blot分析结果表明,在不同组织及发育时期该基因的表达有差异,在各组织中BmeIF4E表达量从高到底依次是马氏管、表皮、脂肪体、气管、卵巢、中肠、头和丝腺;在卵、幼虫、蛹和蛾4个发育时期中,蛾中的表达量最高,其次是蛹,再次是五龄幼虫,而在卵中表达量较低.以该基因的ORF为模板体外转录dsRNA,脂质体法转染Bm5细胞,72 h后提取细胞总蛋白作Western blot检测RNA干扰情况,发现BmeIF4E基因被干扰后,总蛋白中目的蛋白含量明显低于阴性对照组.MTT法检测结果表明,干扰后细胞活力也明显下降.研究结果提示,BmeIF4E作为一种重要的管家基因,在家蚕的整个生命周期中均有表达,起着十分重要的作用. 相似文献
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本研究以优良杂交品种“两广二号”家蚕为试材,克隆了该杂交品种家蚕两个抗家蚕核型多角体病毒（BmNPV）基因：脂肪酶基因Bmlipase-1和丝氨酸蛋白酶基因BmSP-2,测序并分别与不同品种蚕的同源基因序列进行比较。结果显示,“两广二号”家蚕Bmlipase-1基因ORF长度为885bp,编码294个氨基酸,BmSP-2扩增长度为855bp,编码284个氨基酸;它们的核苷酸和推导氨基酸序列同源性皆达92％以上,Bmlipase-1更保守,同源性大于99％;“两广二号”家蚕的Bmlipase-1基因脂肪酶活化部位和BmSP-2基因酶催化三联体位点的氨基酸残基与不同品种蚕的完全相同。以上结果说明这两个抗病毒基因在蚕的遗传进化过程中高度保守,提示其可能在机体消化或者免疫防御方面起着重要生理作用。将这两个抗病毒基因在大肠杆菌BL21中进行融合表达,获得的融合Bmlipase-1和BmSP-2蛋白分子量分别为47kD和42kD左右。 相似文献
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家蚕质型多角体病毒（Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV）是家蚕的重要病毒病原之一,往往给养蚕业生产造成极大危害。我们以前的研究运用基因芯片技术在感染质型多角体病毒的家蚕中肠中鉴定出一个差异表达的3-羟酰辅酶A脱氢酶蛋白基因（Bombyx mori3-hydroxyacyl-CoA dehyrogenase protein gene-Bm3HAD）。本研究利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）克隆了该基因,其全长cDNA序列为1168bp,包含一个83bp5＇端非翻译区序列（5＇-UTR）、一个930bp的开放阅读框（ORF）和一个155bp的3＇端非翻译区序列（3＇-UTR）;基因结构分析发现该基因由5个外显子和4个内含子组成。RT-PCR结果显示该基因在家蚕中肠、脂肪体、血液、丝腺及生殖体中均有表达。荧光定量PCR结果表明该基因在BmCPV感染初期为上调表达,随着病毒感染的进展,该基因的表达水平逐渐降低,并转变为下调表达。研究结果为进一步研究BmCPV对家蚕致病的分子机制提供了有益的信息。 相似文献
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家蚕谷胱甘肽转移酶基因的克隆、序列分析及其表达模式 总被引：2，自引：0，他引：2
谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)是昆虫体内重要的解毒酶系,在对外源和内源化合物解毒代谢中起着重要的作用。以GenBank中已知的昆虫GST的氨基酸序列在家蚕(Bombyx mori)基因组序列中作TBLASTN检索,获得了多个可能的家蚕GST同源基因。对其中的一个GST新基因进行了EST分析和克隆,结果表明,该基因编码区全长663bp。以该基因推导的氨基酸序列与其它物种的GSTs进行相似性比较和系统发育分析,发现此基因为delta家族的成员,并命名为BmGSTd3。RT-PCR结果表明,BmGSTd3基因在家蚕5龄第3天的8个组织中都有表达,中肠和表皮的表达丰度较高。在辛硫磷处理家蚕后的72h内,BmGSTd3基因的转录水平与对照组相比没有显著的变化。对BmGSTd3基因的5'侧翼区的调控序列进行了预测,共发现12个可能与内源和外源物代谢以及抗氧化相关的转录调控元件。 相似文献
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百菌清是一种广谱非内源性农药，在土壤中难以降解，已经成为农业环境污染的主要污染源之一。因此，其对环境的污染和被污染土壤的修复技术越来越受到关注。土壤环境中原位降解细菌的多样性对于评价环境毒理学、生物降解性、自净化能力和污染物的修复潜力具有重要价值。该研究从长期被百菌清污染的土壤中收集大量样本，分离到了14种能够明显降解百菌清的细菌。根据菌株形态和rDNA同源性分析，将它们分为假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、无色杆菌属（Achromobacter sp.）、苍白杆菌属（Ochrobactrum sp.）、青枯菌属（Ralstonia sp.）和溶杆菌属（Lysobacter sp.）。其中溶杆菌属是该研究中新发现的具有百菌清降解能力的功能菌属，该发现扩大了已知的百菌清降解菌的菌属范围。通过进一步鉴定及生理生化分析，确定了该降解菌的分类地位及理化特征。此外，该研究通过基因文库法克隆到了发挥关键降解作用的水解酶基因，并发现该基因与转座子原件IS-Olup相连，二者组成代谢转座子，具有水平转移的分子基础。通过揭示降解基因在细菌间的漂移机制，为修复百菌清污染土壤的生物技术奠定了理论基础。 相似文献
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本研究利用化学合成法合成了包含pCAMBIA0390左右边界T-DNA和LoxP／FRT（LF）位点的DNA片段Ⅰ,利用SacⅡ和SphⅠ酶切位点,去除了pCAMBIA0390左右边界T—DNA和多克隆位点之间的序列,然后连接DNA片段Ⅰ和载体片段,构建了植物表达载体pGM323-LF-enTP。随后,再合成含有适合在单予叶植物中表达的由玉米Ubi-1启动子驱动的融合标记基因（Bar：：gus）和水稻actin-1启动子驱动的助抗虫蛋白基因（Cry1A6）表达元件的DNA片段Ⅳ,在pGM323～LF—enTP的基础上,利用5以Ⅰ和PstⅠ位点构建了同时含有LF位点、Bar：：gus以及Cry1Ab基因表达元件的表达载体pGM626-LF—ABt。利用含有pGM626-LF—ABt的农杆菌遗传转化烟草和玉米,以草丁膦作为抗性筛选剂,非转化细胞得到了有效抑制,快速获得了转基W植株,利用GUS组织化学检测和RT—PCR分析了转基因植株中标记基因的表达,结果表明pGM626-LF—ABt可以用于农杆菌介导的单、双子叶植物遗传转化。本研究为培育安全抗虫转基因植物奠定了基础。 相似文献