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【目的】研究异种器官移植免疫排斥相关基因B4GALNT2的亚细胞定位情况。【方法】以版纳微型猪近交系(BMI)为试验对象,通过RT-PCR方法获得B4GALNT2基因cDNA序列,运用分子克隆技术构建B4GALNT2和报告基因EGFP的重组真核表达载体pEGFP-C1-B4GALNT2,将其转染猪肾上皮细胞PK15进行瞬时表达,同时用Mito Tracker和Hoechst33342荧光染料分别对线粒体和细胞核染色,通过EGFP示踪检测B4GALNT2在PK15细胞中的表达和定位。【结果】成功构建了BMI B4GALNT2基因的绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1-B4GALNT2,转染PK15细胞后主要在细胞质中检测到绿色荧光蛋白的表达,试验结果与PSORTⅡserver网站的预测一致。【结论】B4GALNT2蛋白主要定位于细胞质,揭示该蛋白主要在细胞质中发挥其功能作用。 相似文献
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[目的]克隆广西巴马小型猪特异性蛋白1(SP1)基因,并构建其真核表达载体,为揭示其对猪生长发育的调控机理打下基础.[方法]利用RT-PCR从广西巴马小型猪背最长肌组织中扩增SP1基因,采用DNASTAR、TMHMM等分别进行基因生物信息学分析;以pEGFP-N1质粒构建真核表达载体pEGFP-N1-SP1并转染293T细胞,于转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察并拍照.[结果]克隆获得的广西巴马小型猪SP1基因与GenBank中野猪(Sus scrofa)的参考序列(XM_005652569.3)一致,未发现碱基突变位点;其编码序列(CDS)全长2340 bp,编码779个氨基酸.广西巴马小型猪SP1蛋白不存在跨膜结构,也不存在信号肽,不属于分泌型蛋白;其二级结构中α-螺旋占17.84%,延伸链占21.31%,β-转角占9.76%,无规则卷曲占51.09%.构建的真核表达载体pEGFP-N1-SP1能成功转染至293T细胞中并表达出绿色荧光蛋白.[结论]广西巴马小型猪SP1基因CDS序列编码蛋白主要参与细胞内活动,而非外分泌型蛋白,以SP1基因构建的真核表达载体pEGFP-N1-SP1能转染293T细胞并成功表达,可直接用于后期SP1基因功能探索及干扰表达等研究. 相似文献
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pEGFP-N1-hTERT真核表达载体的构建与表达鉴定 总被引：2，自引：0，他引：2
[目的]构建pEGFP-N1-hTERT真核表达载体,观察其在真核细胞中的表达。[方法]利用pC1-neo-hTERT和pEGFP-N1质粒构建重组质粒,通过双酶切鉴定、DNA测序分析验证人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)片段的准确性。将pEGFP-N1-hTERT真核表达载体转染到大鼠胎儿神经干细胞(NSCs)中,通过绿色荧光蛋白间接观察人端粒酶逆转录酶蛋白在细胞中的表达定位,通过RT-PCR、WesternBlot验证所构建的真核表达质粒pEGFP-N1-hTERT的正确性。[结果]所构建的pEGFP-N1-hTERT真核表达载体结构正确并能够在真核细胞中表达。[结论]该研究为建立大鼠永生化NSCs系奠定了基础。 相似文献
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目的:构建贵州白香猪LPL基因与增强型绿色荧光蛋白基因的融合表达载体pEGFP-N3-LPL,转染Vero细胞,观察重组质粒的表达.方法:采用HindⅢ和BamHⅠ两种限制性内切酶获得LPL基因编码区片段和pEGFP-N3线型载体,将目的片段与该载体连接、转化、挑取阳性克隆,进行菌落PCR、双酶切及测序鉴定.使用Lipofectamine2000将重组质粒转染Vero细胞,观察细胞中绿色荧光蛋白的表达并对其进行mRNA检测.结果:成功构建重组真核表达载体pEGFP-N3-LPL,经mRNA检测,实验组在1 500bp处出现特异性条带,说明重组载体已在Vero细胞中获得表达.结论:本试验构建的真核细胞表达载体pEGFP-N3-LPL,为进一步阐明LPL基因与肌内脂肪沉积间的生物学作用机制奠定了基础. 相似文献
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组织蛋白酶Z基因(Cathepsin Z gene, CTSZ)是影响猪生长、肉质等性状的一个重要候选基因.本研究以长白猪的背最长肌为试验材料,采用RT-PCR的方法克隆CTSZ基因CDS序列全长,对该序列进行了生物信息学分析,并构建pEGFP-N1-CTSZ融合表达载体,通过脂质体介导瞬时转染猪成纤维细胞,30 h后进行荧光表达检测.结果本试验克隆出猪CTSZ基因CDS全序列912 bp,并成功构建pEGFP-N1-CTSZ融合表达载体,瞬时转染后在猪成纤维细胞中表现为绿色荧光蛋白表达.本试验为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础. 相似文献
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以欧美杨为材料,通过RT-PCR方法从欧美杨叶片中克隆到了抗旱脱水素DHN2b基因(命名为PdDHN2b),该基因开放阅读框为1 440 bp,编码379个氨基酸,绝大多数氨基酸组成属于亲水性氨基酸,无明显跨膜结构域。亚细胞定位表明PdDHN2b基因定位在细胞质或细胞膜上。荧光定量PCR分析表明:该基因在顶端中表达量最高,功能叶、根和茎中则无表达。同时该基因受NaCl、ABA和干旱等诱导表达。另外,构建了原核表达载体pET-PdDHN2b,并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白,诱导纯化后免疫小白鼠,制备抗体。SDS-PAGE电泳结果表明,融合蛋白分子量为58 ku。最后利用Ni-NTA纯化的PdDHN2b-his重组蛋白用于Western blot分析。 相似文献
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为探讨PRRSV非结构蛋白4(NSP4)功能,体外构建了pEGFP-N1-nsp4真核表达载体,转染Marc-145细胞,利用NSP4-GFP融合蛋白携带的绿色荧光标记,研究NSP4蛋白在Marc-145细胞中的定位,并根据蛋白疏水性设计构建含有nsp4基因N端不同长度的重组pEGFP-N1表达载体,转染细胞以进一步了解NSP4蛋白是否存在核定位信号序列及其在细胞中的分布。试验结果表明:融合蛋白主要位于细胞核,部分在胞浆内。PRRSV NSP4蛋白铰链区(hinge region,HR)145～168氨基酸是决定蛋白核内定位的功能区,该片段缺失影响NSP4蛋白进入细胞核。结论:体外转染细胞内表达的NSP4蛋白主要分布在细胞核内,HR区是其核定位信号,NSP4蛋白通过HR区信号作用主动进入细胞核内。 相似文献
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[目的]构建牛TLR2全长基因表达质粒,并在HEK293细胞中表达。[方法]利用RT-PCR技术克隆TLR2基因的全长编码区,连接到pMD18-Tsimplevector,再亚克隆到pEGFP-N1载体,得到包含TLR2基因全长的重组真核表达质粒。将重组质粒瞬时转染到HEK293细胞。流式细胞计数法和共聚焦显微镜法检测转染效率和表达蛋白在细胞中的定位;qRT-PCR法检测TLR2 mRNA在HEK293/boTLR2中的表达。最后,通过脂膜酸刺激HEK293/boTLR2细胞试验来分析TLR2蛋白的生物活性。[结果]成功克隆TLR2基因全长并连接到真核表达载体,并在HEK293细胞中表达。在LTA刺激的条件下,转染重组质粒的细胞比未转染的HEK293细胞分泌更多IL-8。[结论]本研究建立的细胞模式为TLR激动剂和拮抗剂的筛选提供快速有效的手段,有利于开展TLR激动剂和TLRs相互作用的研究。 相似文献
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Fox N1基因主要表达于胸腺上皮细胞和皮肤角质细胞,在胸腺发育、T细胞增殖、毛发生长、指甲发育等方面发挥重要作用。Fox N1基因存在多种转录变异体,人类Fox N1基因已发现18种转录变异体。转录变异体的存在使基因差异表达和蛋白质多样性存在可能。为深入研究转录变异体生物学功能,研究将前期发现的猪Fox N1基因3种转录变异体分别连入p EGFP-N1载体内,构建各自融合蛋白,转入猪PK15细胞,利用荧光显微镜观察转录变异体亚细胞定位情况。结果表明,p EGFP-N1空载体转染表达绿色荧光蛋白在PK15细胞核和细胞质均匀分布,而重组载体p EGFP-N1-Fox N1(a/b/c)表达的融合蛋白仅在细胞核内均匀分布。结果可为3种转录变异体后续功能研究奠定基础。 相似文献
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[目的]为牛结核病DNA疫苗的研制提供参考。[方法]利用PCR技术扩增出牛分枝杆菌ag85b基因片段,克隆到真核载体pcD-NA3.1(+)上,构建重组质粒pcAg85B,将重组质粒转染SP2/0细胞,间接免疫荧光试验检测该基因的表达情况。[结果]结果表明:在转染了重组质粒pcAg85B的SP2/0细胞中出现绿色荧光,说明ag85b基因在SP2/0细胞中成功进行了瞬时表达。[结论]为研究牛分枝杆菌ag85b DNA疫苗奠定了基础。 相似文献
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从120日龄的长白猪脑垂体组织中扩增出pGH基因的cDNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-N1真核表达载体上,构建pEGFP-N1-pGH重组质粒。通过PCR扩增、酶切电泳分析和测序的方法对重组DNA进行鉴定,并将其转染PK15细胞,通过荧光素酶活性检测特异性表达强度.结果表明,成功构建了pEGFP-N1-pGH真核表达载体,为转基因猪的研究奠定了基础。 相似文献
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人LIF基因与增强型绿色荧光蛋白融合表达载体的构建及转染 总被引：1，自引：0，他引：1
目的：构建携带人LIF基因与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合表达载体,并转染人胚肺成纤维细胞,为研究LIF在维持人胚胎生殖细胞自我更新中的作用机制奠定基础．方法：以重组质粒pcDNA3．1／lif为模板,PCR扩增LIF基因,将扩增片断双酶切后连接到质粒pEGFP-N1中,形成重组表达载体pEGFP—N1／lif．并用脂质体法转染人胚肺成纤维细胞,荧光显微镜下观察,RT—PCR及Western杂交检测融合蛋白的表达．结果：成功构建融合表达载体pEGFP—N1／lif,在人胚肺成纤维细胞实现表达,检测到融合蛋白EGFP—LIF．结论重组pEGFP—N1／lif载体构建成功,可用于标记LIF蛋白、为进一步研究LIF在维持人胚胎生殖细胞自我更新中的作用机制奠定基础． 相似文献
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【目的】明确石斑鱼虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus,SGIV）主要衣壳蛋白（Major capsid protein,MCP）的生物学功能,为阐明SGIV感染致病机理及研发抗病毒产品提供理论依据。【方法】使用实时荧光定量PCR检测SGIV感染过程中MCP基因的转录时序及其在SGIV感染石斑鱼脾脏、肝脏、肾脏、肠道、胃和鳃组织中的表达水平;将SGIV MCP基因分别克隆至真核表达载体pEGFP-N3和pcDNA3.1上,构建重组质粒pEGFP-N3-MCP和pcDNA3.1-MCP,然后以重组质粒pEGFP-N3-MCP转染石斑鱼脾细胞（Grouper spleen cell,GS）进行亚细胞定位分析,同时以重组质粒pcDNA3.1-MCP转染胖头鲤细胞（Fathead minnow cells,FHM）构建能稳定表达MCP蛋白的FHM细胞系（FHM-MCP）,用于分析MCP蛋白对宿主细胞生长增殖及SGIV感染压力下细胞存活率和病毒复制的影响。【结果】在SGIV感染8 h后即可检测到MCP基因的特异性转录,即MCP基因是一个晚期基因。在SGIV感染24 h后,MCP基因在石斑鱼脾脏中的相对表达量最高,其次是在肝脏、肾脏和肠道组织中,而在胃和鳃组织中的相对表达量较低,提示胃和鳃组织并非SGIV感染的主要靶器官。SGIV的MCP蛋白主要定位于细胞核附近的胞质中。细胞生长增殖曲线和细胞计数结果均证实,MCP蛋白能调节细胞生长及促进细胞分裂增殖。在SGIV感染后24和48 h,FHM-MCP细胞的存活率均显著高于FHM-Vector细胞（真核表达载体pcDNA3.1转染FHM细胞）,其存活率分别是FHM-Vector细胞的1.12和1.15倍。此外,FHM-MCP细胞在SGIV感染24和48 h后,其病毒滴度均高于FHM-Vector细胞,即MCP蛋白能促进SGIV病毒复制。【结论】SGIV的MCP基因是一个晚期基因,其编码蛋白主要定位于细胞核附近的胞质中,通过促进宿主细胞分裂增殖及病毒复制,最终提高SGIV的病毒滴度和感染力。 相似文献
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[目的]研究鸡Mx蛋白在293T细胞中的表达并检测其抗病毒活性。[方法]将鸡的Mx基因克隆入pEGFP-C1载体,经筛选鉴定后磷酸钙法转染293T细胞,并对转染细胞进行荧光分析以及RT-PCR与Western blot鉴定,同时提取细胞蛋白质,微量细胞病变试验检测其抗新城疫病毒的活性。[结果]试验构建的pEGFP-C1-cMx真核表达载体转染293T细胞后,在胞浆中可检测到绿色荧光,RT-PCR与Western blot结果进一步证实,pEGFP-C1-cMx可在293T细胞中表达,微量细胞病变试验显示,表达的融合蛋白可保护鸡胚成纤维细胞免受新城疫病毒感染。[结论]试验构建的pEGFP-C1-cMx表达载体可在293T细胞中表达具有抗新城疫病毒活性的鸡Mx蛋白。 相似文献
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[目的]为研究转生长相关基因对猪的作用。[方法]采用RT-PCR方法,从13/17罗伯逊易位杂合子猪小肠组织中提取总RNA,将其纯化后作为PCR扩增模板,参考GenBank公布的猪Ghrelin的mRNA序列设计合成具有Nhe I和Hind III双酶切位点引物,扩增获得Ghrelin基因cD-NA全长序列。将准确的Ghrelin基因片段克隆于 pMD19-T simple Vector后进行序列分析,获得猪Ghrelin基因cDNA全长基因片段。经Nhe I和Hind III双酶切,将 Ghrelin基因cDNA片段连接到真核表达载体pEGFP-N1,获得真核表达载体的重组质粒pEGFP-Ghrelin。重组质粒转染猪成纤维细胞,观察标记基因荧光蛋白的表达。[结果]13/17罗伯逊易位杂合子猪的Ghrelin基因与已发表的序列相同,并成功获得具备猪Ghrelin基因全长cDNA序列的真核表达载体pEGFP-Ghrelin。[结论]构建的真核表达载体可以用于转基因猪的进一步试验,同时也为研究Ghrelin的调节机制奠定基础。 相似文献
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[目的]构建EV71病毒3C蛋白的真核表达载体,并验证其在细胞中的正确表达。[方法]采用RT-PCR技术,从EV71病毒基因组RNA中扩增3C基因,克隆到真核表达载体pc DNA3.0-Flag上,并转染He La细胞,通过Western blot和免疫荧光验证3C蛋白的表达。[结果]酶切及测序鉴定显示,EV71病毒3C真核表达载体构建成功。Western blot和免疫荧光结果证实3C蛋白在He La细胞中成功表达。[结论]该研究成功构建了真核表达载体pc DNA3.0-Flag-3C,为进一步研究EV71病毒3C蛋白生物学功能奠定了一定基础。 相似文献