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《中国畜牧兽医文摘》2012,(10)
<正>取18日龄的SPF鸡胚,分别采用组织块培养法、胰蛋白酶、胶原酶I和嗜热菌蛋白酶消化法分离和体外培养小肠上皮细胞。结果表明:组织块培养法所获得的上皮细胞纯度较低;胰蛋白酶消化后多为单细胞,细胞贴壁和生长能力较弱;胶原酶Ⅰ单独消化50min或嗜热菌蛋白酶单独消化110min以及胶原酶Ⅰ、嗜热菌蛋白酶联 相似文献
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鸡胚盲肠上皮细胞原代培养与鉴定 总被引：2，自引：1，他引：1
为研究鸡E.tenella的宿主细胞--盲肠上皮细胞体外培养技术,为E.tenella损伤机制及抗球虫药的研究提供体外模型,分别用胰蛋白酶法、胶原酶Ⅰ法、嗜热菌蛋白酶法、嗜热菌蛋白酶+胶原酶Ⅰ法和中性蛋白酶Ⅰ+胶原酶Ⅺ法分离纯化原代鸡胚盲肠上皮细胞,通过测定细胞活力、细胞团块比例、总细胞产量和细胞团块产量,筛选出鸡胚盲肠上皮细胞最佳分离方法,并进行了纯化和培养,对培养细胞进行了鉴定.结果表明:嗜热菌蛋白酶消化、低速离心去除单细胞、差速贴壁除去成纤维细胞,为最佳分离和纯化盲肠上皮细胞的方法;分离纯化的细胞接种后分别于第3-5天、第10-11天进入对数生长期,可存活14 d以上;经形态学观察、碱性磷酸酶染色、扫描电镜鉴定为盲肠上皮细胞,所分离的细胞培养至第4、7、11天时上皮细胞比例分别为81.67%、84.33%和72.00%.用该法可获得纯度较高的原代鸡胚盲肠上皮细胞. 相似文献
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取29～30胚龄的鹅胚为试验材料,通过组织块种植法和酶消化法进行原代鹅小肠上皮的体外培养,采用刮除法、相差消化及相差贴壁法对上皮细胞进行纯化,用0.05%Trypsin-EDTA进行消化传代,通过形态学观察及免疫细胞化学法进行鉴定.结果表明:组织块种植法得到的鹅小肠上皮细胞生长状况良好,细胞活性较强,经过纯化,得到了纯度较高的鹅小肠上皮细胞.而联合使用浓度为300 U/mL的胶原酶(Ⅺ型)和0.1 mg/mL的中性蛋白酶(Ⅰ型)、多次(短时间)消化收获细胞法虽然可获得大量的健全肠绒毛隐窝单位,但传代后其增殖能力明显下降;形态学观察及免疫细胞化学法鉴定为阳性,证明分离出的细胞为小肠上皮细胞,从而为小肠上皮细胞的进一步研究奠定了基础. 相似文献
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《中国家禽》2015,(7)
为研究大围山微型鸡骨骼肌卫星细胞的体外纯化、培养、鉴定方法及其生物学特性,试验采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶两步酶消化法结合差速贴壁技术分离纯化出云南大围山微型鸡骨骼肌卫星细胞,进行体外原代和传代培养。观察细胞各个阶段的形态,通过生长曲线、诱导分化等手段研究骨骼肌卫星细胞的增殖与分化能力,利用RT-PCR以及免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定。结果显示:两步酶消化法适用于微型鸡骨骼肌卫星细胞的分离和获取,此法分离得到的微型鸡骨骼肌卫星细胞表达卫星细胞特异的标志基因Pax7。在生长培养基作用下,细胞增殖旺盛,经诱导分化后,细胞可融合成肌管。该试验方法对研究家禽骨骼肌细胞增殖、分化和骨骼肌生长、发育的细胞生物学机制具有一定科学意义。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2015,(21)
为了探讨鸡肠上皮细胞体外分离培养方法,进一步研究鸡源志贺菌Ipa C毒力蛋白在鸡肠上皮细胞上的受体蛋白分子,试验分别无菌取14,16,18日龄鸡胚肠组织,用300 U/m LⅪ型胶原酶和0.1 mg/m LⅠ型中性蛋白酶混合搅拌消化25 min,用壁差法纯化鸡肠上皮细胞,贴壁时间差为3 h,分别种植于20%FBS包被过的和未包被过的一次性塑料细胞培养瓶中,在倒置显微镜下观察细胞生长状态,透射电镜下对培养细胞进行鉴定。结果表明:采用16日龄鸡胚肠组织用Ⅺ型胶原酶和Ⅰ型中性蛋白酶联合消化25 min,可获得较多的肠隐窝单位,肠上皮细胞在20%FBS包被过的一次性细胞培养瓶中贴壁效果良好,细胞生长状态良好;透射电镜下可见鸡肠上皮细胞的微绒毛,鉴定为鸡肠上皮细胞。 相似文献
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本试验采用组织块培养法获得原代小肠上皮细胞,联合刮除法、相差消化法纯化原代细胞,用0.05%的胰蛋白酶进行消化传代,对山羊小肠上皮细胞进行了原代分离培养、传代、纯化及鉴定,同时以山羊小肠上皮细胞为模型,体外研究山羊小肠上皮细胞对氨基酸的代谢作用。免疫组化鉴定结果表明所分离纯化的细胞为小肠上皮细胞;组氨酸、精氨酸、苏氨酸和亮氨酸是小肠上皮细胞快速利用的氨基酸,在72h内快速下降;天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸是生成的氨基酸,在72h内有所积累;其它氨基酸呈现平缓的被消耗状态。 相似文献
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本试验旨在建立肉用杂交犊牛小肠上皮细胞分离培养和鉴定的方法,为研究犊牛小肠上皮细胞营养吸收、免疫调控及肠道屏障功能提供原代细胞培养模型。选用新生未吮乳的肉用杂交犊牛的空肠组织,应用胶原酶Ⅰ和中性酶联合消化法对小肠上皮细胞进行分离,应用相差消化法和相差贴壁法对犊牛小肠上皮细胞进行纯化。通过细胞形态学观察、生长曲线、免疫荧光及染色体核型分析等方法来鉴定细胞。结果表明:1)应用胶原酶Ⅰ和中性酶联合消化法得到的犊牛小肠上皮细胞生长状况良好,经纯化后得到90%以上纯度的犊牛小肠上皮细胞,并稳定传代至10代以上; 2)犊牛小肠上皮细胞的生长曲线为"S"形,符合细胞增殖规律; 3)免疫荧光鉴定犊牛小肠上皮细胞特异性表达角蛋白13和绒毛蛋白; 4)透射电镜观察发现犊牛小肠上皮细胞边缘有微绒毛结构,细胞与细胞之间的紧密连接结构清晰可见; 5)染色体核型分析显示细胞内含有60条染色体,形态正常,呈二倍体核型。综上所述,应用胶原酶Ⅰ和中性酶联合消化及相差贴壁纯化成功得到犊牛小肠上皮细胞,为研究犊牛小肠上皮细胞营养物质吸收、免疫调控和肠道屏障功能提供了细胞素材。 相似文献
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为明确鸡胚肠上皮细胞中Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)的表达情况,本研究采用嗜热菌蛋白酶分离培养18日龄鸡胚的肠上皮细胞,在形态学观察及免疫细胞化学法鉴定基础上,采用RT-PCR方法检测其TLR表达谱,并对不同品种鸡胚肠上皮细胞TLR表达谱进行了比较研究。结果表明,应用嗜热菌蛋白酶消化法得到的鸡胚肠上皮细胞生长状况良好;采用低速离心和差速贴壁进行纯化,得到90%以上纯度的鸡胚肠上皮细胞;纯化后的细胞经形态学观察及细胞角蛋白单克隆抗体鉴定为阳性;10种TLR在鸡胚肠上皮细胞上均有mRNA表达,但其丰度存在明显差异;不同品种鸡胚肠上皮细胞TLR表达谱均无显著差异。 相似文献
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通过比较组织块贴壁培养法、组织块再移法、胰蛋白酶消化法、胶原酶Ⅱ消化法和胶原酶消化配合组织块贴壁法分离、培养、纯化山羊乳腺上皮细胞,绘制细胞生长曲线并计算细胞群体倍增时间,研究乳腺上皮细胞培养效果。结果显示,利用胶原酶消化配合组织块贴壁法不能获得正常生长的乳腺上皮细胞;利用组织块贴壁培养法、组织块再移法和胶原酶Ⅱ消化法获得大量的乳腺上皮细胞,所得到的上皮细胞生长曲线呈典型的＂S＂型,符合细胞生长的一般规律。组织块再移法不仅可快速获得大量纯化的乳腺上皮细胞,而且所得到的细胞经传代后,细胞群体倍增时间最短、增殖能力最强,表明,该法是获得山羊乳腺上皮细胞最适宜的方法。 相似文献
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小鼠小肠上皮细胞的分离培养研究 总被引：1，自引：0，他引：1
通过组织块培养法进行胎鼠原代细胞培养,采用刮除法和相差消化及相差贴壁法对细胞进行纯化,用0.05%的胰蛋白酶进行消化传代对小鼠小肠上皮细胞进行了原代分离培养、传代、纯化及鉴定.结果表明:组织块培养法得到了小鼠生长状况良好的细胞,经过纯化,得到了较纯的小肠上皮细胞;形态学观察和免疫组化检测显示得到的细胞为小鼠上皮细胞.用组织块培养可以分离纯化出增殖能力较强的上皮细胞,并能进行传代纯化,通过免疫组化鉴定,证明分离出的小鼠EEC为阳性,即为小肠上皮细胞. 相似文献
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鸡胚原代软骨细胞的分离培养及表型鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
《中国兽医学报》2020,(2):349-354
选取不同日龄的SPF鸡胚进行骨架染色,确定软骨最佳取材日龄为15日龄,分离关节软骨,采用胰蛋白酶和Ⅳ型胶原酶两步消化法获取软骨细胞。CCK-8法检测细胞增殖率,阿利新蓝染色及实时荧光定量PCR技术检测软骨细胞标志性基因表达来鉴定分离培养的软骨细胞。结果显示,分离培养的软骨细胞3～5 d时增殖较快,阿利新蓝染色阳性,能够表达sox9、colⅡ、acan、vegfA和mmp13等不同分化阶段标志性基因,且随着体外培养时间的增加,晚期表达基因vegfA和mmp13 mRNA表达上调。结果表明,分离培养的鸡胚软骨细胞具有软骨细胞表型,可作为家禽骨骼及钙磷代谢紊乱性疾病研究模型。本试验旨在建立鸡胚原代软骨细胞的体外培养体系,以期为家禽骨骼及钙磷代谢紊乱性疾病研究提供理论依据。 相似文献
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本研究旨在探讨鸡胚盲肠上皮细胞传代培养条件及其特性,为E.tenella损伤机制及抗球虫药的研究提供体外模型。分别用胰酶-EDTA联合消化和分步消化2种方法分离纯化原代鸡胚盲肠上皮细胞,通过测定贴壁细胞覆盖率选择细胞传代的适宜消化方式;筛选了传代细胞培养液中L-GLN和胰岛素的最佳浓度,通过贴壁差进一步纯化盲肠上皮细胞,探索其合适的培养条件。通过形态学观察、透射电镜、免疫组织化学技术、组织化学技术、糖原染色、流式细胞术的方法对传代细胞特性进行了鉴定。结果表明:胰酶-EDTA联合消化、15min贴壁差纯化除去成纤维细胞,72.5mg.L-1 L-GLN、0.05mg.L-1胰岛素和5%FBS的传代细胞培养液更有利于盲肠上皮细胞的生长;经形态学和透射电镜观察,AKP、Vimentin及PAS染色,所培养的传代细胞具有典型的上皮细胞特征,在传代后24～72h盲肠上皮细胞纯度达95%以上,贴壁细胞覆盖率达85%以上;细胞凋亡测定表明,细胞连传5代,活性较好,第6代细胞凋亡率显著增加,贴壁细胞覆盖率降低。本研究提示用该法传代可获得稳定、数量大、活性高、纯度高的鸡胚盲肠上皮细胞。 相似文献
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小鼠睾丸间质细胞的分离纯化与体外培养的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为了寻求一种快速、高效的体外分离、纯化小鼠睾丸间质细胞的方法,试验采用两种酶(胶原酶Ⅳ和0.25%胰蛋白酶)消化法和6个梯度(70%、65%、60%、55%、50%、45%)的Percoll液对小鼠睾丸间质细胞进行分离、纯化,对分离的细胞进行细胞学观察、台盼蓝染色、3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)染色,采用物理方法、胶原酶Ⅳ+0.25%胰蛋白酶和柠檬酸钠+KCl对睾丸间质细胞进行消化传代培养。结果表明:胶原酶Ⅳ和0.25%胰蛋白酶限时消化能够获得较高活率(90%)的小鼠睾丸间质细胞;经Percoll细胞分离液分离的细胞纯度高达86%,且在34℃、5%CO2条件下培养的细胞生长良好。 相似文献
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本试验用半胚法制备鸡胚成纤维细胞,用胰酶对SPF鸡胚进行消化培养,并观察所得细胞的生长情况。在相同条件下设立两个对照组,观察胰酶在细胞制备过程中对试验的影响,并比较不同厂家(Gibco和Difco)生产的胰酶在相同条件下对鸡胚消化情况及所得细胞生长情况的影响。 相似文献
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通过建立一种有效的乌鸡肌卫星细胞分离、培养及鉴定体系,为体外探讨家禽骨骼肌生长发育调控机制及骨骼肌损伤后修复的研究奠定基础。选取10日胚龄的乌鸡鸡胚为材料,采用Ⅰ型胶原酶和胰酶联合消化,差速贴壁法分离鸡肌卫星细胞,通过形态学识别和检测肌卫星细胞标志基因的表达等方法鉴定分离获得的细胞,并在低浓度血清培养基中诱导细胞成肌分化。结果显示:分离获得的细胞形态与肌卫星细胞相似;实时荧光定量PCR(q PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测卫星细胞特异基因Paired protein box 7(Pax7)呈高水平表达;经成肌诱导分化后,细胞融合形成肌管,细胞免疫荧光法检测成肌分化标志基因肌球蛋白重链(Myosin heavy chain,My HC)呈阳性表达。研究成功从鸡胚中分离获得肌卫星细胞,并具有良好的体外增殖和分化能力,为肌肉的发育和损伤修复研究提供良好的细胞模型。 相似文献