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1.
采用乙醇提取菌草灵芝,对菌草灵芝醇提物(JGEH)的体外抗氧化和免疫活性进行了研究.结果表明：JGEH含量为2 mg·mL-1时对DPPH、ABTS和羟基自由基的清除率分别达到85.61%、80.25%、100.00%;JGEH含量为25～200μg·mL-1时对巨噬细胞RAW264.7无毒副作用,可促进细胞增殖,且细胞增殖率高达121.71%;JGEH可显著增强巨噬细胞的吞噬能力,JGEH含量为25μg·mL-1时的细胞吞噬指数高达345.21%;在脂多糖(LPS)诱导的细胞炎症模型中,JGEH表现出较强的抗炎活性,JGEH含量为25～200μg·mL-1时可降低细胞中NO的释放量;JGEH可降低巨噬细胞中炎症相关因子基因的表达,降低细胞炎症反应.综上可知,JGEH有较强的体外抗氧化和免疫活性. 相似文献
2.
以脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞为模型,研究原花青素对LPS诱导的小鼠RAW264.7细胞中环氧合酶-2(COX-2)mRNA转录的抑制机制。采用RT-PCR法测定原花青素对LPS诱导的RAW264.7细胞中COX-2mRNA转录的影响,采用Western blot和免疫组化法考察原花青素对LPS诱导的RAW264.7细胞核转录因子κB(NF-κB)亚基p65(NF-κB/p65)及NF-κB结合蛋白(I-κB)表达的影响。结果发现LPS处理RAW264.7细胞可以明显上调COX-2 mRNA的表达,同时降低胞质蛋白I-κB的表达水平,增加NF-κB的水平。原花青素对RAW264.7细胞中COX-2 mRNA的转录有较强抑制作用,抑制NF-κB/p65的表达及I-κB的降解,原花青素可能是通过抑制NF-κB/p65的表达及I-κB/p65的降解而抑制COX-2的表达。 相似文献
3.
为了研究异荭草苷(Isoorientin, ISO)对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的RAW264.7细胞炎症反应的影响及其机制,将对数生长期的RAW264.7细胞随机分为对照组、模型组(LPS 1μg·mL-1)和异荭草苷(ISO 2.5～40μg·mL-1+LPS)给药组。各组细胞培养24 h后,MTT法检测ISO对RAW 264.7细胞毒性,Griess法检测细胞培养液中一氧化氮(NO)的含量,ELISA法检测细胞培养液中TNF-α的含量,q RT-PCR方法检测环氧合酶2(COX-2)m RNA的表达水平,蛋白质印迹分析法测定细胞中COX-2、JNK、p-JNK、p38、p-p38、FoxO1和FoxO3蛋白的表达。结果表明,与LPS模型组比较,ISO显著抑制LPS诱导的TNF-α(P<0.001)和NO(P<0.01)的产生,且未见其细胞毒性。此外,ISO以剂量依赖的方式显著抑制RAW 264.7细胞COX-2基因(P<0.001)和蛋白(P<0.05)的表达。蛋白质印迹分析显示... 相似文献
4.
以千里光石油醚提取物（PEESS）为材料,以脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7小鼠单核巨噬细胞为炎症模型,通过CCK-8法检测细胞增殖、Griess法检测一氧化氮（NO）含量、RT-PCR法检测炎症相关因子的表达,及Western blot法检测炎症关键转录激活因子的活化,研究PEESS的抗炎作用及可能的分子机制。结果显示,0~80 μg/mL的PEESS对巨噬细胞增殖无明显影响,但能显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NO的分泌,并呈浓度依赖性;炎症相关因子基因mRNA表达检测结果显示：PEESS能显著抑制LPS刺激的RAW264.7 细胞炎症模型中IL-1β及IL-6的表达;同时,PEESS还显著降低了NF-κB p65及 p44/p22 MAPK蛋白的磷酸化水平。以上结果表明,千里光石油醚提取物对LPS 诱导的RAW264.7 细胞炎症模型具有较好的抗炎效应,其作用发挥可能与其抑制NF-κB和MAPK信号通路的活化以及NO、IL-1β和IL-6等炎症介质的分泌有关。 相似文献
5.
为研究白背天葵不同极性部位的抗炎效果及其机制,采用LPS诱导巨噬细胞RAW264.7建立炎症模型。Griess法检测白背天葵不同极性部位对LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO的影响;ELISA法测定细胞分泌TNF-α,IL-1β,IL-6及PGE2的含量;运用Western blot检测不同极性部位对LPS诱导的RAW264.7细胞核内NF-κB p65蛋白表达的影响。结果表明,白背天葵各极性部位均能不同程度地抑制LPS诱导的NO、TNF-α、IL-1β和IL-6的过量分泌和细胞核内NF-κB p65的蛋白表达,白背天葵正丁醇相和乙酸乙酯相能显著抑制LPS诱导的PGE2的分泌。综上,白背天葵的抗炎作用可能是通过抑制NF-κB p65通路活化,进而抑制炎症介质和促炎细胞因子的合成和释放来实现的。 相似文献
6.
探讨花椒中吴茱萸次碱含量的RP-HPLC测定条件,比较不同种源花椒中吴茱萸次碱的含量差异。结果表明,吴茱萸次碱的线性范围为14.4～27.0 μg·mL-1(r=0.999 5),平均回收率为98.63%(RSD=1.73%, n=5)。不同种源花椒中吴茱萸次碱的平均含量分别为:野花椒 24.050 μg·mL-1(RSD=1.77%, n=3); 凤县大红袍 23.677 μg·mL-1(RSD=4.94%, n=3); 韩城大红袍 18.869 μg·mL-1(RSD=3.00%, n=3); 秦安1号 17.173 μg·mL-1(RSD=2.45%, n=3)。RP-HPLC法测定吴茱萸次碱含量简便可靠,可作为花椒中吴茱萸次碱的快速测定方法。 相似文献
7.
【目的】利用虾青素较强的抗氧化特性,通过探讨黏膜屏障重塑对脂多糖（LPS）诱导的牛子宫内膜细胞炎症的影响,为牛子宫内膜细胞炎的预防和治疗提供理论基础。【方法】培养液中添加1 μg·mL -1 LPS,培养子宫内膜细胞6 h,检测培养液中炎症因子TNF-α和IL-6含量,建立细胞的体外炎症模型。在此基础上去掉培养液,重新加入含1×10 -6 mol·L -1 虾青素的新鲜培养液,继续培养细胞24 h。对照组为不添加LPS或AST,LPS组为仅添加LPS,AST组为添加LPS和AST。采用ELISA法检测培养液中TNF-α和IL-6炎症因子分泌量以及细胞SOD和CAT酶活性,利用流式细胞仪检测细胞内活性氧簇（ROS）水平,利用免疫荧光染色检测细胞紧密连接蛋白Claudin、CDH1、TJP1的分布情况,利用荧光定量RT-PCR法和Western Blot法分别检测Claudin、CDH1、TJP1基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平。【结果】利用1 μg·mL -1 LPS培养子宫内膜细胞6 h,检测发现培养液中炎症因子IL-6和TNF-α分泌水平显著高于对照组（P小于0.05）,说明LPS诱导子宫内膜细胞产生炎症反应。与对照组相比,细胞内ROS水平显著增加（P小于0.05）,SOD和CAT酶活性都显著降低（P小于0.05）,说明LPS诱导的子宫内膜细胞炎症造成了氧化损伤。加入1×10 -6 mol·L -1 虾青素培养细胞24 h后,发现培养液中IL-6和TNF-α因子的分泌水平显著低于LPS组（P小于0.05）,同时ROS阳性细胞比率显著下降（P小于0.05）,SOD和CAT酶活性都显著升高（P小于0.05）。LPS组与对照组相比,细胞膜处Claudin、CDH1、TJP1蛋白的荧光信号减弱,这3种紧密连接蛋白的mRNA和蛋白表达水平也都显著降低（P小于0.05）。加入1×10 -6 mol·L -1虾青素培养24 h后,与LPS组相比,在细胞边缘和细胞核内可以检测到荧光信号很强的Claudin、CDH1、TJP1蛋白,而且这3种紧密连接蛋白的mRNA和蛋白表达水平也都显著升高（P小于0.05）。【结论】虾青素通过降低子宫内膜细胞因炎症反应产生的氧化损伤,减轻炎症导致的子宫内膜细胞紧密连接结构损伤,对子宫内膜的物理免疫屏障起保护作用,为牛子宫内膜炎的预防和治疗提供理论借鉴意义。 相似文献
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《福建农林大学学报(自然科学版)》2020,(1)
探讨圆齿野鸦椿果实总黄酮(TFEP)对脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞RAW264.7细胞炎症反应的抑制效果.利用一氧化氮(NO)试剂盒检测不同浓度TFEP对LPS诱导RAW264.7细胞释放NO含量的变化;酶联免疫吸附法(ELISA)测定PGE2、白介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)分泌物的表达;实时定量逆转录聚合酶链反应法(qRT-PCR)检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、TNF-α和IL-6 mRNA的表达;蛋白质免疫印迹法(western blot)检测炎症NF-κβ/Stat3信号通路相关蛋白的表达.结果表明,TFEP对细胞产生NO的半数抑制浓度(IC_(50))为78.47μg·mL~(-1),且各试验浓度下对RAW264.7细胞增殖均无明显抑制作用,表现出低毒性和强抗炎活性.与LPS模型组相比,TFEP能显著降低LPS诱导的NO的分泌;抑制iNOS、TNF-α和IL-6 mRNA的表达,抑制炎症NF-κβ/Stat3信号通路的激活.因此,圆齿野鸦椿果实总黄酮对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应有良好的抑制作用. 相似文献
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[目的]探讨γ-亚麻酸（GLA）对脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7细胞产生炎症介质的影响及其机制。[方法]采用体外培养的巨噬细胞系RAW264.7细胞,待细胞生长至融合状态后加入不同浓度（0、12.5、25、50μmol/L）的GLA预孵4h,利用100ng/ml的脂多糖（LPS）刺激12h或0.5h,同时设空白对照和LPS对照,利用蛋白印迹法检测诱生型一氧化氮合酶（iNOS）、环加氧酶-2（COX-2）蛋白的表达以及对IκBα、p-JNK/SAPK（Thr183/Tyr185）、p38MAPK、p-p38MAPK（Thr180/Tyr182）、ERK1/2、p-ERK1/2的影响。[结果]GLA可以显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中iNOS和COX-2的蛋白表达（P〈0.05）,且在0～50μmol/LGLA浓度范围内存在剂量依赖关系。GLA可以显著抑制IκBα的降解（P〈0.05）,从而抑制NF-κB的激活。GLA可以显著抑制LPS诱导的JNK1/2以及ERK1/2的磷酸化（P〈0.05）,对p38的磷酸化没有显著的影响。[结论]GLA具有很好的消炎功效。抑制JNK1/2以及ERK1/2的磷酸化、抑制NF-κB的激活可能是其发挥生物学效应的重要机制。 相似文献
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目的 探讨阿尔泰瑞香二氯甲烷提取物（Da-Dm）的体外抗炎及抗氧化活性。方法 以不同浓度（1、6、30 μg/mL）的Da-Dm作用于脂多糖（LPS,1 μg/mL）诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞,采用CCK-8法测定Da-Dm对细胞增殖的影响;Griess法检测细胞上清液中一氧化氮（NO）的释放量;ELISA法检测细胞上清液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）的分泌量。以维生素C为对照,采用FRAP法、DPPH法评价Da-Dm总抗氧化能力。结果 Da-Dm在浓度为30 μg/mL及以下时对RAW264.7细胞增殖没有影响。与LPS组比较,1~30 μg/mL的Da-Dm可明显降低LPS诱导的RAW264.7细胞分泌炎症因子NO、IL-1β、IL-6和TNF-α的含量（P<0.05,P<0.01）,并呈现浓度依赖性。Da-Dm对DPPH自由基有较好的清除能力,其清除率的IC50为318.1 μg/mL,在FRAP实验中其对Fe2+离子具有较强的还原能力。结论 Da-Dm可以抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应,它的抗炎作用可能与抑制NO、IL-1β、IL-6和TNF-α的释放有关。Da-Dm具有较好的抗氧化活性。 相似文献
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不同根系分泌物对土壤N2O排放及同位素特征值的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】探究植物根系分泌的主要组分（有机酸、氨基酸、糖类）对土壤N2O排放及其微生物过程的影响,为选择适宜的植物进而控制土壤N2O排放提供支撑。【方法】通过室内试验分别添加草酸、丝氨酸、葡萄糖于土壤中模拟根系的3种主要分泌物,每种分泌物设置两个浓度水平：低浓度（150 μg C·d -1）和高浓度（300 μg C·d -1）,另设置添加蒸馏水的对照组,共7个处理。将土壤置于120 mL玻璃瓶中进行培养,24 h内采集气体样品7次,每次培养2 h,获取N2O排放速率、日累积排放量和同位素特征值（δ 15N bulk、δ 18O和SP（site preference,SP=δ 15N α-δ 15N β））。【结果】添加3种根系分泌物组分后,土壤N2O排放速率均逐渐升高,且均高于对照。高浓度处理组N2O累积排放量为：葡萄糖（（3.2±1.3）mg·kg -1·d -1）处理>丝氨酸（（2.6±0.5）mg·kg -1·d -1）处理>草酸（（1.4±0.2）mg·kg -1·d -1）处理,低浓度处理组为：草酸（（2.7±1.3）mg·kg -1·d -1）处理>丝氨酸（（1.8±0.4）mg·kg -1·d -1）处理>葡萄糖（（1.6±0.8）mg·kg -1·d -1）处理;添加根系分泌物的不同处理间土壤N2O的δ 18O值无明显差异,并稳定在24.1‰—25.6‰,且均显著高于对照（（20.1±1.5）‰）;土壤N2O的δ 15N bulk值与添加根系分泌物的种类有关,其中草酸处理组为（-20.06±2.22）‰、丝氨酸处理组为（-22.33±1.10）‰、葡萄糖处理组为（-13.86±1.11）‰、对照组为（-23.14±3.72）‰。各处理土壤N2O的SP值的变化范围为13.13‰—15.03‰,根系分泌物浓度越高,SP值越低。综合分析不同处理4个指标（N2O排放速率、N2O的δ 15N bulk、δ 18O和SP值）的不同时刻的检测值与日均值的校正系数,添加根系分泌物后第16小时各处理4个指标的校正系数最接近于1。【结论】在NH+ 4-300 mg N·kg -1的土壤环境下根系分泌物促进N2O的排放,且在培养期间（24 h）土壤N2O排放速率逐渐升高。高浓度处理组葡萄糖对土壤N2O排放速率促进效果最强,低浓度处理组草酸对土壤N2O排放速率促进效果最强。与对照组相比,根系分泌物的添加使N2O的δ 18O值显著升高;与对照组相比,葡萄糖的添加使δ 15N bulk值显著升高。根系分泌物浓度越高,反硝化作用对N2O的贡献越大。 相似文献
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【目的】 探讨酿酒酵母YSI-3.7在富集Cr（Ⅲ）形成葡萄糖耐量因子（GTF）过程中自身抗氧化机制以及硫在该过程中发挥的作用,以期揭示硫对降低铬胁迫,进而提高生物富铬的作用机理。【方法】 以高产GTF酿酒酵母YSI-3.7为目的菌株,通过设置不同浓度的Cr（Ⅲ）、硫组合进行生物富铬,测定不同条件下YSI-3.7菌株的生物富铬量以及相应氧化应激指标（如丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）等）的变化,分析硫对酵母菌体在Cr（Ⅲ）胁迫下的改善作用。【结果】 低浓度Cr（Ⅲ）（200 μg?mL -1）会刺激酵母YSI-3.7生长,使其生物量增加;而高浓度Cr（Ⅲ）（>500 μg·mL -1）对酵母生长有抑制作用。Cr（Ⅲ）浓度为500 μg?mL -1时,酵母中有机铬含量为（725.55±55.08）μg?g -1 DCW,总铬含量达（1 255.53±43.75）μg?g -1 DCW;Cr（Ⅲ）浓度为800 μg?mL -1时,有机铬为（536.25±36.89）μg?g -1 DCW,其中,总铬含量达（1 812.22±38.24）μg?g -1 DCW。随Cr（Ⅲ）浓度的增加（0—800 μg?mL -1）,菌体中MDA含量从11.83 nmol?mL -1升高到18.04 nmol?mL -1。SOD和CAT活力随Cr（Ⅲ）浓度升高而降低。在较低Cr（Ⅲ）浓度（≤500 μg?mL -1）下,谷胱甘肽（GSH）、总巯基、总抗氧化能力（T-AOC）含量均升高,但在高浓度Cr（Ⅲ）（800 μg?mL -1）下会降低。1 mmol?L -1 Na2SO3可以缓解Cr（Ⅲ）的胁迫作用,此时,酵母中蛋白质含量上升,MDA含量降低12.83%,CAT活力基本无影响,SOD活力提高4.41%,GSH、T-AOC、GSH-Px含量分别增加28.83%、14.29%和18.80%。【结论】 酵母富铬过程中,Cr（Ⅲ）胁迫作用可造成酵母膜脂过氧化程度加重。在较低铬浓度时（≤500 μg?mL -1）,酵母可以通过自身抗氧化酶系统缓解该胁迫作用,其中发挥重要作用的是谷胱甘肽及其相关酶。高浓度Cr（Ⅲ）（800 μg?mL -1）下,膜脂过氧化程度进一步加重,酵母自身抗氧化能力不足以抵御Cr（Ⅲ） 胁迫。硫（1 mmol?L -1 Na2SO3）可以通过提高酵母中SOD活力、GSH、T-AOC、GSH-Px含量,减轻Cr（Ⅲ）造成的膜脂过氧化程度,提高酵母自身抗氧化能力,进而提高酵母生物富铬效率。 相似文献
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【目的】双基因共整合可协同促进转基因生物的目的基因表达水平提高,研究获得rhPA/GH双转基因兔,并比较分析目的基因rhPA的表达水平及兔个体生长发育情况,为制备高表达rhPA转基因动物和遗传育种提供新思路。 【方法】利用NotⅠ/SalⅠ双酶切PCL25/GH质粒和QIAGEN DNA胶纯化试剂盒回收显微注射用基因片段。以3只rhPA单转基因兔（标号K06、K10、K17）作为供体兔,通过FSH/hCG超数排卵、受精卵原核显微注射、胚胎移植、苯酚/氯仿抽提新生仔兔耳尖组织基因组、PCR整合检测等方法获得rhPA/GH双转基因兔。经ELISA和Western blotting对转基因兔乳清进行表达检测,比较分析单、双基因表达rhPA水平。测量不同月龄的转基因兔体重,通过监测双转基因兔不同生长阶段的体重来分析GH对兔生长发育的影响。【结果】成功获得了约16 700 bp 大小的显微注射用基因片段,共超排3只供体兔获得122枚卵,其中103枚受精卵,受精率为84.4%（103/122）,显微注射后挑取形态较好的81枚移植6只同步发情受体兔,5只兔怀孕,妊娠率为83.3%（5/6）,妊娠到期共出生32只仔兔。通过PCR检测鉴定有19只携带rhPA基因的转基因兔,其中有11只rhPA/GH双转基因兔（7♂,4♀）,双基因整合率为34.4%（11/32）,且4只rhPA/GH双转基因母兔来源亲代分别为K06供体兔2只（标号K06-1、K06-2）、K10供体兔1只（标号K10-1）、K17供体兔1只（标号K17-1）。K06号rhPA单转基因兔乳清中rhPA表达量为42.2μg·mL-1,K06-1和K06-2号rhPA/GH双转基因兔乳清中rhPA表达量分别为432、444μg·mL-1;K10号rhPA单转基因兔乳清中rhPA表达量为42.8μg·mL-1,K10-1号rhPA/GH双转基因兔乳清中rhPA表达量为636μg·mL-1;K17号rhPA单转基因兔乳清中rhPA表达量为15.2 μg·mL -1,K17-1号rhPA/GH双转基因兔乳清中rhPA表达量为248 μg·mL -1。4只rhPA/GH双转基因母兔（K06-1、K06-2、K10-1、K17-1）乳腺表达rhPA含量在248-636μg·mL-1之间,远远高于rhPA单转基因母兔（K06、K10、K17）乳腺的表达含量（15.2-42.8μg·mL-1）,表达水平显著提高了约10.2-16.3倍,说明GH能够协同促进目的基因rhPA在转基因兔乳腺中的表达水平。Western blotting结果显示出现一约39.0 kD大小的条带,与目的蛋白rhPA大小相同,进一步证明转基因兔乳腺中表达的这种蛋白为目标产物rhPA。对rhPA/GH双转基因兔从出生到6个月的体重进行连续测量,发现与正常非转基因兔的体重没有明显的差异,绘制生长曲线进一步表明4只整合GH的转基因兔与2只未整合GH的正常兔在生长发育的不同阶段体重上没有显著性差异,成长至6个月的体重均在4.0-5.0 kg之间,这证明GH的导入并不影响转基因兔的存活和正常生长发育至成年。【结论】成功地制备了rhPA/GH双转基因兔,并证明了GH基因的导入能够显著地提高目的基因rhPA的表达量,且不会对转基因兔的生长发育产生影响,这为将来制备高表达转基因兔及其它动物奠定了基础,也为转基因动物乳腺生物反应器和转基因育种建立提供了新思路、新方法。 相似文献
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【背景】双酚A(BPA)广泛应用于塑料材料工业制造,其从塑料制品中渗出,暴露在食物、水、土壤和空气等多种环境介质中,导致动物长期接触,并经过胎盘和母乳传递给后代,干扰动物生长和发育,对动物生长性能和生产效率产生不利影响。N-乙酰半胱氨酸（NAC）作为公认的强效抗氧化剂,能够调节氧化应激、细胞凋亡、炎症等多种病理生理过程。然而,NAC对BPA诱导的猪肾细胞损伤的调节作用尚不清楚。【目的】探究抗氧化剂NAC在BPA诱导的PK15细胞凋亡和炎症反应中的潜在作用,为NAC在对抗BPA诱导的猪肾细胞损伤中的应用研究提供科学依据。【方法】选取PK15细胞为试验材料,采用相应的抗氧化检测试剂盒分别测定细胞内过氧化氢酶（CAT）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性变化;设置不同浓度NAC(0、2、5和10 mmol·L-1)预处理,并与BPA共处理PK15细胞,CCK-8检测细胞活力以筛选最佳的NAC作用浓度;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测凋亡相关基因（BAX、BCL-2和Caspase3）表达和炎症相关基因（IL-8、IL-6、IL-1β和TNF-α）m... 相似文献
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【目的】已有研究表明捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）Hc-hrg-2属于血红素应答基因,高浓度血红素的刺激可导致该基因的转录水平上调,但其在血红素调控中的功能尚缺乏研究。研究通过同源重组技术构建血红素合成缺陷型酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）hem1敲除株,通过异源表达Hc-hrg-2对该敲除株进行表型拯救试验,以期验证Hc-hrg-2参与细胞内血红素转运的功能。 【方法】以S. cerevisiae BY4741基因组为模板,设计引物,扩增获得hem1（SGD:S000002640）基因序列5' 和3' 侧翼区同源臂;同时以pYES2-CT质粒为模板设计引物,扩增获得筛选标记URA3序列;利用两次重叠PCR技术依次将测序正确的上游同源臂、URA3、下游同源臂序列串联成基因敲除组件,并通过醇沉法对敲除组件进行纯化。采用醋酸锂转化法将纯化的敲除组件转化至BY4741感受态细胞中, 经SD/- URA（含250 μmol·L-1 5-氨基乙酰丙酸（ALA））培养基筛选,并利用多对引物进行PCR鉴定,以验证Δhem1敲除株的正确性。同时以含有H. contortus 浙江株Hc-hrg-2 序列（GenBank：MK371241）及其功能域缺失序列Hc-hrg-2(Δgst-n) 和Hc-hrg-2(Δgst-c) 的质粒为模板,利用特异性引物分别进行PCR扩增,通过无缝克隆将扩增得到的目的片段插入酵母pESC-LEU表达载体,经PCR鉴定以及测序验证后,采用醋酸锂转化法将正确的表达载体转化至Δhem1感受态细胞中,通过SD/- URA/- LEU（含250 μmol·L-1 ALA）培养基筛选以及PCR鉴定验证阳性异源表达株的正确性。通过比较Δhem1敲除株及其各异源表达株在含有或不含有250 μmol·L-1 ALA的SD/- URA/- LEU液体培养基中的生长情况,进一步验证敲除株的表型同时排除表达载体对表型的影响。用2%半乳糖对含有阳性表达质粒的敲除株进行诱导,取部分菌液进行超裂破碎,收集蛋白,通过Western Blot鉴定目的蛋白的表达;剩余菌体用去离子水重悬至OD600 = 0.2,用去离子水进行5倍比稀释,取4 μL稀释后的菌液点至含有250 μmol·L-1 ALA或者不同浓度血红素的诱导平板上,28℃培养2—3 d后比较敲除株的生长情况。【结果】成功获得hem1基因敲除株Δhem1,与野生株相比,Δhem1不能合成血红素,需外源添加ALA（250 μmol·L-1）或血红素（≥ 10 μmol·L-1）才能生长,且异源表达株和敲除株的表型一致。Western Blot结果表明2%半乳糖能诱导Hc-hrg-2及其功能域缺失基因在敲除株中成功表达,且表达Hc-hrg-2能够在低血红素浓度下（≤ 1 μmol·L-1）促进酵母对血红素的摄取,拯救敲除株的生长缺陷,其硫氧还蛋白样结构域（GST-N）和谷胱甘肽S-转移酶C末端结构域（GST-C）的缺失会降低拯救的效果。【结论】捻转血矛线虫血红素应答基因Hc-hrg-2可促进细胞对血红素的摄取,其GST-N和GST-C功能域在该过程中发挥着重要作用,研究成果为后续深入研究捻转血矛线虫的血红素转运机制奠定基础。 相似文献
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【目的】克隆斑翅果蝇（Drosophila suzukii）气味结合蛋白56h（odorant binding protein 56h,OBP56h）基因,诱导表达斑翅果蝇OBP56h重组蛋白(DsuzOBP56h),研究其与小分子化合物的结合特性。【方法】通过RT-PCR并设计特异性引物克隆斑翅果蝇OBP56h ORF全长,从NCBI数据库中下载相似度高的昆虫气味结合蛋白序列,进行序列比对和分析。以NdeⅠ和XhoⅠ为酶切位点,将OBP56h连入pET-30a(+)原核表达载体,将重组质粒转入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞。扩大培养阳性菌株,并用IPTG诱导表达DsuzOBP56h重组蛋白。收集菌液,通过超声波破碎细胞得到蛋白,利用Ni-NTA柱纯化蛋白,进行Tris-HCl透析,用BCA法测定蛋白浓度。蛋白用50 mmol·L -1 Tris-HCl（pH 7.4）稀释至终浓度2 μmol·L -1,配基用色谱级甲醇稀释至终浓度1 mmol·L -1,以4,4′-二苯胺基-1,1′-联萘-5,5′-二磺酸二钾盐（4,4′-dianilino-1,1′-binaphthyl-5,5′-disulfonic acid dipotassium salt,bis-ANS）荧光探针为报告子,利用荧光竞争结合试验检测DsuzOBP56h蛋白与18种候选小分子化合物配基的结合特性。 【结果】克隆获得了斑翅果蝇OBP56h的ORF全长,共405 bp,N-端含有19个氨基酸组成的信号肽,具有6个保守半胱氨酸位点,符合OBP的典型特征,与其同属的黑腹果蝇OBP56h进化关系最近。成功连入pET-30a(+)表达载体,在1 mmol·L -1IPTG、28℃条件下诱导DsuzOBP56h蛋白表达,并过柱纯化得到目的蛋白。荧光光谱试验显示,荧光探针bis-ANS与DsuzOBP56h的解离常数为0.9568 μmol·L -1,适合作为本试验中竞争性荧光结合试验的报告子;进一步的荧光竞争结合试验表明,在18种候选配基中,苦味物质盐酸小蘖碱和香豆素与DsuzOBP56h的结合亲和性较强,解离常数分别为12.16和17.93 μmol·L -1,柚皮素与DsuzOBP56h的解离常数为25.32 μmol·L -1,草莓叶片产生的一种对斑翅果蝇具有吸引作用的挥发性气味物质β-环柠檬醛也能与DsuzOBP56h结合,其解离常数为31.37 μmol·L -1。【结论】斑翅果蝇气味结合蛋白OBP56h能与测试的多种植物苦味物质和挥发性气味物质结合,表明DsuzOBP56h很有可能参与斑翅果蝇对食物味觉和嗅觉的识别行为,研究结果可为理解斑翅果蝇的取食行为提供理论依据,并为开展斑翅果蝇的生态防控提供新思路。 相似文献
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【目的】 针对生产中危害严重的3种蔬菜土传病原菌瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）、尖镰孢（Fusarium oxysporum）、大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）,建立三重PCR（triplex PCR）检测体系,为蔬菜土传真菌病害的早期诊断和鉴定提供技术与方法。【方法】 筛选3种病原菌特异性引物组合,通过设定不同的PCR退火温度、引物浓度、循环次数以及延伸时间,探索影响三重PCR扩增的因素,建立蔬菜土传病原菌三重PCR检测体系,并对体系灵敏度进行检测。为了验证建立体系的稳定性,选择2×Taq Master PCR Mix（北京博迈德生物技术有限公司）和TaKaRa Taq酶（大连宝生物工程有限公司）2个不同公司的试剂,分别利用C1000 Touch TM型（赛默飞世尔科技有限公司）与Aeris TM型（新加坡艺思高科技有限公司）热循环仪进行三重PCR反应,比较检测结果的可重复性。对田间采集的35份病害样本和149份土壤样本,分别进行三重PCR和病原菌分离检测,以确定所建立得三重PCR检测体系的适用性。 【结果】 三重PCR反应体系中引物对AsAPH2B/AsPyF、FOF1/FOR1、VActF/VActR可分别扩增出瓜果腐霉、尖镰孢、大丽轮枝菌长度为163、328和530 bp的特异性目的片段。反应体系（25 μL）：0.12 μmol·L -1 AsAPH2B/AsPyF,0.16 μmol·L -1 FOF1/FOR1,0.24 μmol·L -1 VActF/VActR,2×Taq Master PCR Mix 12.5 μL,退火温度为60.8℃,35个循环。该体系对病原菌纯培养物的检测灵敏度为10 -1ng·μL -1,对土壤中大丽轮枝菌、尖镰孢和瓜果腐霉的检测灵敏度分别为10 5、10 6个孢子/g土壤和10 -2mg菌丝/g土壤。分别采用2×Taq Master PCR Mix和TaKaRa Taq酶,利用C1000 Touch TM型和Aeris TM型热循环仪进行三重PCR,扩增结果一致,说明三重PCR体系检测稳定性好。对田间采集的病害和土壤样本进行检测,25份病害样本和71份土壤样本中检测出带菌,三重PCR检测与病原菌分离培养结果一致。 【结论】 本研究建立的瓜果腐霉、尖镰孢、大丽轮枝菌三重PCR检测体系具有灵敏度高、稳定性和重复性好的特点,能够快速、准确地检测田间病株及其根围土壤中的瓜果腐霉、尖镰孢、大丽轮枝菌,为蔬菜土传病害的早期预防和流行监测提供了有效的技术手段。 相似文献
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【目的】探讨特丁基对苯二酚(tert-Butylhydroquinone,TBHQ)对鸡舍细颗粒物(fine particulate matter,PM2.5)诱导鸡胚肺损伤的缓解作用及机制,为预防和缓解鸡舍PM2.5污染引起的鸡呼吸道健康问题提供理论依据。【方法】选用14日龄鸡胚作为研究对象,首先建立鸡舍PM2.5诱导鸡胚肺组织损伤模型,再利用鸡胚肺损伤模型研究TBHQ的缓解作用。在建立鸡舍PM2.5诱导鸡胚肺组织损伤模型试验中,选取不同浓度的PM2.5(0、0.25、0.5、1 mg·mL-1)在14日龄鸡胚卵白处注射,5 d后,观察鸡胚存活率以及鸡胚肺组织形态,选取合适的PM2.5处理浓度(0.25 mg·mL-1),建立鸡胚肺损伤模型。在TBHQ对PM2.5诱导鸡胚肺损伤的影响试验中,将14日龄鸡胚分为对照组(生理盐水)、PM2.5组(0.25 mg·mL 相似文献
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【目的】开展了泰地罗新注射液的体外抗菌活性及对仔猪感染副猪嗜血杆菌的保护作用研究。【方法】体外抑菌活性中,采用试管二倍稀释法,以泰拉霉素为对照,测定泰地罗新对副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌的最小抑菌浓度（MIC）;在对仔猪感染副猪嗜血杆菌的保护作用中,选择菌量为1×10 10 CFU·mL -1的副猪嗜血杆菌细菌悬液0.5 mL·kg -1bw作为攻毒剂量,进行腹腔注射,复制病理模型。将泰地罗新以2、4、8 mg·kg -1bw 3个剂量,泰拉霉2.5 mg·kg -1bw单次肌肉注射,治疗人工感染副猪嗜血杆菌的仔猪;在病死猪病料病原菌分离与鉴定中,挑取分离纯化后的副猪嗜血杆菌菌落进行基因组DNA提取,针对副猪嗜血杆菌16sRNA序列设计1对特异性引物,PCR扩增后检验目的DNA片段碱基序列长度。 【结果】体外抑菌结果显示,泰地罗新注射液对副猪嗜血杆菌、支气管败血性波氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌及多杀性巴氏杆菌的MIC分别为0.06—8.00、0.06—8.00、0.25—1.00、2.00—32.00 μg·mL -1,MIC50分别为0.5、2.0、4.0、0.5 μg·mL -1,MIC90为2、8、16、1 μg·mL -1,结果表明,泰地罗新注射液对副猪嗜血杆菌、支气管败血性波氏杆菌抑菌效果较强,对胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌抑菌效果较弱;DNA目标片段PCR扩增结果显示,PCR扩增目标片段长度均与文献报道中预测条带一致,特异性片段长度为820bp左右,结果表明,病死猪只均死于副猪嗜血杆菌感染;体内治疗试验结果显示,泰地罗新注射液低、中、高剂量组增重分别为（2.5±0.2）、（2.9±0.2）、（2.9±0.3）kg,死亡率分别为40%、0、0,有效率分别为40%、100%、100%,治愈率分别为40%、100%、100%;泰拉霉素注射液组增重为（3.0±0.2）kg,死亡率为10%,有效率为90%,治愈率为80%;感染不给药组增重为（2.1±0.1）kg,死亡率为70%。结果表明,泰地罗新注射液高、中剂量组与泰拉霉素对照药物组无显著性差异（P>0.05）,均能迅速的减轻临床症状,具有显著的治疗效果。泰地罗新低剂量组治疗效果与感染不给药组相当,无显著性差异（P>0.05）。 【结论】泰地罗新注射液按4 mg·kg -1bw临床推荐给药剂量,可有效治疗由副猪嗜血杆菌感染引起的猪呼吸道疾病。 相似文献
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【目的】明确烤肉制品中硝基多环芳烃（NPAHs）的含量水平,建立固相萃取柱结合高效液相色谱-荧光检测器测定烤肉制品中5种NPAHs（1-硝基萘、2-硝基芴、3-硝基荧蒽、1-硝基芘和6-硝基苯并[a]芘）的方法。【方法】称取1 g真空冷冻干燥的烤肉样品,加入二氯甲烷超声提取并过滤收集滤液,重复提取3次。将滤液氮吹至近干,加入3 mL正己烷溶解。依次用二氯甲烷和正己烷活化多环芳烃固相萃取柱,上样后用正己烷荡洗样品管然后继续上柱;用正己烷淋洗,二氯甲烷洗脱;将洗脱液氮吹至近干,用乙腈溶解得到NPAHs待测液。向待测液中加入酸化甲醇和铁粉,磁力搅拌水浴加热40 min,离心并过滤膜后通过高效液相色谱-荧光检测器检测,其中色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse PAH柱,设置柱温40℃,进样量20 μL,流动相选用水和乙腈,采用梯度洗脱模式。【结果】5种NPAHs在相应质量浓度范围内线性关系良好,相关系数大于0.9940,检出限为0.12—2.17 μg·kg-1,定量限为0.38—7.23 μg·kg-1,平均回收率为53.16%—129.64%,精密度为1.91%—30.73%。利用该方法对我国5类典型的烤肉样品进行检测,测得5种NPAHs总含量为50.19—82.36 μg·kg-1,其中6-硝基苯并[a]芘含量最高,约为31.01—35.89 μg·kg-1,其次是3-硝基荧蒽,约为9.99—23.06 μg·kg-1。【结论】固相萃取柱结合高效液相色谱-荧光检测法适用于烤肉制品中NPAHs的分析;我国烤肉制品中普遍存在NPAHs。 相似文献