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1.
同源重组快速构建百合LCHS2基因RNAi表达载体及其鉴定 总被引：1，自引：1，他引：0
为探讨CHS基因的下调表达对花朵着色的影响以及为百合观赏性状遗传改良提供技术支持,利用基于同源重组原理的Gateway技术,根据课题组从东方百合‘索邦’分离的LCHS2基因序列(Genbank登录号:GQ483376)和pENTR/D-TOPO载体要求,设计上游5'端添加'CACC'的一对特异引物,PCR扩增获得636 bp的干扰片段。通过TOPO克隆,将该片段克隆入载体pENTR/D-TOPO构建入门克隆载体pENTR/D-CHS,测序结果显示,与原序列同源性为100%。再经过LR反应使pENTR/D-CHS上的干扰片段替换掉目标载体pHellsgate12上的ccdB片段,快速构建了包含LCHS2基因干扰片段的RNAi表达载体pH12-CHSi,经限制性内切酶XhoI、XbaI酶切鉴定获得724 bp和722 bp的片段,与预期结果一致。pH12-CHSi电击法转化农杆菌GV3101,菌液PCR鉴定,出现636 bp的目的条带,表明RNAi表达载体pH12-CHSi已成功转入农杆菌。 相似文献
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为获得高效的RNAi(RNA interference)表达载体,培育百合抗病毒新种质,选取感病百合叶片为试验材料,同源序列比对后选取CMV 2b 基因271 bp和LMoV cp 基因428 bp作为靶基因片段。首先采用RT-PCR方法对感病植株进行病毒检测,确定其带有CMV和LMoV病毒;之后提取感病植株叶片总RNA,反转录得到cDNA,设计带有不同酶切位点的引物,以反转录得到的cDNA为模板,PCR扩增获得目的片段,产物回收纯化后,转化大肠杆菌,重组克隆。将各自的反向片段、正向片段顺次连接到载体pFGC5941上,经多次双酶切、连接、转化后,采用冻融法将构建好的载体转入农杆菌EHA105并进行重组鉴定。酶切结果表明已成功构建了分别抗CMV、LMoV的RNAi植物表达载体pFGC5941-C2和pFGC5941-L2,PCR扩增结果表明表达载体已成功转入农杆菌中。所构建的载体及获得的工程菌与预期的完全一致,获得含载体的农杆菌可以直接应用于百合转基因抗病毒育种工程中。 相似文献
3.
持绿基因(Stay Green gene)在植物衰老过程中起到了重要的作用。本研究利用同源序列PCR方法、Gateway重组技术和子叶节遗传转化方法,对大豆持绿基因Gm SGR进行RNAi载体的构建,并将其转入到大豆受体中,获得转基因阳性植株。结果显示,分别获得长度为786 bp的Gm SGR1 CDS序列,长度为816 bp的Gm SGR2 CDS序列及355 bp的att B-Gm SGRi干扰片段。依据RNAi引物设计原则和Gateway重组技术,将干扰片段依次导入到入门载体p DONR221和表达载体p B7GWIW2(Ⅱ)中,并转化农杆菌EHA105,通过子叶节法将其转入大豆受体中,最终获得阳性转基因植株。本研究在m RNA水平沉默同源靶基因,干扰大豆Gm SGR基因功能,结果显示其叶片和种子有趋向持绿的特性。本研究为探究持绿基因的遗传效应,作用机理提供实践参考,为高光效大豆的遗传改良,探讨植物衰老延缓机制,提高产量和品质等提供理论支持。 相似文献
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隐花色素CRY1在拟南芥光形态建成及光信号转导中起重要作用,在津田芜菁(Brassica rapaL. subsp. rapa ‘Tsuda’)中是否起相同作用尚未报道。本研究利用实验室已克隆得到的津田芜菁CRY1基因的cDNA全长序列,在NCBI进行序列比对,选取特异的片段。同时根据Gateway克隆技术特点,设计含有attB接头的引物。利用高保真的LA Taq DNA聚合酶,通过PCR方法在目的片段的两端加上attB序列。通过BP反应和LR反应将CRY1基因片段克隆到pH7GWIWG2(I)双元干涉载体。对重组载体pH7GWIWG2(I)-CRY1的鉴定结果表明成功构建了CRY1基因的干涉载体。利用Gateway克隆技术构建植物干涉表达载体简便易行,该结果为遗传转化研究其功能奠定了基础。 相似文献
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木霉双价基因表达载体的构建 总被引：1，自引：1，他引：0
利用几丁质酶基因和β-1,4-葡聚糖酶基因构建双价基因表达载体,为木霉转化奠定基础。利用限制性内切酶酶切得到目的基因片段,通过T4 DNA ligase将基因插入表达框中,并采用PCR、酶切和核苷酸序列分析验证双价基因表达载体的正确性。利用启动子CaMV35S和终止子PolyA构建几丁质酶基因chi42的表达框,获得表达载体pC1302-C42;利用启动子CaMV35S和终止子Nos构建β-1,4-葡聚糖酶基因glu14的表达框,获得表达载体pC1300-2-G14;在单基因表达载体的基础上,通过串联构建双价基因表达载体pC1300-2-G14-C42,该表达载体含有潮霉素B抗性基因。经检测证实表达元件35S-chi42- PolyA和35S-glu14-Nos连接成功。得到的双价基因表达载体pC1300-2-G14-C42可直接用于木霉等丝状真菌的遗传转化,为构建木霉广谱高效工程菌株奠定基础。 相似文献
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菊花DgLsL基因RNAi表达载体的构建及遗传转化 总被引：1，自引：0，他引：1
培育少侧枝的标准切花菊品种具有重要的实际意义。本研究利用RNAi的方法抑制菊花侧枝发育相关基因DgLsL基因的表达,以期得到侧枝生长受抑制的转基因植株。从切花菊‘神马’基因组DNA中克隆侧枝发育相关基因DgLsL基因,经过测序分析,将一个413bp长的保守片段连接到植物表达载体pBI121和pFGC5941,构建植物RNAi载体pBI121-R2,并运用农杆菌介导法将其导入切花菊‘神马’。结果:PCR得到的DgLsL基因片段测序后与GenBank上的DgLsL基因比对,DNA序列一致性为99.4%;构建的RNAi表达载体经过PCR和酶切证实外源基因的正确插入;转化后得到了18株抗性植株,PCR结果显示,12株抗性植株为阳性。本试验通过将DgLsL基因干扰片段导入切花菊,获得了转基因植株,以此为基础可进一步选育少侧枝的切花菊品种。 相似文献
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《分子植物育种》2020,(16)
09-4为本实验室构建的抗马铃薯PRLV的RNAi基因和特异切割马铃薯PSTVd的核酶基因无标记双价表达载体p CAMBIA3301-DR-IS导入马铃薯中获得的转基因无性系。本研究通过染色体步移获取转基因无性系09-4的插入位点左边界旁侧序列,对获得的左边界序列进行分析,扩增获得片段大小为382 bp,包括转化载体序列119 bp及转基因马铃薯的旁侧序列263 bp;依据转化马铃薯的RNAi基因和左旁侧序列分别设计引物,扩增出大小为300 bp的片段,建立了09-4转基因无性系特异性标识和特异PCR检测方法,为转基因马铃薯的检测和身份识别提供技术基础。 相似文献
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为探讨RNAi策略在抗GFLV基因工程中的效果,通过RT-PCR克隆获得了310 bp的GFLV外壳蛋白基因保守片段,采用Gateway技术将该基因片段连入目标载体pHELLSGATE12构建了RNAi植物表达载体,并通过农杆菌介导法转入烟草中,RT-PCR检测表明目的基因片段已整合到烟草基因组中并在RNA 水平上得到表达,病毒接种结果显示阳性植株的发病率明显低于对照,说明在转基因植株中dsRNA表达可干涉GFLV侵染过程。 相似文献
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苹果抗ASPV病毒RNAi载体构建及转化砧木M26的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为获得抗病毒的转基因植物新材料,采用同源重组法构建了抗苹果茎痘病毒的植物表达载体,并对苹果砧木材料M26进行了遗传转化,成功获得了转基因阳性植株。首先以感病的皇家嘎拉叶片为材料,反转录合成c DNA第一链,采用PCR方法克隆获得了489 bp的ASPV外壳蛋白基因的保守片段,通过TOPO克隆技术将该基因片段连接进入载体p ENTR/SD/D,构建了入门克隆载体p EN-ASPV,再通过LR反应置换该片段连接进入目标载体p Hellsgate12,构建了RNAi植物表达载体Phe-ASPV,并采用冻融法转入根癌农杆菌菌株EHA105中,获得了可用于植物遗传转化的工程菌EH-ASPV。采用农杆菌介导的方法转化苹果砧木M26叶盘,经抗生素筛选和脱菌培养获得了Kan抗性芽,进一步进行生根培养后获得了完整的Kan抗性植株,对生根植株提取总RNA后RT-PCR检测结果显示,RNAi表达载体上携带的外源基因片段(489 bp)已成功转入苹果砧木材料M26中,并在转基因植株内RNA水平上得到表达。获得的转基因新材料,为进一步通过病毒接种进行抗病性评价及抗病毒分子育种奠定了基础。 相似文献
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小麦SSⅡ-A基因片段的克隆及其RNAi表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
可溶性淀粉合成酶Ⅱ（SSⅡ）是小麦籽粒支链淀粉合成的主要角色,但是其三个部分同源基因（SSⅡ-A、SSⅡ-B和SSⅡ-D）对支链淀粉合成的贡献大小目前还未见报道,探究它们对支链淀粉合成的作用,对小麦淀粉合成的遗传操纵和淀粉品质改良具有重要意义。此文通过RT-PCR方法克隆了小麦SSⅡ-A基因cDNA的部分序列（长度为539 bp）,经序列比对发现,它与AB201445.1（Triticum aestivum wSSII-A gene for starch synthase II-A, complete cds）的同源性为100%。以H质粒为中间载体,构建了SSⅡ-A基因片段的发夹结构,并将之连接到pBAC47P上高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）1Dx5启动子的下游,得到了高效特异的SSⅡ-A RNAi表达载体。这些工作为下一步遗传转化获得转基因植株以深入探究SSⅡ-A基因对支链淀粉合成的贡献大小奠定了基础。 相似文献
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为了获得小麦wx-B1a基因的特异RNAi表达载体,以小麦品种‘京花1号’开花12天的籽粒为材料,用天根公司植物总RNA提取试剂盒提取总RNA,以wx-B1a基因(GenBank NO:AB019623)的cDNA序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR克隆了wx-B1a基因部分cDNA片段。Blastn结果显示,它与GenBank上报道的Triticum aestivum wx-1 gene(GenBank NO:EU719611.1)同源。通过酶切连接将此片段分别置于拟南芥FAD2的Intron1(GenBank NO:AJ271841)的上、下游,然后将此发夹结构置于小麦HMW-GS 1Dx5启动子的下游,从而构建了小麦wx-B1a基因的特异RNAi表达载体pBAC47p-wx-B1aIR。从而为下一步转化高产强筋小麦品种培育优质面条专用小麦奠定基础。 相似文献
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本研究以甘蓝型油菜湘油15种子不同发育时期抑制差减文库为研究对象,设计特异性引物扩增得到一个与油脂代谢相关,含MATH结构域的基因片段,长度为327bp,命名为BnMT-1。根据RNA干扰的基本原理,将目的片段正反向插入到表达载体pFGC5941.nap查尔酮内含子两侧,经限制性内切酶酶切和质粒PCR扩增检测,证明已成功构建了干扰载体PP-MT。采用根癌农杆菌法将PP-MT干扰载体转入甘蓝型油菜中,对转化植株基因组DNA的PCR检测表明,干扰载体已转入到甘蓝型油菜中,共获得了两株转基因植株。这为进一步研究BnMT-1基因在甘蓝型油菜中的功能打下了基础。 相似文献
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为了制备猪圆环病毒2型(PCV2)开放阅读框3(ORF3)蛋白的抗体,并为ORF3功能研究奠定基础,用PCR方法扩增PCV2 ORF3基因,对其PCR产物用EcoR I与Xho I进行酶切,并对真核表达载体pCDNA3.1(+)进行同样酶切,连接2种目的酶切产物后转化E.coli DH5?感受态,菌落PCR和序列测定结果显示成功构建出重组质粒pCDNA3.1-PCV2 ORF3。将该重组质粒接种BALB/c小鼠,用间接免疫荧光(IFA)检测小鼠血清PCV2 ORF3抗体的特异性及其效价。IFA结果证实经PCV2 ORF3重组质粒接种所制备的小鼠血清是PCV2 ORF3的特异性抗体,小鼠血清PCV2 ORF3抗体效价在经过4次接种后均达到1:25以上,表明,成功制备了具有较高效价的PCV2 ORF3抗体。研究结果提示,可以通过质粒DNA免疫方法来快速、简便地制备PCV2 ORF3抗体,为PCV2 ORF3抗体制备提供了一种新的有效途径。 相似文献
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采用PCR方法分别从玉米郑单958基因组DNA及RNA中克隆了菌根共生磷酸盐转运蛋白基因ZmPT6,序列分析表明,ZmPT6基因全长cDNA 1 665 bp,包括一个长97 bp的内含子;编码554个氨基酸,属于Pht1家族成员,由12个疏水的跨膜结构域组成.并构建了35S启动子驱动的植物正义、反义及RNAi表达载体,为下一步玉米的遗传转化及ZmPT6基因的功能研究奠定了基础. 相似文献
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葡萄病毒AMP基因RNA干扰载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
RNA干扰（RNAi）介导的植物抗病毒研究是近年来引起广泛关注的一项植物抗病毒基因工程策略。本文以GVA运动蛋白（MP）基因为模板扩增出了418 bp的基因片段,根据RNA干扰的基本原理,将目的片段正反向分别插入到载体pFGC5941内含子的两侧以便其转录过程中高效产生RNA发夹结构。经PCR扩增证明已成功构建以GVA MP基因为靶标的干扰载体pFGC5941-GVAFR,并成功转入农杆菌EHA105中,为后续探讨干扰载体的干涉效果奠定了基础。 相似文献
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根据烟草叶绿体高频同源重组片段的已知序列(GenBank Z00044.1)设计引物,用PCR的方法克隆到1个3.663 kb的番茄叶绿体DNA片段（psbD/trnG）,命名为ctDNA。该片段与GenBank中烟草的相应片段有96.7%同源性, 与本文所用的烟草的相应片段有95.8%同源性。以其为外源多顺反子定点整合介导的同源重组片段,与来自烟草叶绿体的强启动子Prrn和终止子psbA3’,以及甘露聚糖酶基因man、绿荧光蛋白基因gfp、氨基糖苷3’-腺苷酰基转移酶基因aadA构建番茄质体多顺反子定点整合表达载体pLM2(-psbD-Prrn-RBS-man-RBS-gfp-RBS-aadA-psbA3’-trnG-)。将该载体用基因枪轰击烟草叶片,用添加了壮观霉素的选择分化培养基筛选,获得质体转基因烟草3株。用PCR、激光扫描、Western Blot、RFLP等方法检测都证实man、gfp、aadA基因已整合到烟草质体基因组中,且均得到表达。用番茄质体多顺反子定点整合表达载体成功实现在烟草质体中的表达。 相似文献