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1.
【目的】克隆拟黑多刺蚁(Polyrhachis vicina Roger)5-HT2A受体基因的cDNA序列,并对其核苷酸序列和系统进化进行分析,检测其在拟黑多刺蚁不同发育阶段幼虫和不同品级成虫mRNA的表达情况,为探究5-HT2A受体基因对拟黑多刺蚁生长发育的调控规律提供证据。【方法】从拟黑多刺蚁中提取总RNA,RT-PCR扩增并克隆Pv5-HT2A受体基因;用ProtParam预测蛋白质序列,Blast比较蛋白质序列同源性,用Clustal X进行核酸和氨基酸序列比对,MEGA 6.0比邻法生成系统进化树。利用荧光实时定量PCR检测Pv5-HT2A受体基因在拟黑多刺蚁不同发育阶段幼虫及不同品级成虫mRNA的表达水平。【结果】克隆得到Pv5-HT2A受体基因的cDNA序列,全长2 965bp,开放阅读框长1 926bp,编码641个氨基酸。疏水性分析显示,Pv5-HT2A受体氨基酸具有7个跨膜疏水区,属于典型的G蛋白偶联受体类型。系统发育分析表明,拟黑多刺蚁与红收获蚁的亲缘关系最近,相似度达69%。荧光实时定量PCR结果显示,拟黑多刺蚁5-HT2A mRNA在不同发育阶段和不同品级成虫中均有表达,其中卵、3龄幼虫及蛹期的表达量较高;成虫中,雄蚁表达量最高,雌蚁的表达量最低。【结论】拟黑多刺蚁与其他昆虫的5-HT2A受体基因存在相关性,推测5-HT2A受体基因对拟黑多刺蚁的生长发育具有一定调节作用。 相似文献
2.
细胞色素P450在昆虫对外源物质代谢中发挥重要作用,是昆虫重要的解毒酶系。CYP4家族是昆虫细胞色素P450基因家族中的重要分支,与昆虫的解毒代谢密切相关。为初步明确CYP4家族基因在二化螟中的表达信息,本文测定分析了二化螟两种P450基因CsCYP4M38和CsCYP4M39的序列同源性及时空表达谱,序列同源性分析发现CsCYP4M38与烟草天蛾MsCYP4M2氨基酸序列同源性最高,序列一致性高达56.86%;CsCYP4M39与烟草天蛾MsCYP4M1氨基酸序列同源性最高,序列一致性高达59.96%,构建系统发育树显示,CsCYP4M38与CsCYP4M39属于CYP4家族,且分别与MsCYP4M2和MsCYP4M1进化距离较近;时空表达谱测定结果表明,两种基因在不同发育阶段和不同组织中的表达存在差异性,CsCYP4M38在2龄幼虫、5龄幼虫及雌成虫内表达量相对较高,在1龄幼虫中表达量最低,CsCYP4M39在幼虫期表达量相对较高,且表达量随龄期增加呈现先上升后下降的趋势,在卵、蛹及成虫中表达量相对较低。CsCYP4M38和CsCYP4M39在脂肪体、中肠及表皮中的表达量相对较高,且均在脂肪体内的表达量最高。明确基因表达谱是研究其功能的基础,CsCYP4M38和CsCYP4M39在不同阶段的表达量具有一定的变化性,说明这两种基因在二化螟不同发育历期中的功能不同,而两种基因均在脂肪体中表达量最高,这可能与脂肪体是昆虫的主要的解毒代谢场所有关。 相似文献
3.
【目的】昆虫气味受体（odorant receptors, Ors）在其发挥嗅觉识别过程中采用的是配体门控离子通道信号传导机制,这一离子通道是由一个特定的共受体与一个普通气味受体结合为异源二聚体而形成的。其中,气味共受体（odorant receptor coreceptor, Orco）是一个十分独特的家族,在不同种类昆虫中高度保守,并在调控昆虫的嗅觉行为方面发挥关键作用。论文在对中华蜜蜂（Apis cerana cerana,简称中蜂）工蜂Orco研究基础之上,进一步探讨雄蜂Orco的表达特性。【方法】采集中蜂1日龄雄蜂的触角、头（去除触角）、胸、腹、足5部分组织,以及不同发育阶段的幼虫、蛹及成蜂触角。提取各样本的总RNA,利用real-time quantitative PCR（qPCR）技术鉴定Orco在雄蜂不同组织及不同发育时期的表达谱;采集1日龄雄蜂触角制备冰冻切片,合成地高辛标记的寡核苷酸探针,利用原位杂交技术对Orco在雄蜂触角中的表达进行细胞定位分析。【结果】qPCR分析结果表明,Orco转录本在不同组织中的表达量表现为触角>头>足>腹>胸,其中触角表达量约为头部的100倍;Orco在雄蜂不同发育阶段均有表达,其中幼虫期和蛹期表达量较低,羽化后开始逐渐升高,性成熟后维持在一个较高的水平。此外,结合前期工蜂荧光定量试验数据,分析得到Orco在雄蜂触角中的表达量极显著高于工蜂触角表达量（P＜0.01）。原位杂交结果显示,Orco阳性杂交信号大量表达于雄蜂触角的板型感器和毛型感器的神经元细胞中。【结论】气味受体基因Orco在中蜂雄蜂的触角中大量表达,且在性成熟后表达量达到高峰。结合前期研究结果,推测Orco在中蜂中是偏雄性表达的。 相似文献
4.
家蚕microRNA 7靶基因Bmhairy的鉴定和转录表达模式 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】microRNA是一类长约22个碱基的非编码RNA,通过与其靶基因的特异性结合来调控新陈代谢和生长发育等多种生命活动。鉴定家蚕(Bombyx mori)Bmhairy,比较Bmhairy和bmo-miR-7的表达模式,验证Bmhairy是否为bmo-miR-7的靶基因,为研究家蚕的变态发育机制提供线索。【方法】 用家蚕胚胎反转期的总RNA反转录合成的cDNA模板,克隆Bmhairy编码区（coding DNA sequence,CDS）和3′端非翻译区（3′ untranslated region,3′UTR）并进行序列分析。基于荧光定量PCR和芯片数据比较bmo-miR-7和Bmhairy的表达模式。利用RNAhybrid和MiRTif,预测和分析Bmhairy的mRNA 3′UTR上bmo-miR-7的靶位点。构建荧光素酶报告基因载体,用家蚕胚胎细胞系（BmE）进行共转染试验,验证bmo-miR-7对Bmhairy的3′UTR结合位点。【结果】 在家蚕中克隆了Bmhairy,含2个内含子和3个外显子,CDS长654 bp,编码217个氨基酸。Bmhairy的mRNA 3′UTR长366 nt。Bmhairy高度保守,含有bHLH、ORANGE和WRPW结构域。Bmhairy与鳞翅目（Lepidoptera）蛱蝶科（Nymphalidae）中的黑脉金斑蝶（Danaus plexippus）相似度最高。Bmo-miR-7在家蚕胚胎期高量表达,在5龄第3天的精巢中相对较高,而Bmhairy在成虫期的表达量最高,在5龄第3天的头部相对较高。Bmhairy mRNA 3′UTR上有bmo-miR-7一个靶位点。共转染试验表明,bmo-miR-7下调Bmhairy。【结论】Bmhairy的家蚕时期表达和5龄第3天组织表达均与bmo-miR-7的表达呈相反的模式。靶基因预测和双荧光素酶转染试验表明Bmhairy是bmo-miR-7的靶基因,为进一步研究bmo-miR-7和Bmhairy在家蚕体内的生物学功能及调控关系提供了依据。 相似文献
5.
【目的】分析家蚕(Bombyx mori)丝氨酸蛋白酶基因BmSP141序列信息,明确其时空表达模式,结合饥饿与重新喂食处理对其表达的影响,探究该基因在家蚕中的功能。【方法】对家蚕丝氨酸蛋白酶基因BmSP141进行T-A克隆,得到其编码区核苷酸序列;应用生物信息学在线网站对该基因编码区推导的氨基酸序列、分子量、结构域等信息进行分析;利用ClustalX1.8和MEGA5.02软件对BmSP141与其他物种的丝氨酸蛋白酶进行多序列比对和系统发生树分析;构建原核表达载体p28-BmSP141,并转化到Rosetta（DE3）菌株中诱导表达,利用镍柱亲和层析纯化重组蛋白。利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR方法对其组织和时期表达特征进行分析;采用蛋白质免疫印迹（Western blot）技术,分别分析BmSP141蛋白在家蚕5龄第3天各组织的表达情况和5龄幼虫中肠的表达变化;通过免疫荧光定位分析BmSP141蛋白在4龄幼虫中肠的分布情况;利用实时荧光定量PCR和Western blot方法对饥饿处理和再喂食后BmSP141的表达情况进行分析。【结果】BmSP141编码含有292个氨基酸的蛋白,其中第1-17位氨基酸为信号肽,其成熟体蛋白预测分子量为25.9 kD,等电点为7.8。同源序列比对表明,BmSP141与烟芽夜蛾丝氨酸蛋白酶和蓓带夜蛾丝氨酸蛋白酶序列同源性较高,分别达到62%和63%。这些同源序列具有保守的催化三联体,与活性相关的基序也很保守,但与胰凝乳蛋白酶保守的底物特异性位点相比,BmSP141的底物特异性位点发生改变。在16和37℃条件下诱导后,重组蛋白均以包涵体形式表达,经镍柱亲和层析纯化后得到了较纯的重组蛋白,并用该蛋白制备了效价较高的多克隆抗体。组织和时期表达特征分析表明,该基因主要在家蚕幼虫的中肠组织特异性表达, 且在幼虫起蚕到食桑期表达逐渐增加,但眠期表达下降,蛹期和成虫期表达水平较低。Western blot分析也表明,BmSP141蛋白仅在家蚕中肠组织表达,且从5龄起蚕到上蔟表达量先增加后降低。免疫荧光定位结果表明,BmSP141定位于中肠上皮细胞的细胞质中,进一步证实BmSP141在中肠特异表达。在转录和翻译水平,BmSP141饥饿处理后表达量显著下调,而重新喂食后其表达量上调,表明BmSP141的表达受到消化道食物的诱导。【结论】家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP141在中肠组织表达,在幼虫期食桑期高表达,蛹期和成虫期表达水平较低,受消化道食物的诱导而上调表达,推测该基因可能参与家蚕中肠的消化过程。 相似文献
6.
桃小食心虫鱼尼丁受体基因克隆及表达模式分析 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】二酰胺类杀虫剂的作用靶标鱼尼丁受体（ryanodine receptor, RyR）是目前所知的最大的离子通道蛋白,该受体可控制细胞内Ca2+的释放,对细胞内Ca2+的稳定起着关键作用。克隆获得桃小食心虫鱼尼丁受体基因（CsRyR）全长序列,进一步解析该基因在桃小食心虫(Carposina sasakii)各发育阶段的表达模式。【方法】通过同源序列比对的方法,利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）获得该基因的全长cDNA序列;应用生物信息学软件对该基因的开放阅读框、编码的氨基酸序列、功能结构域等信息进行预测分析,并基于最大似然法构建该基因与其他昆虫相关基因序列的系统发育树,明确其系统进化关系。分别提取桃小食心虫各发育阶段RNA,以GAPDH为内参基因,应用RT-qPCR技术,解析CsRyR在桃小食心虫各发育阶段（卵、幼虫、蛹和成虫）的表达模式。【结果】桃小食心虫CsRyR的cDNA全序列长度为15 766 bp,开放阅读框15 405 bp,编码5 134个氨基酸。氨基酸序列比对结果显示,CsRyR与脊椎动物RyRs的一致度分别为45%-47%;与秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）RyR的一致度也为46%。在昆虫RyRs中,与鳞翅目一致度为91%-94%,与同翅目、双翅目昆虫一致度均为79%。系统发育树显示该基因编码的蛋白质与鳞翅目夜蛾科和螟蛾科害虫RyRs亲缘关系最近。结构域分析结果显示,CsRyR具有RyR的典型结构域,如位于C-末端的6个跨膜结构域（AA 4 467-5 029）、释放Ca2+的通道形成基序GVRAGGGIGD、Ca2+结合位点EF-hand和3个ATP结合位点GXGXXG等。二酰胺类杀虫剂可能的作用位点AA 183-290（BmRyR）,AA 4 610-4 655（DmRyR）和4 946G（PxRyR）在CsRyR中无特殊性。此外,CsRyR中存在AA 2 490- 2 496 TQAPRPG和5 131-5 134 SQAK两个基序,在其他物种中均没有发现。RT-qPCR分析结果表明,CsRyR在蛹期表达量最高,分别是1日龄卵、6日龄卵、初孵幼虫、老熟幼虫和成虫的25.19、7.73、6.48、4.74和3.58倍。【结论】克隆了CsRyR基因全长cDNA序列,证明其表达具有发育阶段特异性。 相似文献
7.
【目的】克隆绿盲蝽（Apolygus lucorum）TRPA1基因,明确其在成虫不同组织中的表达分布,研究绿盲蝽TRPA1基因的功能,阐明绿盲蝽感受温度的分子基础。【方法】在绿盲蝽转录组测序的基础上,通过生物信息学方法分析转录组数据,得到编码绿盲蝽TRPA1基因的cDNA序列片段。根据已知的cDNA序列,设计引物。采用RT-PCR及RACE（rapid-amplification of cDNA ends）技术克隆TRPA1基因的全长序列,并通过DNAMAN软件及BLAST分析测序结果。测序正确后,使用在线工具SMART及TMpred预测TRPA1蛋白的锚蛋白重复序列（Ankyrin repeats）及跨膜结构域序列。通过序列比对,构建昆虫TRP（transient receptor potential）通道的家族进化树,分析绿盲蝽TRPA1与其他物种同源基因的相似性及进化地位。以GADPH为内参基因,利用RT-PCR检测绿盲蝽TRPA1在成虫触角、头、喙、足、腹等不同组织中的相对表达量。通过爪蟾卵母细胞体外表达结合双电极电压钳记录技术研究绿盲蝽TRPA1对温度刺激的反应。【结果】通过绿盲蝽转录组数据预测得到TRPA1基因的4个cDNA序列片段,经过RT-PCR及RACE技术克隆得到了绿盲蝽TRPA1的全长序列,并命名为AlucTRPA1。AlucTRPA1开放阅读框全长3 672 bp,编码1 223个氨基酸。通过在线工具SMART及TMpred预测分析结果表明,AlucTRPA1含有16个锚蛋白重复序列结构及6个保守的跨膜结构域。序列比对及进化树分析结果显示,昆虫TRPA家族包含TRPA1、Painless、Pyrexia及Water witch,AlucTRPA1属于昆虫TRPA1亚家族。AlucTRPA1与其他昆虫的同源基因具有很高的相似性,特别是与同属半翅目的豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）的同源性高达65.1%。成虫组织表达谱分析结果表明,AlucTRPA1在成虫触角中的表达量最高,头、喙、足、腹中也都有表达。爪蟾卵母细胞体外表达结合双电极电压钳记录结果表明20℃至40℃逐渐上升的温度可以直接激活AlucTRPA1通道,且两次连续重复的温度刺激未引起AlucTRPA1通道的钝化。【结论】AlucTRPA1在绿盲蝽成虫的触角、头等组织中均有表达,且在爪蟾卵母细胞表达的AlucTRPA1能被20℃至40℃逐渐上升的温度刺激直接激活,推测AlucTRPA1在绿盲蝽体内是直接的温度感受器,参与调控绿盲蝽对生活环境温度的感知行为。 相似文献
8.
【目的】利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统超量表达家蚕（Bombyx mori）let-7 簇（cluster）microRNAs：bmo-let-7、bmo-miR-100和bmo-miR-2795,为研究家蚕microRNA的功能提供参考。【方法】克隆家蚕let-7 miRNA簇（bmo-let-7 cluster,bmo-let-7-C）上各miRNA前体(pri-let-7、pri-miR-100与pri-miR-2795)和bmo-let-7-C全长序列,以红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)基因为报告基因,昆虫细胞表达载体pFastBac1为穿梭载体,通过Tn7转座子把目的基因和报告基因转座到杆状病毒A. californica nucleopolyhedrovirus (AcNPV)基因组上,获得各重组杆状病毒质粒（recombinant baculovirus plasmid,rBacmid）：Bac-let-7、Bac-miR-100、Bac-miR-2795和Bac-let-7-C。将重组Bacmid转染草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）卵巢细胞系Sf9,72 h后用荧光显微镜检查红色荧光蛋白信号,荧光定量PCR检测miRNAs的表达。对转染的Sf9细胞进行、离心、收集上清液,获得具感染力的重组病毒,用于侵染新培养的Sf9细胞和注射家蚕幼虫个体,72 h后用荧光显微镜检查红色荧光蛋白信号,荧光定量PCR检测miRNAs的表达。【结果】成功将bmo-let-7-C上各miRNA前体和bmo-let-7-C全长序列构建到杆状病毒基因组上,获得了各miRNA及bmo-let-7-C的过量表达载体。将各重组过量表达载体分别转染草地贪夜蛾细胞系Sf9,72 h后在显微镜下观察到了红色荧光蛋白信号,荧光定量PCR检测结果表明各miRNA显著过量表达;通过离心收集的各miRNA重组过量表达病毒粒子感染新培养的Sf9细胞72 h后检测到了更强的红色荧光蛋白信号,定量PCR结果表明各miRNA均显著过量表达。将各miRNA的重组病毒注射到家蚕5龄1 d幼虫体内后,均能显著超量表达相应miRNA,但注射Bac-let-7-C后只有miR-2795显著过量表达,并有明显的组织差异性,在丝腺中没有过量表达,在脂肪体、血液和中肠中显著过量表达。【结论】利用杆状病毒过量表达系统在草地贪夜蛾细胞系Sf9和家蚕个体中超量表达了家蚕let-7簇miRNAs,为研究家蚕let-7簇和其他miRNAs的产生机制和功能提供了参考。 相似文献
9.
【目的】克隆家蚕卵黄原蛋白受体（vitellogenin receptor, VgR）,分析其在昆虫细胞中的表达特征,了解正常VgR和突变VgR的表达模式,为阐明其生物学功能提供参考依据。【方法】基于家蚕VgR的基因编码序列设计特异引物,扩增的目的片段连接到载体pET28a上,构建原核表达载体,转化E. coil BL21（DE3）表达菌株,IPTG诱导获得目的蛋白;用镍柱亲和层析方法纯化诱导表达的家蚕VgR肽蛋白;将纯化后的肽蛋白制备BmVgR的兔源多克隆抗体;PCR扩增获得大造和突变型白妙卵（scanty vitellin,vit）的LBD1+EGF1结构域（C11D和C11V）片段,连接到细胞表达载体上,通过细胞转染表达目的蛋白,采用细胞免疫组化检测大造和突变型vit的VgR在细胞里的表达情况;通过Western blot检测细胞培养液中大造和突变型vit VgR的表达量。【结果】原核表达获得了一个大小约为22 kD的融合蛋白,以包涵体形式表达;镍柱亲和层析初纯化得到BmVgR的肽蛋白,进一步切胶纯化后,以此为抗原制备BmVgR的兔源多克隆抗体,其抗体效价＞1﹕512 000,纯度为95%以上。转录水平检测表明Sf9和Spli221昆虫细胞中没有BmVgR和BmVg内源基因的表达;在Sf9昆虫细胞中成功表达了家蚕野生型和突变型vit BmVgR的结构域SP+LBD1+EGF1肽段,家蚕突变型vit在BmVgR第1个表皮生长因子同源区域的第3个ClassB区域有编码50个氨基酸残基的核酸序列缺失;细胞免疫组化试验表明,突变型和正常型的C11V和C11D都能在Sf9细胞质中正常表达;制备的BmVgR兔源多克隆抗体和Myc标签抗体同时检测到细胞表达的目的蛋白,表明试验所制备的VgR抗体特异性较好;由于SP+LBD1+EGF1肽段存在信号肽,细胞表达的蛋白会分泌进入细胞培养液中,Western blot对培养液进行蛋白检测,表明突变型vit存在氨基酸缺失,但并不影响肽蛋白的正常表达,且表达量没有明显差异。【结论】EGF1结构域的缺失并不影响SP+LBD1+EGF1肽蛋白的正常表达,可能是其蛋白功能异常导致突变型vit表型产生。 相似文献
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【目的】克隆小峰熊蜂（Bombus hypocrita）可溶型海藻糖酶基因（soluble trehalase,Tre-1）全长cDNA序列,预测该基因及其编码蛋白的理化性质,明确该基因在小峰熊蜂不同组织及不同发育时期的表达特性,为研究该基因在小峰熊蜂生长发育中的生物学功能奠定基础。【方法】根据地熊蜂（B. terrestris）和B. impatiens可溶型海藻糖酶基因Tre-1编码蛋白的保守区序列,利用Primer Premier 5.0设计简并引物扩增得到小峰熊蜂保守区片段;随后根据该片段设计基因特异性引物,用RACE方法获得5'端和3'端片段。在此基础上,根据RACE扩增所得片段和保守序列,预测开放阅读框（ORF）序列,分别在起始密码子近5'端和终止密码子的近3'端设计ORF区特异性引物扩增得到ORF,最后采用BioEdit软件比对、拼接获得小峰熊蜂Tre-1 cDNA全长序列。运用ExPASy、SignalP 4.1、NetOGlyc 1.0 sever、ClustalW和MEGA 5.0等软件对该基因进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR技术,采用2-ΔΔCt方法检测不同组织及不同发育时期可溶型海藻糖酶基因的相对表达量。【结果】克隆所得基因cDNA全长为3 129 bp,命名为BhTre-1（GenBank登录号：KJ025078）,其中包含5'端441 bp非编码区和3'端945 bp非编码区,ORF为1 743 bp,共编码580个氨基酸。其编码的蛋白预测分子质量为67.16 kD,等电点为5.95;有1个信号肽结构（1-21位）,1个甘氨酸富集区（GGGGEY）,2个特色“标签序列”（PGGRFKEFYYWDSY和QWDFPNAWPP）,6个Asn-Xaa-Ser/Thr（N-X-S/T）序列,无跨膜区。序列分析发现BhTre-1氨基酸序列与地熊蜂BtTre-1和B. impatiens BiTre-1的一致性很高,分别为99%和98%,与西方蜜蜂（Apis mellifera）和云南小蜜蜂（A. florea）的Tre-1一致性也达到78%;系统发育分析也表明BhTre-1与BtTre-1、BiTre-1的亲缘关系最近,与AmTre-1、AfTre-1之间的亲缘关系次之。基因定量分析结果显示BhTre-1在成虫被检测的各组织中均有表达,在中肠的表达量最高,其次是马氏管,其他各组织表达量较低。成年工蜂的BhTre-1表达量高于幼虫和蛹,工蜂出房后随着龄期的增加表达量呈现先升高后降低的规律,在第15天表达量最高。【结论】克隆得到了BhTre-1全长cDNA序列,其分子生物学特性与其他昆虫Tre-1相似,该基因在小峰熊蜂中肠表达量最高,此外,幼虫和蛹的表达量低于成年工蜂,工蜂出房后表达量呈现先升高后降低的趋势,为进一步研究该基因在小峰熊蜂体内的生物学功能奠定了基础。 相似文献
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小菜蛾三个普通气味受体基因的克隆及表达谱 总被引：2，自引：1，他引：1
【目的】克隆小菜蛾（Plutella xylostella）触角中3个气味受体基因,明确这3个气味受体在不同组织中的表达分布,进而推测这3个基因的功能,为进一步深入研究奠定基础。【方法】通过新一代高通量测序技术对小菜蛾成虫触角进行转录组测序,获得小菜蛾的转录组数据信息,通过对高质量序列的拼接组装、基因鉴定和功能注释,并通过Blastx基于数据库进行相似性比对分析,预测小菜蛾的气味受体候选基因;设计引物通过克隆得到3条普通气味受体基因的全长序列,并利用半定量RT-PCR研究其在雌、雄成虫9个不同组织中的表达。【结果】根据预测的基因序列,设计特异引物,克隆得到3条普通气味受体基因的全长序列,分别命名为PxylOR16、PxylOR17和PxylOR18（GenBank登录号分别为KF717601-KF717603）。PxylOR16开放阅读框全长为1 218 bp,编码406个氨基酸;PxylOR17开放阅读框全长为1 200 bp,编码400个氨基酸;PxylOR18开放阅读框全长为 1 191 bp,编码397个氨基酸。选择已报道的鳞翅目昆虫家蚕（Bombyx mori）、烟芽夜蛾（Heliothis virescens）和棉铃虫（Helicoverpa armigera）的气味受体,以及已报道的小菜蛾的6条性信息素受体与1条非典型气味受体与本实验克隆得到的3个气味受体进行序列比对和进化树分析,结果显示这3个气味受体基因与非典型气味受体和性信息素受体同源性低,而与其他的普通气味受体聚类在一起,且PxylOR16、PxylOR17和PxylOR18彼此同源性较低。半定量的结果显示,3个普通气味受体基因均在触角中表达量最大,在其他嗅觉感器,如喙、下唇须和头部中也有一定量的表达,雌、雄间无显著差异。另外,PxylOR17在雌蛾生殖器中,PxylOR18在雌蛾腹中也有一定表达。但3种气味受体基因在雌、雄蛾的胸、足和翅等组织中均不表达。【结论】鉴定和克隆了3个小菜蛾气味受体基因,明确这些气味受体基因在小菜蛾不同组织中的表达水平,通过进化树分析、序列比对和组织表达谱分析确定PxylOR16、PxylOR17和PxylOR18为3条普通气味受体,且在功能上高度分化。根据半定量RT-PCR的结果,推测这3个基因可能参与了普通气味分子的识别过程,此外PxylOR17和PxylOR18还可能参与了信息素的产生和释放过程。 相似文献
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【目的】研究意大利蜜蜂（Apis mellifera）工蜂幼虫饲料中适宜色氨酸水平,为探明意大利蜜蜂工蜂幼虫发育阶段的色氨酸营养需要提供理论依据。【方法】选用1日龄工蜂幼虫1 008只,随机分为7组,每组3个重复,每个重复48只幼虫,分别饲喂色氨酸水平为7.84、8.84、9.84、10.84、11.84、12.84和13.84 mg?g-1 的7种日粮。取5日龄工蜂幼虫虫体测定色氨酸羟化酶（tryptophan hydroxylase,TPH）基因与5羟色胺受体（5-hydroxytryptamine receptors, 5-HTR）1、2α、2β、7基因表达量;取6日龄工蜂幼虫虫体测定总蛋白、丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量、总抗氧化能力（total antioxidant capacity,T-AOC）;取6日龄工蜂幼虫血淋巴测定其中游离色氨酸水平;7日龄时,统计工蜂化蛹率;取9日龄工蜂蛹测定色氨酸体沉积量,统计21日龄工蜂出房数目,计算羽化率。【结果】色氨酸水平为10.84 mg?g-1时,6日龄工蜂化蛹率最高,6日龄工蜂幼虫虫体蛋白含量最高,9日龄工蜂蜂蛹色氨酸体沉积最多,21日龄工蜂羽化率最高。色氨酸水平为10.84-11.84 mg?g-1时,5日龄工蜂幼虫TPH基因表达量最高,5日龄工蜂幼虫5-HT受体1、2α、2β基因表达水平最高,6日龄工蜂幼虫血淋巴游离色氨酸含量最高。5日龄工蜂幼虫5-HT受体7基因表达量在色氨酸水平为7.84-11.84 mg?g-1时,处于较低水平,12.84-13.84 mg?g-1时显著高于其他水平（P＜0.05）。6日龄工蜂幼虫MDA含量在色氨酸水平为7.84-11.84 mg?g-1时较低,12.84-13.84 mg?g-1时含量显著高于其他水平（P＜0.05）。6日龄工蜂幼虫T-AOC在色氨酸水平为7.84-9.84 mg?g-1时处于较低水平,10.84-11.84 mg?g-1时处于较高水平,12.84-13.84 mg?g-1时显著高于其他水平。【结论】意大利蜜蜂工蜂幼虫饲料适宜色氨酸水平为10.84-11.84 mg?g-1。 相似文献
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家蚕中肠特异启动子BmAPN的克隆及活性分析 总被引：2，自引：2，他引：0
【目的】克隆和鉴定1个家蚕中肠特异启动子,为研究家蚕的免疫应答和应用研究提供新的工具。【方法】从家蚕品种大造中提取基因组总DNA,用PCR方法克隆家蚕中肠特异表达基因BmAPN（GenBank登录号：BAA33715.1）的上游调控序列。利用此序列构建以EGFP为报告基因的转基因表达载体pBac[BmAPN-EGFP-SV40,3×P3-DsRed],通过显微注射获得转基因家蚕,在个体水平上检测启动子的活性。【结果】所克隆的BmAPN启动子长度为1 598 bp,其驱动的EGFP仅在转基因家蚕中肠特异表达,与内源基因BmAPN的表达特征一致。该启动子在家蚕幼虫时期活性相对较高,且在起蚕期的活性要明显高于眠蚕期,推测该启动子中的特异元件受激素调控。【结论】经克隆获得的BmAPN启动子为有活性的启动子,且为家蚕中肠特异启动子。 相似文献
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【目的】明确家蚕DNA甲基转移酶基因(BmDNMT)生物信息学基本特征及其在家蚕核型多角体病毒(BmNPV)感染前后的表达情况,揭示DNA甲基化在家蚕抗病毒免疫方面的作用机制,为挖掘家蚕抗病毒标志基因和药物靶标蛋白等提供理论依据。【方法】通过OrthoDB、MultiLoc2、SherLoc2、PSORTII、SMART、SWISS-MODEL及Schr?dinger等在线生物信息学分析软件进行BmDNMT蛋白氨基酸同源比对、系统进化分析、亚细胞定位、功能结构域预测、三级结构同源建模及小分子配体对接口袋预测,并采用实时荧光定量PCR分析BmDNMT基因在家蚕感染BmNPV后不同时间不同组织中的时空表达特征。【结果】BmDNMT基因包含BmDNMT1和BmDNMT2,分别位于家蚕8号染色体和11号染色体上,其推导BmDNMT氨基酸序列均与烟草天蛾DNMT氨基酸序列的亲缘关系最近。BmDNMT1蛋白大量存在于细胞核,少量分布在细胞质;而BmDNMT2蛋白大量存在于细胞质,少量分布在细胞核及线粒体。BmDNMT1蛋白的功能结构域多于BmDNMT2蛋白,二者均含有DNA甲基化酶功能结构域,且具有潜在药物结合口袋。BmNPV感染会影响BmDNMT1和BmDNMT2基因在家蚕不同组织中表达差异,BmNPV感染4 h后这2个基因在家蚕中肠的表达差异已非常明显,说明家蚕DNA甲基化可能在病毒感染早期已发生,且中肠可能是最早响应的组织。BmNPV感染后,BmDNMT1和BmDNMT2基因的相对表达量和表达趋势并不一致。【结论】BmDNMT1和BmDNMT2基因的染色体位置、亚细胞定位及功能结构域等存在差异,BmNPV感染后二者在家蚕不同组组织中的相对表达量和表达趋势也不一致,推测BmDNMT1和BmDNMT2基因在家蚕DNA甲基化过程中行使不同的功能。BmDNMT1和BmDNMT2蛋白三维结构具有潜在的药物结合口袋,可能是直接影响DNA甲基化状态的药物靶标。 相似文献
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橘小实蝇羧酸酯酶基因BdCAREB1的克隆及其表达模式解析 总被引：2，自引：1，他引：1
【目的】在克隆获得橘小实蝇（Bactrocera dorsalis）1条羧酸酯酶基因全长序列的基础上,解析该基因在橘小实蝇不同发育阶段和组织以及经高效氯氰菊酯饲喂后的表达模式。同时结合之前完成的有关橘小实蝇羧酸酯酶生化特性以及增效剂处理研究结果,综合分析橘小实蝇羧酸酯酶对高效氯氰菊酯作用的应激反应,为明确羧酸酯酶对菊酯类杀虫剂的解毒代谢机制奠定基础。【方法】通过同源序列比对的方法,从橘小实蝇转录组数据中筛选出1条羧酸酯酶基因序列片段,利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）扩增得到该基因的全长cDNA序列;应用生物信息学分析软件对该基因的开放阅读框、编码的氨基酸序列、分子量等信息进行预测,并基于最大似然法构建该基因与其他昆虫相关基因序列的系统发育树,阐明其分子生物学特征。此外,分别提取橘小实蝇不同发育阶段以及3龄幼虫的中肠、脂肪体、马氏管和气管等组织的RNA,在内参基因稳定性评估筛选的基础上,运用qPCR的方法解析该基因在不同发育阶段和组织间以及药剂处理后的表达模式。【结果】从橘小实蝇转录组数据库中筛选出1条长度为1 028 bp的羧酸酯酶基因片段,通过对5′端和3′端进行RACE扩增分别得到长度为1 073和625 bp的目的片段,经序列拼接和验证后,确定该基因全长为1 872 bp,完整开放阅读框1 710 bp,编码569个氨基酸,推测其蛋白质分子量为63.3 kD,理论等电点6.38。该基因经序列比对命名为BdCAREB1,GenBank登录号为KF539980。基于最大似然法构建的系统发育树显示,该基因编码的蛋白质与双翅目昆虫的羧酸酯酶具有高度的同源性。分析其在不同发育阶段的表达模式发现,BdCAREB1在3龄幼虫期的表达量最高,其次为成虫期,而在卵期的表达量最低。在橘小实蝇3龄幼虫不同组织间的定量分析结果表明,BdCAREB1在脂肪体中表达水平最高,其次在中肠和马氏管的表达水平较低且接近,而在气管的表达量最低。经饲喂0.33 μg?g-1（药剂/饲料）的高效氯氰菊酯后检测BdCAREB1在整虫及组织间的表达情况发现,该基因在幼虫以及脂肪体中的表达量显著上调。【结论】橘小实蝇BdCAREB1的表达具有发育阶段和组织特异性,在幼虫期和脂肪体的表达量最高,并对高效氯氰菊酯处理表现出明显的应激反应,具有可诱导性。结合此前完成的橘小实蝇羧酸酯酶活性测定及增效剂研究结果,分析该基因很可能参与橘小实蝇对高效氯氰菊酯的解毒代谢。 相似文献
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【目的】鉴于sirtuin家族基因重要而多样性的功能,从家蚕全基因组中鉴定sirtuin家族基因,并进行基因结构、蛋白结构及其理化性质、基因进化、组织表达芯片分析及在不同组织中的定量表达情况分析,为研究家蚕sirtuin家族基因的功能和推动家蚕模式生物系统化的研究奠定基础。【方法】基于家蚕基因组数据库,通过生物信息学手段,利用比较基因组学方法,鉴定家蚕sirtuin家族成员;开放阅读框（ORF）的预测用ORFfinder进行;使用SIM4进行ORF的内含子和外显子的预测;用GSDS和ExPaSy在线工具分别进行基因结构图和蛋白序列理化性质的预测;用CLUSTAL_X软件进行多序列联配及对其二级结构进行分析,并用ESpript进行二级结构作图;使用SMART在线软件进行蛋白功能域预测;MEGA5.0软件用于系统发生树分析;利用已有的家蚕幼虫5龄第3天的芯片数据进行组织表达分析;利用荧光定量PCR技术检测家蚕sirtuin家族基因在5龄第3天幼虫不同组织中的表达情况。【结果】系统分析鉴定了家蚕中存在的5个sirtuin家族基因（Bmsirt2、Bmsirt4、Bmsirt5、Bmsirt6、Bmsirt7）,共分为4类（I、II、III、IV）。5个基因分布在家蚕5条染色体上,均为单拷贝基因。基因结构分析显示5个基因均为多外显子基因。同源比对和系统进化分析发现家蚕的sirtuin家族基因与类群中其他昆虫的同源基因形成明显的直系同源关系且高度同源,同样不含有sirt3。蛋白结构预测发现家蚕的sirt6与其他物种的sirt6蛋白一样含有两个sir2结构域聚在一起。组织表达芯片分析发现,sirtuin家族基因在多个组织中具有转录活性。荧光定量PCR检测结果显示家蚕的Bmsirt4在脂肪体、丝腺中低表达;Bmsirt5在精巢、中肠中高量表达,在脂肪体、血液、丝腺中低量表达,与芯片数据基本一致。【结论】通过全基因组分析,家蚕共有5个sirtuin家族成员,进化上分为4类,且与其他昆虫高度同源,芯片数据和实时荧光定量 PCR 结果基本一致,分析表明组织表达模式具有多样性。 相似文献
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家蚕空泡型ATP酶（V-ATPase）基因的基本信息及表达特征 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】鉴定家蚕（Bombyx mori）中的空泡型ATP酶（vacuolar-type ATPase, V-ATP酶）A、B亚基的编码基因,并调查其在家蚕幼虫5龄第3天不同组织和上蔟时期丝腺不同区段的表达特征。【方法】利用生物信息学的方法鉴定家蚕的V-ATP酶A、B亚基的编码基因并在线预测V-ATP酶两个亚基所具有的结构域,采用软件将其分别与其他物种中V-ATP酶A、B亚基的氨基酸序列进行同源序列比对和进化树的构建,通过荧光定量PCR技术分析家蚕V-ATP酶A、B亚基的编码基因在5龄第3天家蚕各组织的表达情况。进一步利用向家蚕幼虫上蔟时期的气孔注射pH值指示剂溴酚蓝,对丝腺进行染色,通过颜色变化对丝腺不同区段的pH值进行调查。最后,采用荧光定量PCR对家蚕上蔟时期丝腺不同区段V-ATP酶A、B亚基编码基因的表达情况进行分析。【结果】获得了家蚕V-ATP酶A、B亚基的编码基因BGIBMGA008295(GenBank登录号NM_001098359.1)和BGIBMGA002241(GenBank登录号NM_001098358.1)。结构域预测发现这两个亚基均具有3个非常保守的结构域,分别为位于N端的β筒结构域、序列中部的核苷酸结合结构域和C端结构域。将这两个基因编码的V-ATP酶A、B亚基的氨基酸序列与其他物种V-ATP酶A、B亚基的氨基酸序列进行同源性比对和进化树的构建,同源比对结果发现不同物种中V-ATP酶A、B亚基的氨基酸相似度为90%,保守结构域间相似度高达95%以上,说明不同物种间V-ATP酶A、B亚基高度保守。进化树显示家蚕V-ATP酶A、B亚基与同属于鳞翅目的其他昆虫的V-ATP酶A、B亚基亲缘关系较近。5龄第3天家蚕各组织中V-ATP酶A、B亚基编码基因的荧光定量PCR结果显示,这两个基因主要在中肠、脂肪体、生殖腺和丝腺中表达。使用溴酚蓝染色的方法分析上蔟期丝腺不同区段的pH情况,结果显示家蚕后部丝腺、中部丝腺后区和中区为中性或碱性环境,中部丝腺前区pH急剧下降到酸性环境,前部丝腺也为酸性环境。进一步对V-ATP酶A、B亚基编码基因在上蔟期丝腺不同区段进行表达情况分析,发现V-ATP酶A、B亚基基因在前部丝腺和中部丝腺前区高量表达,推测V-ATP酶可能与这两个区域低pH环境的产生和维持相关。【结论】明确了V-ATP酶在家蚕各组织的表达情况,V-ATP酶可能与中部丝腺前区和前部丝腺腺腔的酸化相关,这为进一步研究V-ATP酶的生理功能提供了理论依据。 相似文献
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【背景】 莲草直胸跳甲（Agasicles hygrophila）是世界恶性入侵杂草空心莲子草（Alternanthera philoxeroides）的专一性生防天敌;莲草直胸跳甲种群动态呈季节性波动趋势,在我国湖南地区其夏季种群数量骤减,导致对空心莲子草的防控效果大大降低。而Halloween基因家族参与昆虫蜕皮激素的合成,影响昆虫生长和繁殖,进而对昆虫种群动态具有一定影响。【目的】 揭示Halloween基因家族在莲草直胸跳甲不同发育时期和不同组织中的表达模式,为进一步探究Halloween基因家族在莲草直胸跳甲中的功能打下基础,进而为生防天敌的扩繁提供新思路。【方法】 通过筛选莲草直胸跳甲卵巢转录组数据并结合生物信息学分析,找到并克隆其体内Halloween基因家族成员;使用NCBI在线分析其保守结构域,利用MEGA6.0对Halloween家族基因进行多序列比对并构建系统发育树;通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测各基因在莲草直胸跳甲不同发育时期（卵、幼虫、蛹、雌成虫）和雌成虫不同组织（头、胸、中肠、卵巢、脂肪体）中的表达水平。【结果】 莲草直胸跳甲中存在6个Halloween基因家族成员,分别为AhCYP302A1、AhCYP306A1、AhCYP307A1、AhCYP307A2、AhCYP314A1和AhCYP315A1;分析发现其均属于P450超家族且具有一定保守性,其中AhCYP306A1、AhCYP307A1、AhCYP307A2聚为一支,属于P450超家族中CYP2集团,AhCYP302A1、AhCYP314A1、AhCYP315A1聚为一支,属于线粒体集团;同时,AhCYP306A1、AhCYP314A1、AhCYP315A1在5′端存在跨膜区域。6个Halloween基因在莲草直胸跳甲整个生活史及各个组织中均有不同程度的表达。其中,AhCYP302A1在蛹期第6、7天表达量最高,成虫期表达量整体较低;AhCYP306A1在整个生活史中波动表达,以幼虫期第10天表达量最高;AhCYP307A2在末龄幼虫和化蛹初期的表达量较高;以上3个基因在幼虫期和蛹期的表达量较高。AhCYP307A1在卵期高表达,此后各个时期呈波动下降;AhCYP314A1、AhCYP315A1在成虫期和卵期的表达量相对高于其他两个时期。在头、胸、中肠、卵巢、脂肪体5种组织中,除AhCYP307A1外,Halloween家族其他基因在卵巢中表达量均较高;AhCYP307A1在雌成虫头部显著性高表达。【结论】 克隆并鉴定得到6个莲草直胸跳甲Halloween基因家族成员,其在不同发育时期及不同组织中的表达具有一定差异。通过其表达模式推测Halloween基因家族在莲草直胸跳甲幼虫发育及成虫繁殖过程中可能发挥重要作用,对其幼虫蜕皮与成虫卵巢发育均有一定影响。 相似文献