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PVY/PVX协生作用对病毒浓度及寄主细胞超微结构的影响 总被引：2，自引：0，他引：2
以烟草品种三生烟 (N .tabacumcv .Samsun)为测试寄主 ,采用酶联免疫检测实验 (TAS ELISA)和电镜观察的方法 ,在温室条件下研究了马铃薯Y病毒 (PVY)和马铃薯X病毒 (PVX)复合侵染所引起的寄主症状和病毒浓度变化的特点、不同条件下复合侵染时病毒浓度的变化规律以及复合侵染对寄主细胞超微结构的影响。结果表明 ,PVY/PVX在烟草植株内发生了协生作用 ,PVY是协生病毒 ,PVX是被协生病毒。与单独侵染相比 ,PVY和PVX的复合侵染使烟草植株症状明显加重。PVY在复合侵染植株中的浓度与在单独侵染植株中相比 ,没有明显的变化 ,而PVX在复合侵染植株中的浓度明显高于在单独侵染植株中的浓度。这种现象不受PVY株系、处理季节和接种次序的影响。但是 ,不同PVY株系、不同处理季节或不同接种次序对PVY/PVX协生作用中PVX浓度的影响程度存在着一定的差异。电镜观察表明 ,与不接种病毒或单独侵染的植株相比 ,受复合侵染的烟草叶片细胞超微结构发生了明显的病理学变化。细胞肿胀 ,叶绿体、线粒体等细胞器受到严重损伤 ,细胞质内有风轮状、薄片状的内含体 ,由于在细胞质中常常有大量纤维状的PVX病毒粒子聚集体存在 ,这意味着PVX浓度的增加可能是在复合侵染的细胞中病毒大量繁殖的结果。 相似文献
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【目的】 构建基于柑橘叶斑驳病毒（citrus leaf blotch virus,CLBV）的表达载体,通过系统表达抗菌肽提高植物抗病性,为柑橘溃疡病、柑橘黄龙病等病害的防控提供新型技术手段。【方法】 基于前期构建的侵染性克隆pCY-CLBV201,在外壳蛋白基因终止子后插入亚基因组启动子序列及多克隆位点,构建病毒表达载体pCLBV202。在多克隆位点插入绿色荧光蛋白（green fluorescent protein）基因（gfp）,通过农杆菌介导接种、荧光观察验证pCLBV202-GFP表达GFP的情况。克隆天蚕的抗菌肽（cecropin B,CB）基因并构建重组载体pCLBV202-CB,通过农杆菌介导分别注射接种本氏烟和真空浸润接种柑橘实生苗,筛选阳性植株并分别注射接种和根灌接种烟草青枯病菌及针刺离体叶片接种柑橘溃疡病菌,同时设空载体接种植株为对照,通过症状观察、发病率及病情指数评价接种植株的烟草青枯病抗性;通过柑橘叶片的病斑数量、发病率及菌落浓度评价其溃疡病抗性。【结果】 pCLBV202-GFP接种烟草和尤力克柠檬后,均可以在系统新叶上观察到绿色荧光,在烟草上表现更为明亮,说明基于CLBV的表达载体构建成功。接种青枯病菌后,处理组（pCLBV202-CB）较对照组（pCLBV202）发病时间延迟4 d。在接种后第24天（24 dpi）,处理组发病率为14.3%,对照组发病率为100%,差异显著。处理组相对于对照组的抗性指数为-2.66,抗性评价为高抗,表明利用pCLBV202-CB系统表达CB增强了对烟草青枯病的抗性。尤力克柠檬叶片针刺接种柑橘溃疡病菌,7 dpi时,处理组病斑数为47个,发病率为43.5%,对照组病斑个数为73个,发病率为67.6%。菌群数变化检测发现,处理组菌群数小于对照组菌群数,表明利用pCLBV202-CB系统表达CB增强了尤力克柠檬的溃疡病抗性。【结论】 构建了基于CLBV的病毒表达载体pCLBV202。利用pCLBV202在本氏烟和柑橘中系统表达CB可以提高植株对细菌性病害的抗性,这为柑橘细菌性病害的防控提供了新技术。 相似文献
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【目的】通过分析发现木尔坦棉花曲叶病毒（cotton leaf curl Multan virus,CLCuMuV）C4开放阅读框（open reading frame,ORF）附近可编码3个不同大小的蛋白,而NCBI数据库登录的CLCuMuV各个分离物编码的C4蛋白大小也不尽相同,本研究试图通过分析该3个假定的“C4 ORF”编码蛋白对病毒致病性的影响,以明确CLCuMuV C4蛋白ORF的确切定位。【方法】根据双生病毒编码蛋白的保守性,在CLCuMuV C4 ORF附近查找到3个大小不等的ORF,分别标记为C4-L（567 nt）、C4-M（546 nt）和C4-S（303 nt）。利用同源重组的方法将该3个ORF分别构建到PVX异源表达载体,通过农杆菌介导的植物接种法,分析PVX介导的3个蛋白在本氏烟表达对本氏烟症状的影响。利用同源重组的方法构建CLCuMuV野生型及C4-L或C4-S缺失突变型的侵染性克隆,同样通过农杆菌介导的植物接种法,分别与其伴随DNA-β分子的侵染性克隆接种本氏烟,分析C4-L或C4-S缺失对CLCuMuV致病性的影响,并利用Southern blot和Western blot分别对接种烟草的病毒基因组的积累量和病毒C4蛋白的表达量进行分析。同时利用Gateway系统载体对C4-L和C4-S蛋白在本氏烟叶片表皮细胞中的亚细胞定位进行分析。【结果】PVX异源表达载体接种本氏烟,结果发现PVX-C4-L和PVX-C4-S接种的本氏烟叶片卷曲、叶柄伸长,并且PVX-C4-S症状更重,而PVX-C4-M接种的本氏烟症状较轻或基本无症状,Western blot试验也在PVX-C4-L和PVX-C4-S接种组检测到了C4蛋白的表达,说明C4-S ORF编码的蛋白对PVX异源病毒的致病性影响最大。侵染性克隆接种本氏烟,结果发现野生型（CLCuMuV）和C4-L突变型（CLCuMuV-ΔL）接种的本氏烟叶片皱缩增生、叶柄和茎秆扭曲,而C4-S突变型（CLCuMuV-ΔS）和对照组（Mock）接种的本氏烟未显示任何症状,并且前两者的植株高度明显矮于后两者,同时Southern blot试验在CLCuMuV和CLCuMuV-ΔL接种的本氏烟中均检测到大量病毒基因组的积累,而Western blot试验也在其中检测到C4蛋白的表达,说明C4-S ORF编码的蛋白在CLCuMuV诱导寄主产生症状过程中起关键作用。亚细胞定位发现YFP-C4-L主要定位在本氏烟叶片表皮细胞的叶绿体,YFP-C4-S则定位在细胞膜或细胞质周边,并有点状聚集体结构。【结论】C4-S ORF编码的蛋白对CLCuMuV的侵染必不可少,而C4-L和C4-M ORF编码的蛋白对CLCuMuV的侵染不是必需。 相似文献
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自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)克隆获得attM基因。采用叶盘转化法,农杆菌介导转化烟草,经过卡那霉素抗性筛选获得抗性愈伤组织,对其分化产生的植物株系进行PCR、PCR-Southern和荧光定量PCR及GUS染色检测分析。结果表明:attM基因被成功插入烟草基因组DNA中。在转基因株系中均能够表达,相对表达量最大可达125.8,最小为31.0。以野生型烟草和转pBI121空载体的烟草为对照,分别进行了离体及活体检测试验,结果表明:转attM基因烟草植株对茄科雷尔氏菌引起的青枯病抗性显著。1×107～1×108CFU.mL-1的青枯菌接种离体叶片,野生型烟草和转pBI121空载体的烟草的中毒面积与接种面积比值为15～25,转基因植株的比值低于3;青枯菌3×106CFU.mL-1伤根接种盆栽烟草植株14d,野生株和转空载体烟草均青枯死亡,病情指数为100,转基因植株病情指数为31.25。 相似文献
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木尔坦棉花曲叶病毒(CLCuMuV)是棉花曲叶病的主要病原之一,其V2蛋白在病毒致病过程中起重要作用。本研究对V2蛋白N端第4位脯氨酸在病毒致病过程中的作用进行了分析。通过构建马铃薯X病毒(PVX)异源表达载体(PVX-V2、PVX-V2P4A),利用农杆菌介导的方法接种于本氏烟发现,PVX-V2能够增强PVX异源病毒的致病性,致使PVX在植物体内复制量增加,而PVX-V2P4A对PVX异源病毒致病性的影响相对较小。通过构建V2基因突变体(ΔV2、V2P4A)侵染性克隆,利用农杆菌介导的方法接种于本氏烟发现,ΔV2、V2P4A侵染性克隆引起的症状较野生型更弱。结果表明,CLCuMuV V2蛋白N端第4位脯氨酸在病毒侵染过程中起重要作用。 相似文献
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将拮抗菌2-Q-9的1个抑菌相关基因BCCodY连接至遗传转化载体并转化烟草品种K326.PCR结果表明,该基因被成功转化.反转录PCR结果表明,BCCodY基因在K326中被转录成mRNA,说明该基因能在转基因植株中表达.为了鉴定BCCodY在转基因K326中的生物学功能,采用叶腋针刺法将烟草青枯病菌接种转基因植株,在接种后7 d内从转基因植株中分离出的青枯病菌菌落数低于非转基因植株;但接种9 d后,从两类植株中分离出的青枯菌菌落数趋于一致,病情指数也基本相同.说明转BCCodY基因的烟草植株在接种青枯菌初期能抑制青枯病菌,但后期的抑制效果不明显. 相似文献
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【目的】bZIP类转录因子参与植物的生长发育、激素信号、抗病性及抗逆性等多种生物胁迫过程。前期研究表明黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)或烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)侵染本氏烟(Nicotiana benthamiana)上调内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERs）因子NbbZIP28;NbbZIP28沉默导致病毒积累量上升,本研究旨在验证NbbZIP28对病毒侵染胁迫的响应机制。【方法】通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和烟草遗传转染创建NbbZIP28基因突变植株,以野生型植株为对照,分别浸润接种侵染性克隆TMV-GFP、摩擦接种TMV-GFP或CMV接种液,检测突变体植株对病毒侵染胁迫的敏感性变化,接种CMV后0-48 h,采用qRT-PCR检测内质网应激相关的未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR)基因的表达。本氏烟接种TMV 24 h、接种CMV 48 h后,在接种叶上浸润融合蛋白NbbZIP28-GFP,瞬时表达48 h后,采用Western blot检测病毒诱导NbbZIP28蛋白的水解激活;采用在线搜索工具PlantCARE分析NbbZIP28启动子区域中参与防卫和应激反应的顺式作用元件。【结果】CRISPR/Cas9定点敲除NbbZIP28后,目的基因靶位点缺失了10个碱基,导致翻译错误、蛋白功能变化。在正常生长条件下,转基因阳性植株与野生型无显著的表型差异。植株接种TMV-GFP后4-8 d,突变体中的病毒浸润斑亮度或初侵染点数目均显著高于野生型,扩展至新叶的速度较快。接种CMV后12-48 h,突变体中UPR相关基因BiP、PDI、CAM及NbbZIP28下游基因NF-YC2的表达量显著低于野生型;5-7 d突变体中的病毒外壳蛋白（coat protein,CP）基因表达量显著高于野生型,花叶及皱缩症状更显著。蛋白质序列比对分析显示NbbZIP28具有与拟南芥AtbZIP28相同的S1P和S2P蛋白酶水解位点。Western blot检测发现,与接种清水对照相比,TMV或CMV侵染显著促进了全长的融合蛋白NbbZIP28-GFP在S1P和S2P位点发生裂解。NbbZIP28启动子序列中包含5个参与热应激反应的顺式作用元件（heat stress response element,HSE）、3个参与低温反应的顺式作用元件（low temperature response element,LTR）、1个参与防卫和应激反应的顺式作用元件（TC-rich repeats）。【结论】病毒侵染促进NbbZIP28的水解激活并上调相关的UPR基因;NbbZIP28敲除导致植株对病毒的敏感性上升,病毒诱导的UPR基因表达被抑制。NbbZIP28为病毒侵染胁迫下的UPR调控因子,在病毒侵染早期通过上调UPR信号和提高寄主基础防卫反应而延缓病毒的侵染和增殖。 相似文献
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【目的】马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）是危害烟草、马铃薯、番茄、辣椒等主要农作物的重要病毒,给农业生产带来巨大损失。论文旨在克隆Hsc70-2蛋白在本氏烟（Nicotiana benthamiana）中的基因序列并分析其生物学信息,研究NbHsc70-2蛋白对PVY侵染烟草的影响,为进一步解析PVY的侵染机制提供理论依据。【方法】以本氏烟为材料,克隆NbHsc70-2蛋白的基因编码序列（coding sequence,CDS）,利用MEGA 6.0 进行多序列比对并构建系统进化树;利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析NbHsc70-2在本氏烟各组织中的表达水平;采用在线软件BaCeILo和SignalP 4.0对NbHsc70-2进行生物信息学分析;构建NbHsc70-2-RFP融合蛋白确定该蛋白的亚细胞定位;研究PVY处理对本氏烟叶片中NbHsc70-2的影响;利用激光共聚焦观察PVY-GFP处理对NbHsc70-2-RFP定位的影响;构建NbHsc70-2 VIGS沉默体系及瞬时表达载体,采用qRT-PCR比较NbHsc70-2在沉默/过表达后对PVY表达的影响。【结果】NbHsc70-2编码649个氨基酸,系统进化树分析表明,NbHsc70-2与普通烟NaHsc70-2序列相似性最高,亲缘关系最近,属于热激蛋白家族,C端具有热激蛋白家族的高度保守基序结构;qRT-PCR分析表明,NbHsc70-2在叶中表达量最高,在根和茎中的表达量较低;BaCeILo预测及激光共聚焦显微镜观察均显示NbHsc70-2定位在细胞质中,并且PVY-GFP侵染本氏烟后NbHsc70-2-RFP部分转移至细胞核,与PVY-GFP共定位在细胞质及细胞核中;将NbHsc70-2基因沉默载体pTRV::NbHsc70-2导入本氏烟中7 d后相比于对照组,沉默组出现心叶皱缩及矮化现象;接种PVY-GFP 7 d后通过手持紫外灯观察到沉默组中无明显绿色荧光出现,而对照组中PVY-GFP系统侵染使得非接种叶片呈现荧光现象,沉默组荧光点数约为对照组28%;接种PVY后,利用qRT-PCR检测沉默NbHsc70-2后1、3、5 d的PVY CP基因积累量,结果表明沉默NbHsc70-2后PVY CP基因积累量下降,其中3 d和5 d与对照相比差异显著,基因表达水平分别为对照的14%和0.004%;将NbHsc70-2过表达载体pEarleyGate100::GWC::NbHsc70-2与PVY同时导入本氏烟后,结果表明相比于对照组,过表达组48 h和72 h 其PVY CP基因积累量显著上升,基因表达水平分别为对照组的2.31、2.56倍。【结论】PVY侵染会引起NbHsc70-2表达量上升;NbHsc70-2是PVY侵染本氏烟重要的组成成分,沉默该基因显著抑制PVY的表达,过表达NbHsc70-2则显著提高PVY的表达,即NbHsc70-2的表达水平与PVY复制呈正相关,NbHsc70-2蛋白促进PVY对烟草的侵染。 相似文献
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【目的】马铃薯Y病毒（potato virus Y,PVY）是危害我国烟草生产的最重要病毒之一,NAC转录因子与植物的抗病、抗逆密切相关,本论文克隆NbNAC062进行生物信息学分析,并研究其在PVY侵染过程中的作用,为烟草抗病毒药剂的开发提供靶标。【方法】以本氏烟（Nicotiana benthamiana）为材料克隆NbNAC062,利用MEGA、UniProt、SMART、TMHMM Server 2.0、Sol Genomics Network、PlantCARE等技术进行生物信息学分析;利用激光共聚焦与实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）明确PVY侵染前后NbNAC062蛋白定位及mRNA表达量变化;基于病毒介导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）和过表达技术,构建pTRV::NbNAC062沉默载体与pEarleyGate100::RFP::NbNAC062过表达载体,采用qRT-PCR和Western blot检测NbNAC062在本氏烟中沉默与过表达后,PVY的积累量变化及未折叠蛋白应答（unfolded protein response,UPR）相关基因BiP的表达差异。【结果】NbNAC062编码646个氨基酸,N端28—179 aa为NAC结构域,129—185 aa为DNA结合区域,C末端621—643 aa为疏水跨膜结构,系统进化树与蛋白序列分析表明本氏烟NbNAC062与渐狭叶烟草NaNAC062亲缘关系最近。NbNAC062启动子中包含脱落酸、茉莉酸甲酯、水杨酸以及逆境响应相关的多种顺式作用元件。PVY侵染激活NbNAC062从细胞膜转移至细胞核,且诱导NbNAC062上调表达。PVY侵染本氏烟5、7 d,处理组NbNAC062 mRNA水平分别为对照组的2.52、1.95倍;PVY侵染3 d,BiP mRNA表达量为对照组的2.39倍,PVY侵染7 d,BiP表达量极显著低于对照组,下调表达56.77%。本氏烟沉默NbNAC062并接种PVY,接种后3、5、7 d,与对照组相比,沉默组PVY CP mRNA上调表达,分别为对照组的2.12、2.41、1.38倍,BiP mRNA表达量则下调,分别下调28.19%、58.11%、10.77%,接种后5、7 d沉默组PVY CP蛋白含量亦显著高于对照组。过表达NbNAC062并接种PVY,接种后24、48、72 h,与对照组相比,过表达组PVY CP mRNA分别下调22.60%、34.51%、36.21%,接种48、72 h,BiP mRNA上调表达,分别为对照组的1.56、1.35倍,过表达组PVY CP蛋白含量亦低于对照组。【结论】NbNAC062属于NAC类膜结合转录因子,可被PVY侵染激活转移至细胞核,可能通过调控UPR相关基因BiP的表达,促进细胞生存,抑制PVY早期侵染。 相似文献
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【目的】在中国大豆品种上建立以苹果潜隐球形病毒（apple latent spherical virus,ALSV）为载体的基因沉默体系,为中国大豆品种的基因功能和遗传育种提供一种简便、省时、易操作的技术体系。【方法】构建以农杆菌介导接种的ALSV病毒侵染性克隆载体。从大豆品种威廉姆斯82（Williams 82）中特异扩增327 bp的八氢番茄红素脱氢酶（GmPDS）基因cDNA片段,插入病毒载体pALSV2。通过农杆菌浸润法将病毒载体导入模式植物本氏烟（Nicotiana benthamiana）,17 d后富集病毒粒子,摩擦接种大豆第一轮真叶,以接种病毒空载作为对照组,持续观察测试大豆植株系统叶表型,并结合逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）或荧光定量PCR（qRT-PCR）检测ALSV衣壳蛋白基因（CP）和GmPDS的表达水平。【结果】ALSV﹕GmPDS接种大豆品种威廉姆斯82和南农1138-2,20 d后,前者系统叶未见白化表型,而后者系统叶出现明显的白化表型;qRT-PCR检测结果表明,发生白化的南农1138-2植株中GmPDS的表达水平显著降低,未出现白化表型的威廉姆斯82中GmPDS的表达水平没有出现显著变化。在此基础上,采用相同的方法,测试了ALSV在其他9种大豆品种中诱导GmPDS的沉默效率,发现在南农47、安豆203、祥斗4号、中黄13、山宁29、齐黄34等大豆品种上接种ALSV﹕GmPDS后植株系统叶均产生白化表型,而菏豆12、中黄311和山宁16等3个品种的GmPDS均不能诱导有效沉默。【结论】构建了农杆菌介导的ALSV病毒载体,利用本氏烟扩繁富集ALSV病毒,将提纯的病毒粒体摩擦接种大豆真叶,在多个中国大豆品种上成功建立了基因沉默体系。 相似文献
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【目的】明确抗病毒化合物氯吲哚酰肼（chloroinconazide,CHI）诱导的本氏烟（Nicotiana benthamiana）半胱氨酸蛋白酶（cysteine proteinase,CP）在烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）侵染过程中的作用及其基因家族特征,为理解茄科作物抗病毒分子机制及化学调控提供理论依据。【方法】利用全基因组策略,从茄科作物基因组数据库Sol Genomics Network中检索获得本氏烟NbCP的全家族基因序列,利用生物信息学分析NbCP基因家族的进化关系、Motif基序及启动子顺式作用元件。根据生物信息分析结果,利用实时荧光定量PCR技术分析TMV侵染后NbCP基因的表达,以此筛选出潜在抗病蛋白。使用烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus,TRV）介导的基因沉默技术和马铃薯X病毒（potato virus X,PVX）介导的基因过表达技术验证该关键蛋白对TMV-GFP侵染的影响,结合实时荧光定量PCR手段探索该关键蛋白的抗病毒机制。【结果】NbCP家族共有24个成员,根据其染色体定位命名为NbCP1—NbCP24。进化关系分析表明NbCP分成5个亚家族,其中Group V含有7个NbCP,而Group I仅含2个NbCP;Motif分析表明不同分支NbCP具有相似的motif分布;启动子顺式作用元件分析表明NbCP家族基因受光调控,并且多个NbCP家族基因启动子含有茉莉酸甲酯、水杨酸甲酯、脱落酸、赤霉素和生长素等激素响应元件。结合生物信息学分析,从上述各个亚家族中分别筛选1个关键潜在抗病相关NbCP基因（NbCP8、NbCP12、NbCP13、NbCP18、NbCP22）,并利用实时荧光定量PCR技术分析上述基因在TMV侵染第5天的表达,发现NbCP8表达差异性最大,上升了2.6倍,NbCP8在叶中的表达量最高,其次是茎和根,在花中的表达量最低。TRV介导的NbCP8沉默能显著增加TMV-GFP的侵染,而PVX介导的NbCP8过表达能显著抑制TMV-GFP侵染,表明NbCP8作为植物正调控因子抑制病毒侵染。沉默NbCP8显著抑制了水杨酸信号途径相关基因PR1以及茉莉酸信号途径相关基因MYC2的表达,但对NPR1、COI1以及脱落酸信号途径相关基因ABA1和NCED1的表达无显著影响;而过表达NbCP8则显著提高了PR1以及ABA1的表达,但对NPR1、MYC2、COI1和NCED1的表达无显著影响。【结论】本氏烟NbCP参与了植物胁迫防御,其中NbCP8在抗TMV防御中起显著作用,其分子机制是通过诱导水杨酸信号途径参与抗病防御,研究结果可为茄科作物抗病毒的分子机制提供证据。 相似文献
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【目的】烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）是危害茄科、十字花科、葫芦科等农作物的重要病毒,给农业生产造成了巨大损失。通过分子克隆获得本氏烟（Nicotiana benthamiana）多蛋白桥梁因子1c(multiprotein bridging factor 1c,MBF1c),综合应用生物信息学、细胞生物学以及分子生物学手段,明确NbMBF1c的抗病毒功能和机制,为作物的抗病毒育种提供理论依据。【方法】根据Sol Genomics Network中报道的NbMBF1c序列全长,设计引物克隆NbMBF1c全长序列;使用GeneDoc及MEGA X对NbMBF1c蛋白和其他物种中的同源蛋白序列进行比对并构建系统进化树;利用生物信息学分析NbMBF1c的基因特征和蛋白结构;使用实时荧光定量PCR检测其组织表达及其在TMV侵染中的表达;利用烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus,TRV）诱导的基因沉默（virus induced gene silencing,VIGS）技术沉默NbMBF1c后通过摩擦接种TMV-GFP,明确NbMBF1c对病毒... 相似文献
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【背景】条锈病是小麦上的重大病害,由条形柄锈菌小麦专化型（Puccinia striiformis f. sp. tritici,Pst）侵染引起。条锈菌是活体营养型寄生真菌,在侵染过程中形成吸器,通过吸器从寄主植物汲取营养。同时,吸器分泌效应蛋白调控寄主免疫,促进侵染过程。【目的】明确条锈菌效应蛋白的功能及其作用机理,为揭示条锈菌的致病机制打下基础。【方法】比较分析条锈菌夏孢子、芽管和吸器转录组,获得在吸器诱导表达的分泌蛋白基因Hasp83,在本氏烟叶片细胞中瞬时表达观察是否能抑制由BAX引起的细胞坏死;利用qRT-PCR分析该基因在条锈菌侵染小麦不同阶段的表达水平。借助荧光假单胞菌Ⅲ型分泌系统和寄主诱导的基因沉默（host-induced gene silencing,HIGS）分析Hasp83在条锈菌侵染过程中的功能。利用酵母双杂交系统筛选小麦中与Hasp83互作的蛋白,免疫共沉淀技术进一步在烟草细胞中共表达验证Hasp83及其候选靶标蛋白的互作。【结果】Hasp83开放阅读框全长522 bp,编码173个氨基酸,蛋白N端1—29位氨基酸为信号肽,无保守结构域,在本氏烟叶片细胞中... 相似文献
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【目的】黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是侵染瓜类作物的主要病毒之一,对瓜类产业造成巨大的危害。本研究旨在探明侵染广东省连州市葫芦的CGMMV分离物(CGMMV-GDLZ)分子特征及其在系统进化中的地位,并测定其对黄瓜、葫芦和西瓜的致病性,为CGMMV的防控提供理论依据。【方法】从广东省连州市葫芦种植基地采集2个疑似CGMMV侵染的病样以及1个无症状样品,提取总RNA,根据CGMMV参考序列（GenBank登录号：KX883801）设计引物进行RT-PCR检测,引物序列为F：CCACGAGTTGTTTCCTAATGCTG/R：TTTGCTAGGCGTGATCGGATTGT,退火温度53℃,扩增长度890 bp。将CGMMV全长序列分为前后两段,前半段1—3 511 nt,扩增引物序列为F：AAGTTCATTTCATTTGGAGAGGGTTTTAATTTTTATAA TTAAACAAA/R：AGTTCTGCATTAATTGCTATTTGGTAGGCACAGTGGTAG;后半段3 301—6 423 nt,扩增引物序列为F：GTGCGTGCTACCCCGACTCCAATAGGTTTGATTGCCCGTG/R：GGTGGAGATGCCATGCCGACCCTGGGCCCCTACCCGGGGAAAGG。将前后两段PCR产物通过同源重组的方法克隆到pCB301双元载体上,测序得到CGMMV-GDLZ分离物全长序列。利用CGMMV-GDLZ分离物全长序列在NCBI中进行Blast分析,然后通过MEGA7软件对CGMMV-GDLZ以及其他已经报道的CGMMV分离物进行系统进化树分析。将构建好的pCB301-CGMMV侵染性克隆注射接种本生烟验证其侵染性,然后再注射接种黄瓜、葫芦和西瓜的子叶,测定CGMMV-GDLZ分离物的致病性。【结果】RT-PCR结果证实,广东省连州市葫芦病样感染了CGMMV。CGMMV-GDLZ分离物全长序列为6 423 nt,编码4个蛋白,分别为129K复制酶（61—3 495 nt）、186K复制相关蛋白（61—5 007 nt）、运动蛋白MP（4 994—5 788 nt）和外壳蛋白CP（5 763—6 248 nt）。CGMMV-GDLZ核苷酸序列与CGMMV-eWT分离物（GenBank登录号：KY753928）同源性最高,为99.97%。系统进化树分析结果显示,CGMMV-GDLZ分离物与日本、韩国等东亚CGMMV分离物同属Group 1,在遗传距离上与山东、浙江和河南的CGMMV分离物最接近。pCB301-CGMMV侵染性克隆可以系统侵染本生烟,造成本生烟上部叶片出现皱缩、斑驳、凸起等症状,RT-PCR和Western blot进一步确认了侵染性克隆的侵染性。注射接种CGMMV-GDLZ分离物后15 dpi,葫芦和西瓜即可产生斑驳、花叶、突起、生长迟缓等症状,24 dpi时症状更明显。而15 dpi时,CGMMV-GDLZ分离物在黄瓜上的症状不明显,与未接种对照植株几乎没有区别;将植株从控温接种室移入网室中,30 dpi时,黄瓜植株上部叶片开始出现斑驳和花叶,40 dpi时,症状已经非常明显。RT-PCR和Western blot检测进一步确认了上述结果。【结论】侵染广东省连州市葫芦的CGMMV-GDLZ分离物与山东、浙江和河南的CGMMV分离物很可能具有相同的传染源;CGMMV-GDLZ分离物可以侵染本生烟、黄瓜、葫芦和西瓜等作物,但对这些作物的致病性存在差异。 相似文献