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《中国预防兽医学报》2021,(5)
氟苯尼考(FFC)具有胚胎毒性,在食用动物组织中残留会严重危害消费者的健康与安全。为建立快速检测动物性食品中FFC残留的方法奠定基础,本研究根据引物设计原则,设计了上下游引物,根据引物序列构建长度为80 bp的随机单链寡核苷酸(ssDNA)文库,其3'端和5'端为固定的20 bp引物结合位点,中间为40 bp的随机序列。通过氧化石墨烯-富集配体系统进化技术(GO-SELEX)筛选,即将经过预处理的ssDNA文库与等摩尔量的FFC及氧化石墨烯(GO)沉淀共孵育。通过GO的π-π共轭键吸附未结合靶标FFC的ssDNA,已结合靶标的ssDNA(FFC-ssDNA)则留在上清液中,通过离心获得FFC-ssDNA复合物。将每一轮筛选的FFC-ssDNA复合物经离心、抽提、醇沉淀回收所得到的ssDNA做为模板进行PCR扩增,通过链霉亲和素将PCR产物的双链DNA(dsDNA)彻底裂解为单链,作为次级ssDNA文库进入下一轮筛选。每一轮的筛选均计算一次回收率,当回收率变化趋于稳定时,引入反筛选物氯霉素(CAP)、甲砜霉素(TAP),以去除与FFC特异性结合较差的ssDNA。当回收率达到饱和,筛选停止。最终,根据回收率的计算结果共进行了12轮核酸适配体的筛选,其中有10轮为正筛选,第7轮和第11轮为反筛选。PCR结果显示,经12轮筛选均得到了所需要的目的 ssDNA片段。对第9轮和第12轮的筛选产物克隆并测序,共得到46条不同的核酸适配体序列。经对46条核苷酸序列的二级结构、自由能(△G)预测和亲缘性分析,最终得到A1、A26、A27、A31、B18、B28、B30、B37共8条候选核酸适配体。通过测定8条候选适配体的解离常数(Kd值)分析其与FFC的亲和性。结果显示,8条候选适配体的Kd值在11.811 nmol/L～54.097 nmol/L;利用相同浓度的FFC、CAP、TAP对其中亲和性较高的A26和B18进行特异性试验,结果表明两条核酸适配体均可以与FFC特异性结合,且B18与FFC的特异性结合作用更强,可作为FFC的特异性核酸适配体。本研究首次对FFC的核酸适配体进行SELEX筛选,为建立快速检测动物性食品中FFC残留方法奠定基础。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2021,(8)
为筛选猫细小病毒(FPV)特异性核酸适配体,本研究利用体外指数富集的配体系统进化技术(SELEX),从80 nt的单链DNA随机文库中筛选出与FPV高亲和力、高特异性结合的核酸适配体。对FPV适配体共进行14轮筛选,采用dot blot鉴定,确定其中的Apt27和Apt52为候选适配体。MTT试验表明,Apt27和Apt52对CRFK细胞(猫肾细胞)无毒性作用。利用酶联寡核苷酸法(ELONA)测定Apt27和Apt52的解离常数,结果显示分别为18.3249±7.1723 nmol/L和24.7882±10.0067 nmol/L。同时采用dot blot、间接免疫荧光试验(IFA)方法检测Apt27和Apt52对不同病毒的结合情况,结果显示其对猫杯状病毒、猫疱疹病毒的结合力弱,而对FPV的结合能力较强。预测二者二级结构可见,Apt27和Apt52均具有环状、发卡状结构,其中茎环结构可能为适配体特异性识别FPV的基本结构。本研究首次筛选到特异性识别FPV的适配体序列,为FPV的检测与治疗制剂的开发提供了新思路。 相似文献
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结核分支杆菌核酸适配体研究进展 总被引：1，自引：0，他引：1
结核分支杆菌（MTB）是引起多种宿主感染结核病的重要病原菌,由于结核分支杆菌耐药菌株的产生,导致结核病在世界范围内呈高发趋势。由于 MTB 检出率较低,开发一种简单快速的诊断方法迫在眉睫。指数富集配体系统进化技术（SELEX）的原理是从随机寡核苷酸文库中筛选到能特异性结合靶物质的寡核苷酸配体（称为适配体）。论文对近几年国内外通过 SELEX 技术对结核分支杆菌筛选出的适配体做一综述,适配体的靶物质分别为分泌蛋白 MPT64,CFP10-ESAT6蛋白,多磷酸激酶2（PPK2）以及结核分支杆菌（H37Rv 株）整个菌体。体外筛选的结核分支杆菌适配体,能对结核病做出早期诊断,并能作为 MTB疫苗的免疫佐剂,在临床诊断及药物研究等方面有很大应用前景。 相似文献
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《中国动物传染病学报》2017,(2)
为筛选出兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)衣壳蛋白VP60特异性核酸适配体,建立新型的兔出血症(rabbit hemorrhagic disease,RHD)检测方法,本研究构建了一个长80 nt的随机寡核苷酸文库。以固定在PVDF膜上的VP60为靶分子,使用消减SELEX技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)进行20轮的筛选,以生物素标记的次级文库作为"一抗",以辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素作为"二抗",对文库进行Western blot鉴定,结果表明第20轮文库存在可特异性的识别VP60的核酸序列。随机选取第20轮文库的46条序列克隆、测序,得到20个高度同源序列,同时对46个适配体再次鉴定,最终得到3个特异性识别VP60的适配体。 相似文献
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指数富集的配体进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)是通过设计并合成一个含大量随机寡核苷酸文库,从中筛选出与靶分子特异结合的寡核苷酸,并结合体外PCR扩增技术,使其得到指数级富集,经多个循环分离得到亲和力和特异性最高的寡核苷酸结合序列.筛选出的寡核苷酸片段被称为适配体(Aptamer).适配体的概念最早是由Tuerk提出来的,适配子与其靶本子结合过程类似抗原抗体反应,凡是涉及抗体的领域几乎都可用适配体代替[1].近年来,随着SELEX相关技术的不断发展,适配体作为治疗药物已被广泛应用于生物医学的很多领域[2],如心血管疾病治疗、肿瘤的显像和治疗、靶向药物的输送和释放、艾滋病治疗等,本文就适配体治疗药物的特点、研究现状及其在传染病的防治领域的应用前景作一综述. 相似文献
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核酸适配体与单克隆抗体相比具有更高的分辨率,能识别配体间一个基团的细微差别,且所需的结合活性位点更小。本试验通过SELEX技术,体外经过12轮筛选获得了能够与F48E9株新城疫病毒特异性结合的3个RNA适配体,命名为FHN12-45-3、FHN12-36-6和FHN12-19-9。RNA适配体的二级机构预测结果显示,所筛选获得的RNA适配体空间结构以外环、内环、发夹环及突起结构为主。特异性试验结果显示,适配体FHN12-45-3经ELISA和Dot-blot试验证实能够区分不同株的新城疫病毒。生物学活性试验结果显示,适配体FHN12-45-3能够减少4个单位的F48E9株病毒血凝效价,初步表明适配体与F48E9株病毒可能的活性作用位点在血凝素蛋白上,在鸡胚成纤维细胞培养体系中适配体FHN12-45-3能够减少84.62%的F48E9株病毒蚀斑,荧光定量RT-PCR方法检测适配体FHN12-45-3能够减少培养体系中77.73%病毒载量,表明筛选的RNA适配体在细胞水平能够有效的抑制F48E9株新城疫病毒的复制。 相似文献