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牡丹基因组AFLP银染反应体系的建立和优化 总被引：8，自引：1，他引：8
采用改进的SDS方法,从牡丹成熟叶片中提取基因组DNA,所得DNA样品的A260/A280值在1.7～1.8之间,琼脂糖凝胶电泳主带清晰、DNA纯度高、较少降解、不含酶反应抑制剂,可被MseⅠ和PstⅠ两种限制性内切酶完全酶切.通过酶切连接、预扩增、选择性扩增、银染等试验过程,成功建立了牡丹品种AFLP银染反应体系,得到了清晰的指纹图谱.对扩增结果进行聚类分析,得到了23个牡丹品种的聚类分析图. 相似文献
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黄瓜基因组DNA提取及AFLP体系优化研究 总被引：2，自引：1，他引：1
［目的］提取黄瓜基因组DNA,并对AFLP体系进行优化。［方法］以黄瓜嫩叶为材料,利用改进的CTAB法提取高质量的黄瓜叶片总DNA,通过优化酶切连接、预扩增、选择性扩增等试验条件建立适合黄瓜的AFLP银染体系,得到清晰的黄瓜AFLP指纹图谱。［结果］DNA 模板的质量影响酶切以及后续的连接扩增反应,改良的CTAB 提取法可用于黄瓜AFLP 分析,形成清晰的AFLP 指纹。优化的酶切连接体系为：以37 ℃酶切连接12 h为宜,酶切连接的基因组DNA用量为200 ng,预扩增时Taq酶用量为0.5 U/20 μl体系,预扩增产物稀释40倍作为选择性扩增的模板。在此优化的体系下引物E41M47扩增出清晰的条带。［结论］为黄瓜品种的分子标记和黄瓜品种间亲缘关系等研究奠定了基础。 相似文献
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[目的]该研究旨在初步建立适合于菠菜作物的AFLP反应体系。[方法]运用改良CTAB法提取6份菠菜品种的DNA,对AFLP反应体系中酶切连接、预扩、选扩等实验条件进行了优化分析。[结果]研究结果如下:(1)在PCR仪中酶切的效果比水浴的要好,酶切反应对酶切时间和DNA的浓度要求不敏感。(2)菠菜AFLP预扩选扩体系的反应体积为20μl,Mg2+(25mmol/L)1.2μl,dNTPs(2.5mmol/L)1.6μl,Taq-polymerase(5U/μl)0.2μl最佳。[结论]该研究建立的AFLP反应体系对与菠菜基因组分析时稳定有效的,该技术体系为菠菜品种亲缘关系的AFLP分子标记分析和遗传育种等提供一定的理论基础。 相似文献
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以玫瑰(Rosa rugosa)叶片为材料,利用改良的CTAB法,提取到了高质量的玫瑰叶片DNA,并建立了37个玫瑰品种和5个蔷薇品种的AFLP银染反应体系,首次在玫瑰DNA提取、酶切连接、预扩增、选择性扩增等实验过程取得了成功,得到了清晰的玫瑰品种的AFLP指纹图谱,为玫瑰基因库的建立、优良品种选育以及亲缘关系的系列研究奠定了理论基础. 相似文献
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枸杞属AFLP分析体系优化与建立 总被引：1，自引：0，他引：1
以枸杞属种质资源为试材,对AFLP分析过程中包括DNA的提取质量和浓度、Mse I/EcoR I以及T4 DNA连接酶的浓度、反应时间等影响因素进行了研究.建立了一种适于枸杞AFLP银染技术的优化体系.该体系中各优化因素为:模板DNA的用量为300～400 ng,酶切体系中Mse I和EcoR I各加入3 U,T4 DNA连接酶加入2.0U,采用酶切与连接在同一体系中一步完成,其酶切温度为37℃,反应时间为5 h.与22℃连接过夜.并对预扩增、选择性扩增和银染的效果进行了检测,以引物M+CAC/E+AGG构建了枸杞种质资源的AFLP指纹图谱,该图谱扩增带多,多态性强,且质量好. 相似文献
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小麦条锈菌AFLP体系的优化 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]优化小麦条锈菌AFLP体系。[方法]以小麦条锈菌大田混合菌系为材料,采用改良CTAB法提取DNA,探索酶切、PCR过程,优化小麦条锈菌AFLP体系,并从64对引物中筛选出稳定、高效的引物组合。[结果]改良CTAB法有较好的破壁效果,所提DNA纯度高,条带清楚,无污染,适合AFLP操作。酶切3.0、3.5 h的效果相同,扩出的片断在100~2 000 bp,可进行预扩。TaqDNA聚合酶为0.5 U时,电泳图中出现了较亮的条带,片断大小在100~2 000 bp。16对引物组合可以扩增出较稳定的条带。[结论]优化的小麦条锈菌AFLP体系为:25.0μl酶切体系,37℃酶切3.0 h,10.0μl连接体系在22℃条件下连接过夜,连接产物、预扩产物分别按1∶10、1∶30的比例用ddH2O稀释后用于预扩和选择性扩增。 相似文献
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紫薇叶片DNA的提取及AFLP反应体系的建立 总被引：10，自引：1，他引：9
以紫薇叶片为材料,利用改进的酚一氯仿法,提取到了高质量的紫薇叶片DNA,并建立了20个紫薇品种和南紫薇的AFLP银染反应体系,首次在紫薇DNA提取、酶切连接、预扩增、选择性扩增等实验过程取得了成功,得到了清晰的紫薇品种的AFLP指纹图谱,为紫薇基因库的建立、优良品种选育以及亲缘关系的系列研究奠定了理论基础． 相似文献
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板栗叶片DNA的提取及AFLP反应体系的建立 总被引：19，自引：1，他引：19
以初展开的板栗嫩叶为材料,利用改进的CTAB法,提取到高质量的板栗叶片总DNA。通过优化酶切连接、预扩增、选择性扩增等试验条件,建立了板栗AFLP银染反应体系,得到了清晰的板栗AFLP指纹图谱。为板栗品种的分子标记和板栗品种间亲缘关系等研究奠定了基础。研究结果表明:①DNA模板的质量影响酶切以及后续的连接扩增反应。以初展开的嫩叶提取的板栗叶片总DNA纯度最高,所含蛋白质、小分子杂质少,改良的CTAB提取法可用于板栗AFLP分析,形成清晰的AFLP指纹。②先进行酶切后再进行酶连的反应体系比酶切酶连一起进行的体系效果更好。板栗基因组DNA最佳酶切反应体系为:模板DNA总量500ng,反应体积为25μl,10×Y+/TanqoTMBuffer2.5μl,BSA0.8μl,EcoRI5U,MseI5U。连接反应体系中T4DNA连接酶浓度2U即达最佳效果。酶切、酶连反应最佳温度均为37℃。③以板栗为材料进行AFLP标记时,E AAC+M CAA、E AAC+M CAT和E AGT+M CAT三个引物均获得较好的多态性。其中以E AGT+M CAT引物组合的扩增条带信号强度一致性好,条带分布均匀,能够得到稳定、清晰、分辨率较高的指纹谱带,可进行中国板栗的遗传变异分析。 相似文献
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[目的]建立和优化华北落叶松（Larixprincipis-rupprechtii Mayr.）的AFLP反应体系。[方法]以华北落叶松为材料,对其AFLP分析过程中的5个主要影响因素（酶切时间、内切酶用量、DNA模板用量、连接产物和预扩增产物稀释倍数）进行了研究。[结果]确立了适于华北落叶松AFLP分析的最佳反应体系,即在反应体积均为20.0μl的前提下,酶切时间为7 h（37℃3.5 h;65℃3.5 h）,EcoRⅠ和MseⅠ内切酶用量均为1 U,DNA模板用量为3.0μl（50 ng/μl）,连接产物稀释10倍取5.0μl用于预扩增,预扩增产物稀释70倍取4.0μl用于选择性扩增。[结论]采用该体系得到的电泳条带清晰可辨、多态性好、重复性强,可用于对华北落叶松遗传多样性和分子进化特征的深入研究。 相似文献
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[目的]探索基于AFLP的拮抗链霉菌DNA模板制备方法及其扩增体系,为AFLP技术在链霉菌乃至放线菌资源分析中的应用提供依据。[方法]以改进的CTAB法提取DNA,利用Pst I／Mse I型AFLP试剂盒及其反应体系进行扩增,采用5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析扩增结果。[结果]提取了10个拮抗链霉菌菌株的基因组DNA,0.8％琼脂糖凝胶电泳检测显示其主带清晰,片段大小为37.64-40.86Kb,无降解现象,亦无RNA残留;其OD260/OD280为1.625-1.833;Pst I／Mse I双酶切产物琼脂糖电泳呈弥散荧光长带,说明酶解充分;筛选出的3对引物对DNA模板的扩增谱带清晰,多态性丰富。[结论]该研究建立的DNA模板制备方法及其扩增反应体系可用于链霉菌的AFLP分析。 相似文献
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燕山板栗叶片基因组AFLP反应体系建立 总被引：1，自引：0，他引：1
该文以燕山板栗嫩叶为材料,利用改良的CTAB法提取高质量的总DNA,通过优化了酶切连接、预扩增、选择性扩增等试验条件,得到了清晰的板栗AFLP指纹图谱.研究结果表明:① 应用经过改良的CTAB法可获得用于构建板栗AFLP体系的高质量DNA;②单独酶切和单独酶连体系比酶切酶连共体系效果更好,确定了板栗基因组DNA AFLP分子标记反应体系;③在所分析的9种引物组合中EAAC＋M-CAA、E-AAC＋M-CAT和E-AGT＋M-CAT 3个引物均获得较好的多态性.其中以E-AGT＋M-CAT引物对组合的扩增条带信号强度一致性好,条带分布均匀,得到了稳定、清晰、分辨率较高的指纹谱带. 相似文献
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柿AFLP银染技术体系的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
通过对各主要影响因素的研究,建立了适于柿AFLP分析的银染技术体系:酶切体系20μL总体积中含纯化后的DNA450ng,EcoRI和MseI各3U,37℃酶切4h;酶切完成后加入连接液,37℃连接10h(或过夜),然后65℃变性10min;连接产物稀释5倍用于预扩增,预扩增体系中EcoRI和MseI引物均不含选择性碱基;预扩增产物稀释5倍用于选择性扩增,选择性扩增体系中EcoRI和MseI引物均含3个选择性碱基,选择性扩增完成后,加入10μLLoadingbuffer,95℃变性10min,立即冰浴;取6 5μL变性后的选择性扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳,电泳完毕后,对胶板进行固定、脱色、水洗、银染、冲洗、显影、定影及干燥等银染程序。 相似文献
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[Objective] The aim of this study was to investigate the preparation method and amplification system of antagonistic streptomyces DNA templates based on AFLP assays, and also provide a basis for the application of AFLP technology in the analysis of streptomyces or even actinomyces. [Method] The DNAs were extracted by the modified CTAB method and amplified by the Pst Ⅰ/Mse Ⅰ AFLP kit and its reaction system. The amplified products were analyzed by the denatured polyacrylamide gel electrophoresis. [Result] The genomic DNAs of ten antagonistic strains of Streptomyces were extracted and tested. The result of 0.8% agarose gel electrophoresis showed that the major DNA bands were clear without degradation and RNA residue, with the fragment sizes ranging from 37.64 to 40.86 Kb. By ultraviolet spectrophotometry, the OD260/OD280 values varying from 1.625 to 1.833 were obtained. Furthermore, the agarose gel electrophoresis of DNA products digested by Pst Ⅰ/Mse Ⅰ presented the dispersed fluorescent long band, which indicated that the enzymatic hydrolysis was fully carried out. The amplified bands of DNA templates by the screened three pairs of primers were clear with rich polymorphism. [Conclusion] The preparation method and amplification system of DNA template established in this study can be used in the AFLP analysis of Streptomyces. 相似文献
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[目的]研究适于AFLP分析用的桃韧皮部DNA提取方法,为冬季无法获得幼叶和其他幼嫩材料时从事桃基因组研究打下了基础。[方法]以8种野生桃冬季1年生休眠枝的韧皮部为试验材料,采用改进的CTAB法提取基因组总DNA,与其相应幼叶DNA的提取效果进行了比较分析,并进行了AFLP验证分析。[结果]从野生桃韧皮部提取的DNA除产量低于幼叶外,DNA纯度和完整性都较好,OD260/OD280均为1.8~2.0,无降解现象,RNA去除干净,能被限制性内切酶完全消化,其AFLP分析条带清晰,多态性好。[结论]该法提取的野生桃韧皮部基因组总DNA完全适于AFLP分析。 相似文献