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1.
通过核酸类型试验、脂溶性敏感试验，鉴定了1株分离自四川某猪场腹泻病猪粪便的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）。经电子显微镜观察，可以看到大小约90nm的病毒粒子；通过中和试验，将病毒细胞液与TGEV超免疫血清进行中和反应，显示较高的中和抗体效价。根据GenBank中的TGEV序列，设计了1对包含TGEVS基因1760bp部分片段的引物，经RT-PCR扩增获得了1条约1．8kb的条带，通过低熔点琼脂糖凝胶纯化回收该片段后，将其连接在pMD18-T载体上，转化DH5a大肠埃希氏菌。用双酶切和PCR对重组质粒进行鉴定并测序，经用DNAStar软件进行同源性分析和多重序列比较，TGEV四川株（SC-A）与国外报道的部分TGEV分离株具有高达98．8％的同源性。 相似文献
2.
肾型禽传染性支气管炎病毒（IBV）Z株S1基因的结构与变异 总被引：12，自引：2，他引：10
利用1对pUC质粒通过测序引物和3条合成引物，通过步黎法完成了肾型IBV Z株S1基因全部序列测定。所测序列已被GENBANK收录，收入号为AF140352，该片段全长1747bp，含有1个无终止子的阅读框架，编码558个氨基酸，与IBV－Beaudette株S1基因序列比较，同源性为77％，并出现部分碱基的缺失与重组，无BamH Ⅰ，EcoRⅠ酶切位点，PstⅠ位点也未出现，氨基酸同源性为74％。 相似文献
3.
上海株犬冠状病毒的分离鉴定及S基因的遗传进化分析 总被引：1，自引：0，他引：1
利用A72细胞(犬纤维肉瘤细胞系)从上海市某宠物医院临床表现为急性胃肠炎症状的幼犬腹泻粪便中分离到1株病毒,通过噬斑纯化、病毒理化特性检测以及动物回归实验和RT-PCR鉴定,证明所分离到的病毒为犬冠状病毒(Canine coronavirus,CCV),将其命名为CCV-SHdc株。根据Gen Bank公布的CCV S基因序列,设计合成4对特异性引物,利用RT-PCR成功扩增获得CCV-SHdc株S基因序列,同时进行序列测定和核苷酸系统发育进化树绘制。结果显示,CCV-SHdc株的S基因序列全长4 364 bp;该毒株与日本分离的CCV 5821株亲缘关系最近,处于同一分支,与意大利分离的CCV 23/03和CCV Elmo/02株亲缘关系较远。核苷酸与氨基酸同源性分析表明,CCV-SHdc株与CCV 23/03和CCV Elmo/02株可能属于不同基因型,已有很多点发生突变,这种突变的累积有可能引起病毒毒力的变化。 相似文献
4.
采用蔗糖密度梯度离心,纯化浓缩犬冠状病毒(CCV)、猫冠状病毒(FCV)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪呼吸道冠状病毒(PRCV)的细胞培养物,分别设计7,17,11,10和4对引物,构建了49个基因片段的克隆。煮沸裂解法制备质粒DNA,回收PCR扩增产物,点制冠状病毒基因芯片。抽提病毒总RNA,利用Cy3-dCTP随机渗入反转录PCR标记,与芯片进行杂交检测,淘汰交叉的克隆片段。结果表明:克隆CCV1,CCV2,CCV5和CCV7可特异诊断CCV,克隆FCV6,FCV7,FCV8和FCV9可特异诊断FCV,克隆FIPV2,FIPV7,FIPV8和FIPV9可特异诊断FIPV,克隆PRCV1,PRCV2和PRCV3可特异诊断PRCV,克隆TGEV3,TGEV4,TGEV5和TGEV6可特异诊断TGEV。将这些特异克隆扩增片段重新点制基因芯片,与病毒PCR产物杂交,未发现交叉现象。基因芯片检测比传统PCR敏感1000倍,可有效应用于这5种动物冠状病毒的检测与区分。 相似文献
5.
犬冠状病毒纤突蛋白基因的序列测定与比较分析 总被引：1，自引：0，他引：1
将丙株犬冠状病毒国内分离毒CCVYS1，CCVCI1接种于CCV中和抗体效价低于1：4的2月龄幼犬，观察接种犬临床表现，体温和剖析变化。结果表明，CCVYS1株毒力较强，CCVCI1株毒力较弱，采用RT-PCR方法扩增出两株病毒部分S基因序列，克隆于pUC19SmaI位点或pGEM-T载体中，以双脱氧末端终止法测定插入质粒的cDNA核苷酸序列。用PROSIS计算机软件推导氨基酸序列，并与从Genbank上查到的CCV，TGEV和FIPV相应氨基酸序列进行多重比较。分别推测，CCVS蛋白上Ac抗原位点的氨基酸残基可能是影响病毒毒力的因素之一。 相似文献
6.
猪传染性胃肠炎病毒河北分离株核衣壳N蛋白基因的克隆与序列分析 总被引：2，自引：0，他引：2
采用RT-PCR技术扩增了TGEV河北分离株的N基因,长度约为1 149 bp. 将该基因片段进行亚克隆重组到pMD18-T质粒载体上,连接转化,鉴定后得到阳性重组质粒pTN.对重组质粒插入的目的基因片段进行序列分析和比较,结果表明TGEV河北分离株N基因与国外的Purdue-115、FS772/70、TO14、96-1933株有≥95%的同源性;推导的氨基酸序列同源性≥95%.TGEV N基因的克隆及序列分析,为其蛋白质的表达分析提供了重要依据,也为进一步讨论该病毒的分子生物学特性奠定了理论基础. 相似文献
7.
伪狂犬病病毒闽A株gE基因去信号肽片段的克隆与序列测定 总被引：1，自引：0，他引：1
根据已经发表的伪狂犬病病毒（PRV）Rice株的gE基因序列,设计并合成了1对引物,通过PCR方法扩增到了PRV闽A株糖蛋白gE基因除信号肽以外的全部编码区段,并克隆到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌XL1-blue菌株,重组质粒pMD18-T-FL经酶切和PCR鉴定证实后,进行了序列测定。结果表明,重组质粒pMD18-T-FL含有PRV闽A株糖蛋白gE基因除信号除信号肽以外的全部编码区段,长1674bp。序列比较分析表明,此区段与PRV Rice株相应区段的核苷酸序列同源性为97．5％,氨基酸序列同源性为94．8％。 相似文献
8.
根据猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)纤突(S)蛋白的全基因序列及表达载体质粒的基因融合特点,设计一对引物,进行PCR,获得含有TGEV S基因4个主要抗原位点的约2000 bp目的片段,将其分别与表达载体质粒pPG611.1和pPG612.1进行连接,通过电转化进入宿主菌Lacto-bacillus casei393细胞内,通过质粒提取、PCR鉴定、酶切鉴定和序列测定分析,表明TGEV S基因已成功插入到表达载体质粒中,获得了TGEV S蛋白干酪乳杆菌表达载体系统。 相似文献
9.
《黑龙江畜牧兽医》2020,(1)
为了鉴定藏香猪源传染性胃肠炎病毒(TGEV)BT-1株及分析S基因序列遗传特点,试验采用ST细胞培养法、RT-PCR法、直接免疫荧光(FA)试验、S基因序列分析等对从患腹泻藏香仔猪小肠内容物中分离得到的病毒株(BT-1株)进行鉴定。结果表明:BT-1株被鉴定为TGEV,大小约为1 215 bp;在荧光显微镜下,TGEV显示特异性荧光;BT-1株与SHXB株、TH-98株、 JS2012株S基因序列的同源性达100%,与Purdue株、Miller M6株、Purdue P115株等9株参考株S基因序列的同源性在97.1%～99.0%之间;BT-1株与SHXB株、TH-98株亲缘关系较最近,位于同一分支,与其他分离株亲缘较远;BT-1株S基因序列与国内分离的TGEV参考毒株序列相比,未发生明显变异。说明分离得到的TGEV BT-1株与GenBank中登录的9株TGEV参考株S基因序列的同源性较高,S基因序列未发生变异。 相似文献
10.
根据发布的7种动物冠状病毒相关基因的序列,给每种病毒设计了4～17对引物,同时依据RNA聚合酶基因序列合成了l对兼并引物,利用TCV原毒和纯化浓缩的CCV、FCV、FIPV、TGEV、PRCV、BCV细胞毒,构建了89个基因片段的克隆.采用煮沸裂解法制备质粒DNA,进行特异引物PCR扩增,回收纯化产物,点制冠状病毒基因芯片.抽提病毒总RNA,利用Cy3-dCTP随机渗入反转录PCR标记,同时对BCV、CCV利用Cy3-dCTP随机渗入反转录标记,与芯片进行杂交检测.结果显示,BCV和TCV基因克隆间未见交叉,CCV、FCV、FIPV、TGEV、PRCV则存在广泛交叉.选择无交叉的特异克隆片段点制最终基因芯片,并与病毒多重PCR扩增产物杂交,芯片信号未见交叉,结果判断明确.表明,基因芯片检测法比传统PCR法敏感1000倍. 相似文献
11.
携带猪呼吸道冠状病毒S基因片段的重组腺病毒的构建及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
利用RT-PCR技术扩增猪呼吸道冠状病毒(Porcine respiratory coronavirus,PRCV)AR310毒株的S基因主要抗原位点片段,构建了重组腺病毒中间载体pDNR-1r-S1和表达质粒pInt.AV1.SpaT-S1。采用Cre-LoxP同源重组腺病毒系统和共转染技术构建了携带PRCV S基因片段的复制缺陷型重组腺病毒,经目的基因PCR检测和序列测定,结果表明:PRCV S基因片段已正确地插入到腺病毒基因组中;Western blot和间接免疫荧光实验证明目的片段在HEK293细胞中成功地获得了表达;子代重组腺病毒Ad5-PRCVS1的滴度为7×107 TCID50/mL。携带PRCV S基因片段重组腺病毒的构建为PRCV和TGEV重组腺病毒新型疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
12.
鸭疫里默氏菌16S rDNA基因的PCR-RFLP 分析 总被引：4，自引：0，他引：4
鸭疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer，RA）是危害养鸭业的一个重要细菌。100年来，对该菌的分类和鉴定多依赖于培养特性、形态染色反应、生理生化特征、菌体的某些化学组成等表型指标。但是，RA常缺乏而不是拥有特定的表型特征，如在一些培养基上不生长、不发酵糖类等。不同研究者对RA的生化检测结果不尽一致，基于细胞脂肪酸等化学组成的分类也缺乏统一的判断标准，特别是RA在一些表型特征上与其他一些细菌既相似又不同，致使RA的分类位置长期未能确定，也导致在鉴定分离株时常缺乏足够的指标。 相似文献
13.
14.
参考GenBank中禽呼肠孤病毒S3基因序列设计一对引物,以禽呼肠孤病毒内蒙古分离株(C-98)基因组RNA为模板,应用RT-PCR方法获得病毒的S3基因,并克隆到pMD19-T载体后测序。应用计算机软件将所测定序列与参考毒株ARV 176、ARV S1133、ARV 138的S3基因序列进行比较,核苷酸同源性分别为99.8%,99.6%,87.7%,推导其氨基酸同源性分别为99.5%,98.9%,94.8%。应用PHD程序和DNAStar软件,对S3基因所编码的σB蛋白结构进行预测,结果表明,σB蛋白为结构紧密的球状蛋白分子。 相似文献
15.
鸭疫里默氏菌16S rDNA基因的单链构象多态性分析 总被引：2，自引：0，他引：2
鸭疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer,RA）可导致较高的死亡率和淘汰率,其流行给我国养鸭业造成了巨大的经济损失.对该病的准确诊断依赖于细菌的分离和鉴定.以往鉴定RA时,常检测其培养特性、形态染色反应、生理生化特征、菌体的某些化学组成等表型指标,但RA常缺乏特定的表型特征,迄今还没有建立起选择性的培养基,不同学者检测RA生化反应的结果也不一致.此外,在表型上RA与某些细菌还很相似,因此,仅依据表型却不足以对RA做出准确鉴定,故建立检测RA的分子生物学方法十分必要. 相似文献
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基于18S rRNA基因测序基础上的锥虫分子分类学 总被引：2，自引：0，他引：2
利用18S rRNA基因序列分析方法,对我国湖北、广西、新疆和浙江4省的伊氏锥虫及1株布氏锥虫进行分子分类学研究.用分离的锥虫感染实验动物,自感染小鼠的红细胞或全血中提取基因组DNA,根据GenBank中已发表的雏虫18S rRNA序列设计1对锥虫通用引物,通过PCR扩增目的基因片段,将扩增产物连接到pGEM-T载体中,经酶切、PCR确定,进行序列测定.结果显示,7个锥虫分离株的18S rRNA基因大小为2 188 bp.利用DNAS-tar对试验所获得的这7株锥虫和GenBank中部分锥虫的18S rRNA基因进行比较分析,建立2个进化系统发生树.核苷酸同源性比较及系统发生树显示:自我国上述4省分离的伊氏锥虫来源于同一株系,布氏锥虫和广西分离的伊氏锥虫株的18S rRNA核苷酸与其他锥虫分离株仅有较小差异,与国外的6株锥虫的同源性为99%～100%,与另外7株的同源性为62%. 相似文献
17.
根据已报道的传染性支气管炎病毒S基因序列设计了1对引物，利用从传染性支气管炎病毒TY1株中提取的RNA，经PCR扩增获得了300bp的产物；序列测定与分析表明，所扩增产物是传染性支气管炎病毒结构蛋白基因的部分片段。将扩增片段插入pET32a构建表达载体，并于大肠埃希氏菌BL21中进行表达；结果表明，该片段在大肠埃希氏菌中成功表达，产物为30ku、以可溶性形式存在的蛋白。Western—blotting分析表明，该蛋白可与传染性支气管炎病毒TY1株阳性血清发生反应。 相似文献
18.
对鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)肾型毒株BJQ、BJS、BJY、SDW和HBN的S1全基因进行了扩增、克隆和序列测定,并将所分离毒株的S1基因序列与5个参考毒株进行了比较.结果表明,IBV分离株S1基因间核苷酸同源性在76.7%～92.1%之间,氨基酸同源性在73.9%～89.5%之间.氨基酸序列特征分析表明,S1基因多处存在突变、缺失和插入现象,其中在氨基酸69～81和142～150位点区出现较高的变异.系统进化树分析表明,除SDW株与Gray属于相同的进化分支外,其他国内肾型分离株属于同一个进化分支,而韩国、日本等亚洲分离株和美洲分离株分别属于其他不同的进化分支,说明IBV病毒的发生和流行与地域及所致病型有一定的相关性. 相似文献
19.
《中国兽医学报》2017,(12):2294-2299
本研究对分离的1株猪流行性腹泻病毒(PEDV)的S基因进行克隆和测序,并进行生物信息学分析。通过ORF3序列分析发现,未有核苷酸的缺失,推测为PEDV野毒株。S基因分析结果表明,该毒株(以GD/JMEP表示)与经典的CV777毒株亲缘关系较远,核苷酸同源性为93.2%,存在多个氨基酸的缺失、插入或者突变;与近几年广东流行的PEDV毒株处于同一个群,亲缘关系较近;相比于经典传统毒株,GD/JMEP株在S基因的几个位点存在核苷酸的缺失或者插入;与目前流行毒株比较,在S基因的406位点存在新的突变。通过氨基酸序列比对分析,GD/JMEP株发生了6个新的氨基酸位点突变,表明本试验检测的GD/JMEP株为目前广东PEDV流行毒株。 相似文献
20.
《中国兽医学报》2016,(2):196-199
本研究利用生物信息学软件对TGEV S基因进行分析,筛选出可能与S基因有相互作用的外源miRNA:amiRNA-S-28035、amiRNA-S-28038、amiRNA-S-28165。利用脂质体将构建好的相应表达载体瞬时转染至PK-15细胞;通过Q-PCR和间接免疫荧光方法检测其对S基因的抑制作用;CPE分析和TCID50测定检测其对TGEV增殖的抑制效果。结果发现,3个外源性miRNA均降低了S基因mRNA的转录和蛋白的表达,其中amiRNA-S-28038对TGEV mRNA的平均抑制率可达64.6%,最高可达69.9%,表明外源性microRNA可以通过靶向TGEV基因组来抑制TGEV的复制。研究结果为猪传染性胃肠炎的预防和治疗提供了新的思路。 相似文献