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1.
《中国瓜菜》2019,(12)
遗传转化是实现基因功能验证和基因快速转育的重要手段,但目前甜瓜的遗传转化依旧存在众多技术难题。笔者利用野生型发根农杆菌K599侵染甜瓜'E31',成功诱导甜瓜产生了不定根。借助该技术,将含有GUS基因和EGF基因的过表达载体pCAMBIA3301和pCAMBIA1300-ProSuper导入发根农杆菌K599,利用转化后的农杆菌侵染甜瓜'E31',成功诱导出了不定根。PCR检测结果表明,新生不定根的阳性率达到100%。通过GOS染色和激光共聚焦显微镜检测,在不定根中检测到GOS基因和EGFP基因的大量表达,成功实现了外源基因在甜瓜新生不定根内过表达。该方法周期短、操作方便、转化率高,可实现基因功能的快速验证,为甜瓜根系抗病抗逆方面的研究提供技术支持。 相似文献
2.
发根农杆菌K599侵染菊花无菌苗刻伤的叶片形成转基因不定根,生根频率为88.0%;不定根经过诱导培养形成愈伤组织,并再生完整植株,愈伤组织诱导率和分化率分别为75.0%和63.3%。诱导的不定根和再生植株经过PCR鉴定含有K599 Ri质粒中的rolC基因,qRT-PCR检测显示rolC基因在再生转基因植株中实现了正常表达。再生植株表现出矮缩、多毛状根特征,并能正常开花。建立的利用活体材料直接作为发根农杆菌K599侵染的受体诱导不定根的遗传转化体系,能克服假阳性不定根的出现;同时,利用不定根繁殖过程中顶端生长点区域无菌的特点,通过截取不定根顶端靠近生长点区域进行继代培养,结合使用头孢霉素杀菌,能达到有效抑制和杀灭农杆菌的目的,在随后的不定根诱导愈伤及分化过程中无须再使用抗生素杀菌,提高了转基因再生效率,为菊花的矮化育种和目标基因的转移提供了良好的试验体系。 相似文献
3.
用XhoI酶切质粒pCAMBIA1301自身环化后得到T-DNA区只含GUS基因的重组质粒pCAMBIA1301-GUS,通过液氮冻融法将质粒pCAMBIA1301-GUS,pCAMBIA1300转入农杆菌LBA4404和EHA105中,并对菊花进行叶盘共转化实验,根据共培养3d后叶片中GUS的瞬间表达及其稳定共转化率,测定了不同农杆菌菌株搭配及其不同浓度配比对共转化效率的影响,结果表明：在两种农杆菌菌液浓度比为1：1时,其中EHA105/pCAMBIA1300与EHA105/pCAMBIA1301-GUS组合,共转化效率要高于其它菌株的组合,而在EHA105/pCAMBIA1300与EHA105/pCAMBIA1301-GUS组合中,两种菌液浓度比为1：2时共转化效率最高. 相似文献
4.
《中国瓜菜》2016,(2)
黄瓜是全球范围内重要的经济作物。建立黄瓜基因组测序品种‘中国龙’的毛状根诱导体系,可为今后分析黄瓜基因功能、挖掘黄瓜优良基因提供技术支撑。本文以‘中国龙’为材料,从种子表面灭菌方法、发根农杆菌的侵染浓度和共培养时间3方面,研究发根农杆菌菌株K599对‘中国龙’毛状根诱导的情况。结果表明,75%(φ)的乙醇先处理种子30 s,再用5%的次氯酸钠灭菌5~10 min的种子消毒方法,农杆菌菌液OD_(600)值在1.2左右时进行侵染,共培养2天,是获得‘中国龙’毛状根的适宜组合方法。PCR扩增结果证实,经这样诱导出的黄瓜毛状根中,发根农杆菌Ri质粒的rol C基因已在黄瓜毛状根基因组中整合并得到表达。试验探索出了一套适合‘中国龙’毛状根诱导的方法。 相似文献
5.
西瓜遗传转化技术周期长,过程复杂,CRISPR/Cas9基因编辑系统又存在着一定的脱靶效应,为了保障所选择的靶位点的可行性,本研究选择西瓜ClSPO11-1基因(ID:Cla003301)为靶标,利用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建双靶点的基因敲除载体,利用发根农杆菌Ar. Qual菌株侵染西瓜子叶外植体,通过简单的组培过程,使西瓜外植体长出不定根,在不定根中检测到了在靶位点1处发生了不同程度的碱基缺失,经过与野生型氨基酸序列比对分析后发现均造成了翻译提前终止和氨基酸的突变,成功实现了对西瓜不定根的基因编辑,该方法周期短,操作简便,实现了快速鉴定在西瓜中选择的靶位点的靶向效率,为研究西瓜基因功能和遗传改良提供了保障。 相似文献
6.
以4种发根农杆菌A4、C58C1、R1601、ATCC15834为诱导菌株侵染毛酸浆叶片、茎段,研究了发根农杆菌种类、外植体类型、不同预培养时间、不同侵染时间、不同共培养时间和乙酰丁香酮对毛酸浆毛状根诱导率的影响,并用PCR检测rolB基因。结果表明:4种发根农杆菌均能诱导毛酸浆外植体产生毛状根,ATCC15834的诱导率相对较高,叶片优于茎段;最佳侵染时间为6~8min;预培养和共培养时间均为2~3d时诱导率较高;乙酰丁香酮(AS)浓度为100μmol·L~(-1)有利于促进毛状根的产生,经PCR检测证明,rolB基因已整合到毛酸浆毛状根基因组中。 相似文献
7.
《果树学报》2018,(11)
【目的】建立欧洲甜樱桃果实VIGS体系。【方法】利用In-Fusion cloning技术,构建欧洲甜樱桃的烟草脆裂病毒(TRV)介导基因沉默表达载体pTRV2-ANS,转入农杆菌GV3101中,采用注射压迫法侵染欧洲甜樱桃果实,通过分子检测、qRT-PCR和表型观察技术评价TRV介导VIGS沉默体系的效果。【结果】TRV::ANS侵染的欧洲甜樱桃果实ans基因的表达显著低于TRV::00侵染的果实。与TRV::00比较,TRV::ANS侵染的欧洲甜樱桃果实的果皮和果肉颜色都没有发生着色,果皮和果肉颜色呈绿色,而TRV::00侵染的欧洲甜樱桃果实的果皮和果肉正常着色。【结论】研究建立的TRV介导欧洲甜樱桃VIGS体系可有效沉默欧洲甜樱桃果实内源基因表达。该体系为欧洲甜樱桃果实品质基因的功能验证及分子机制研究奠定了技术基础。 相似文献
8.
山楂过氧化物酶基因的克隆及在烟草中异位表达分析 总被引：1，自引：0，他引：1
《果树学报》2015,(6)
【目的】从山楂(Crataegus pinnatifida)中克隆过氧化物酶(POD)编码基因,通过转基因验证其在木质素合成中的作用,为揭示山楂内果皮形成分子机制奠定基础。【方法】利用RT-PCR技术从山楂克隆基因,以p RI 101-AN为构建基因过量表达载体的基础载体,通过农杆菌介导的遗传转化方法将目的基因导入烟草。【结果】从山楂中克隆出编码序列长度为996 bp的POD72基因,命名为Cp POD72。山楂POD72与木本和草本植物POD72的氨基酸序列一致性均较高。构建了Cp POD72基因的过量表达载体,通过农杆菌介导的转化获得了66个烟草转化植株。RT-PCR检测结果显示Cp POD72基因在烟草转基因植物中异位表达,组织化学染色分析表明转Cp POD72基因烟草植株中木质素含量增加。【结论】Cp POD72基因可能参与木质素合成。 相似文献
9.
《果树学报》2016,(9)
【目的】探究Ac SERK1启动子的功能,有助于了解Ac SERK1的表达调控模式。【方法】以‘神湾’菠萝(Ananas comosus L.‘Shenwan’)为材料,将Ac SERK1启动子缺失序列与GUS融合,构建植物表达载体,并导入根瘤农杆菌GV3101中。利用农杆菌真空渗透法侵染烟草叶片,并检测GUS活性;利用浸染法转化菠萝胚性愈伤组织获得转基因植株,分析光照、2,4-D和4℃等处理后的GUS表达量。【结果】构建2个Ac SERK1启动子植物缺失表达载体,分别命名为p(-30/+258 bp)和p(-499/+258 bp)。烟草瞬时表达结果显示p(-499/+258 bp)表现出强的GUS活性,p(-30/+258 bp)表现出微弱的GUS活性。q RT-PCR结果表明,光照处理后,GUS表达量降低。相反的,2,4-D和4℃处理转基因菠萝植株后GUS表达量均显著增加。【结论】Ac SERK1启动子-499/-30 bp区段内含有光、生长素和低温响应元件。 相似文献
10.
根癌农杆菌介导蓝猪耳转化系统的建立 总被引：7，自引：0，他引：7
通过对影响根癌农杆菌介导蓝猪耳转化效果各种因素的研究, 建立了蓝猪耳高效稳定的遗传转化系统。研究结果表明, 农杆菌侵染叶片外植体效率最高; 外植体预培养不利于农杆菌的侵染; 乙酰丁香酮能大大提高根癌农杆菌转化蓝猪耳的效率。另外, 菌液浓度、侵染和共培养的时间及再生的途径等均对转化效率有一定的影响。叶片外植体与农杆菌共培养后, 经过抗性芽的诱导、根的再生, 70 d左右就可以获得抗性苗。抗性植株经GUS染色、PCR分析和Southern blot检测, 外源基因已经整合到蓝猪耳基因组中, 转化频率为7%～8%。 相似文献