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内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(endo-β-N-acetylglucosaminidase,Endo/ENGase,EC3.2.1.96)是一类特异性识别并切割N-连接聚糖核心结构中两个N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine,Glc NAc)之间的β-1.4-糖苷键的糖苷酶,广泛应用于蛋白质N-糖基化分析。为表征粪肠球菌(Enterococcus faecalis)来源的内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的酶学特性,本研究通过PCR扩增粪肠球菌内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因endoEf,并通过无缝克隆的方式构建原核表达载体pET-28a-endoEf,在实现重组表达和纯化的基础上对EndoEf蛋白的催化特性及关键催化残基进行分析。结果表明,EndoEf可在大肠杆菌中以可溶形式高效表达,经钴离子亲和层析可获得高纯度的目标蛋白,每升菌液可纯化202.1 mg目标蛋白;以RNase B为底物,其比活力为1.0×10~4U/mg。EndoEf包含保守基序DXDXE,属于糖苷水解酶18(glycoside hydrolases 18,GH18)家族,可以酶切天然及变性状态下的核糖核酸酶B(ribonuclease B,RNase B)和鸡卵清蛋白(ovalbumin,Ova);基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)进一步证明了EndoEf对RNase B上N-连接糖链的水解。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)显示,EndoEf表观分子量为30.2 kD。酶学性质分析表明,EndoEf最适温度为40℃,最适pH范围为5.0~7.0;在温度为40~50℃、pH 7.0~9.0之间具有较好的稳定性,可耐受1 mol/L NaCl、100 mmol/L DTT、2%SDS和2%Triton X-100。定点突变技术构建EndoEf的3个突变体D125N、D127N和E129Q,并对突变体酶活性进行分析表明,E129Q活性几乎完全丧失,D127N丧失大部分水解活性,而D125N没有明显活性改变,说明EndoEf的129位谷氨酸是催化必须氨基酸。EndoEf重组表达体系的建立和酶学性质的分析为其在糖蛋白研究中的实践应用提供了科学依据。 相似文献
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海藻寡糖增效尿素对水稻光合特性及碳代谢产物积累的影响 总被引：2，自引：0，他引：2
采用盆栽试验,研究了海藻寡糖增效尿素对水稻光合特性、碳代谢关键酶活性及相关产物积累的影响。结果表明,和普通尿素相比,海藻寡糖增效尿素处理的水稻净光合速率( Pn )、气孔导度( Gs )、胞间CO2浓度(Ci)和水分利用效率(WUE)有所增加,气孔限制值(Ls)有所降低,叶绿素含量和核酮糖－1,5－二磷酸羧化加氧酶(Rubisco)活性显著提高。拔节期、齐穗期和成熟期叶中和籽粒中蔗糖磷酸合成酶(SPS)、蔗糖合成酶( SUS)和腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶( ADPase)活性显著增强,从而促进籽粒中蔗糖和淀粉积累;地上部和地下部生物量在4个生育期也均显著增加,籽粒产量显著提高,其中较对照增加9.32％,较普通尿素处理增加3.94％。 相似文献
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纤维素酶的工业应用一直受酶活性低,成本高的限制,为了提高中性内切葡聚糖酶的活性,本研究利用易错PCR技术对来自枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis )C-36的内切葡聚糖酶基因进行定向进化研究,在酶分子水平上改造内切葡聚糖酶分子.实验获得了最佳突变株b-15和b-28,其内切葡聚糖酶活力比亲本酶分别提高了2.1和3.6倍.序列分析表明:突变体b-15有6个碱基发生了突变,分别是A360G、T402A、A419T、T648A、A1208G和A1397T,导致4个氨基酸突变,分别是N134K、Q140L、N403S和Q466L;b-28只有1个碱基发生了突变,导致了398位Lys突变为Arg.通过SWISS-MODEL服务器模拟酶的三维结构,分析表明,b-15改变的4个氨基酸分别位于催化结构域的第4和第5个α螺旋之间的转角和结合结构域的第5个β折叠及第9和第10个β折叠之间的转角;b-28的突变位于结合结构域的第4个β折叠.同时,对获得的两株突变株b-15和b-28用正交试验优化产酶条件,优化后的酶活分别达到4.542和5.136 U/mL,是优化前的2.2和1.5倍.实验获得了酶活性提高的内切葡聚糖酶菌株,为进一步在分子水平研究内切葡聚糖酶的功能和其应用打下了基础,也为高酶活酶分子在其他高表达系统的表达提供了基础材料. 相似文献
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太空环境诱导的草地早熟禾皱叶突变体蛋白质组学研究 总被引：1，自引：1，他引：0
“神舟3号”飞船搭载草地早熟禾(Poa pratensisL.)‘Nassau’干种子,地面种植后筛选出皱叶突变株系PM2。利用蛋白质组学技术对PM2突变株系叶片中表达的蛋白质进行解析(未搭载植株为对照),发现基本保持不变的蛋白质点有181个,上调节表达蛋白质点有15个,下调节表达蛋白质点有15个,失去表达蛋白质点有116个。选择19个蛋白质点进行肽质谱分析,同源性查询后其中10个蛋白质点得到阳性结果,且PM2-058为谷氨酸合成酶类似蛋白,PM2-175为磷酸丙糖异构酶类似蛋白;CK-103为ATP酶依赖型26S蛋白酶体类似蛋白;CK-330为1,5二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶类似蛋白;CK-376为硫氧还蛋白M前体类似蛋白;CK-391为二磷酸核酮糖羧化酶类似蛋白。 相似文献
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本文通过PCR技术获得3D基因,使用拼接重叠延伸聚合酶链反应对3D基因内部的EcoRⅠ位点进行定点突变,将突变后的3D基因克隆至原核表达质粒pSOC和T4噬菌体的穿梭质粒pR中,通过PCR及质粒酶切鉴定,分别获得阳性重组子pSOC-3D和pR-3D。将含有3D基因的重组质粒pSOC-3D质粒转化大肠杆菌BL21进行表达,SDS-PAGE检测表达产物。将含有3D基因的重组质粒pR-3D转化T4噬菌体的宿主菌E2,通过同源重组获得重组噬菌体T4-3D,经SDS-PAGE及Western- blot检测,证明展示在T4噬菌体表面的3D融合蛋白能与FMDV感染血清发生特异性反应。 相似文献
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梅山猪氨肽酶基因N(pAPN)cDNA克隆、序列分析及重要变异位点的筛选 总被引：1，自引：0，他引：1
氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)蛋白是猪(Sus scrofa)传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和猪的流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)等一系列冠状病毒的受体蛋白。为探讨梅山猪APN基因的分子结构特征以及重要的变异位点,本研究通过PCR扩增和测序技术,结合生物信息学分析梅山猪APN基因功能区域和重要变异位点,对其蛋白质结构进行预测和分析。结果表明,梅山猪APN基因cDNA全长2 886 bp(GenBank登录号:KF280271),含有20个外显子,编码961个氨基酸。与GenBank数据库公布的标准序列(登录号:NM_214277.1)相比,梅山猪APN基因编码区变异共引起10处氨基酸突变与2处氨基酸缺失,其中Phe82Asn、Leu107Phe、Leu108 Ile、Ser330Pro、Trp399Arg和Glu465 Gly等6处突变位于APN酶催化活性区域,Gln747His突变、748Tyr和749Ser缺失突变位于APN病毒结合区域。蛋白结构和编码产物功能分析发现,pAPN为不稳定的亲水性蛋白,无信号肽,具有1个跨膜螺旋(跨膜区位于12~34氨基酸,二级结构元件以α螺旋和β折叠为主,编码产物主要参与细胞被膜(cell envelope)、中央中间代谢(central intermediary metabolism)、辅酶因子生物合成(biosynthesis of cofactors)等功能。Gln747His、748Tyr和749Ser缺失突变可能与氨肽酶N结合病毒能力有关。本研究对梅山猪pAPN基因功能的分析及变异位点的筛选,为今后筛选猪抗病毒性腹泻的有效遗传标记提供理论基础。 相似文献
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结核病(TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的古老疾病,与艾滋病、疟疾一并成为当今世界威胁人类健康的三大传染病。输出重复蛋白(Erp)是结核分枝杆菌的一种重要毒力因子,在临床上具有一定的潜在应用价值。为了深入研究Erp的功能,本研究采用固相亚磷酰胺三酯化学方法合成包含8个PGLTS基序的基因Dom8,并利用重叠延伸PCR的方法将该片段与DomC(长度为520～855bp)连接,经基因组装得到Erp蛋白8基序突变片段。进一步对获得的8基序全长基因进行C端、N端及CN两端缺失突变体,将其构建至原核表达载体pET-28a(+)上,将经酶切、PCR、测序鉴定的阳性质粒转化入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)pLysS菌株中。利用Tricine/SDS-PAGE、Western blot检测结核分枝杆菌Erp重组蛋白的表达情况。结果显示,通过重叠延伸PCR法成功扩增了erp基因PGLTS8基序全长及8基序C-端、N-端和CN-端缺失突变体并构建至原核表达载体,经IPTG诱导后,用Tricine/SDS-PAGE得到大小分别约为13.0、17.1和6.7kD的目的蛋白。制备弗氏佐剂疫苗免疫试验兔,ELISA测定抗体效价,血清效价达到1:512倍时,即可心脏采血分离,制备抗血清,并对提取的蛋白进行Western blot检测,结果表明,一抗为l:200倍稀释的兔阳性血清,二抗为1:800倍稀释的HRP标记的羊抗兔IgG-HRP;Western blot检测ErpMutC8、MutN8和MutCN8,结果显示,仅目的蛋白ErpMutC8和MutN8能被结核分枝杆菌Erp抗血清识别,表明,BL21(DE3)pLysS(pET28a-C8)和BL21(DE3)pLysS(pET28a-N8)所表达目的蛋白表达特异,可以被结核分枝杆菌Erp抗血清识别,具有良好的抗原性。研究结果为深入研究Erp的功能,制备结核病的诊断抗原和基因工程重组疫苗提供基础资料。 相似文献
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淀粉是丰富的生物质资源,已被广泛地应用到食品、酿酒、医药等各个相关的领域.普鲁兰酶(pullulanase,pulA,EC 3.2.1.41)作为淀粉脱支酶,可以水解淀粉中的α-1,6糖苷键,最大限度地降解淀粉原料,提高淀粉利用率.因此,寻找一条国产化的道路开发我国自己的普鲁兰酶,具有长远的意义.课题组前期从淀粉厂附近的土壤中筛到一株普鲁兰酶的高产菌株变栖克雷伯氏菌(Klebiella variicola)strain 7,克隆获得pulA基因(GenBank登录号:KJ146839.1)后在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)中异源表达.为提高该蛋白的表达量和分泌效率,同时改善普鲁兰酶的性质,本研究利用基因工程的手段构建了普鲁兰酶去信号肽突变体M1和氮端31个氨基酸的截短突变体M2,结果显示M1和M2最适温度均为45 ℃,二者的最适pH分别是6.0和5.6;M2的半衰期是37 min,是M1的6.17倍;M2的比酶活是582.204U/mg,是M1的1.6倍.动力学分析显示,以普鲁兰糖为底物时,M2的Vmax、Kcat、Km和Kcat/Km分别为0.001 3μmoL/(mL·s)-1、191.80-1 s.-1、0.30 mg/mL、693.30,与M1相比,M2的底物亲和能力增加,同时催化效率是M1的2倍.本研究通过普鲁兰酶氮端氨基酸的截短,为提高酶的比酶活和半衰期提供了新的方法和思路. 相似文献
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鞘磷脂合酶(SMS)基因家族在鞘脂质代谢中起着关键作用,可以通过调节神经酰胺和甘油二酯的平衡调控细胞的生存和凋亡.本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆得到1个二化螟鞘磷脂合酶相关基因的全长eDNA,命名为CsSMSr(Genbank登录号:JQ664739).CsSMSr开放阅读框1587bp,可编码528个氨基酸;序列分析表明,CsSMSr基因编码的蛋白N端具有保守的SAM结构域,含6个跨膜区域,并且有4个SMS家族特有的保守区域D1～D4,保守区D3和D4上有活性中心包括3个氨基酸残基(催化三联体):His302,His345,Asp349.CsSMSr在粉纹夜蛾Tn细胞内成功表达,Western blot检测表达产物分子量约60kDa.应用实时荧光定量PCR方法分析该基因在二化螟不同发育阶段和不同组织的表达,结果表明,CsSMSr随着二化螟的生长发育表达水平逐渐升高,在成虫时期达到最大;CsSMSr的表达具有组织特异性,二化螟雌成虫和雄幼虫生殖器官中的CsSMSr表达量都显著高于其他器官,在二化螟雄成虫精巢中表达量也较高,但与中肠和马氏管差异不大.CsSMSr的表达有时间特异性和组织特异性,推测该基因在二化螟的发育和生殖中有重要作用.本研究成功克隆并表达了二化螟鞘磷脂合酶相关基因,为进一步对该基因进行功能鉴定奠定了基础. 相似文献
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Maltooligosyltrehalose trehalohydrolase (MTHase) catalyzes the release of trehalose by cleaving the alpha-1,4-glucosidic linkage next to the alpha-1,1-linked terminal disaccharide of maltooligosyltrehalose. Mutations at residues D255, E286, and D380 were constructed to identify the essential catalytic residues of MTHase, while mutations at residues W218, A259, Y328, F355, and R356 were constructed to identify selectivity-related residues of the enzyme. The specific activities of the purified D255A, E286A, and D380A MTHases were only 0.15, 0.09 and 0.01%, respectively, of that of wild-type MTHase, suggesting that these three residues are essential catalytic residues. Compared with wild-type MTHase, A259S, Y328F, F355Y, and R356K MTHases had increased selectivity ratios, which were defined as the ratios of the catalytic efficiencies for glucose formation to those for trehalose formation in the hydrolysis of maltooligosaccharides and maltooligosyltrehaloses, respectively, while W218A and W218F MTHases had decreased selectivity ratios. When starch digestion was carried out at 75 degrees C and wild-type and mutant MTHases were, respectively, used with isoamylase and maltooligosyltrehalose synthase (MTSase), the ratios of initial rates of glucose formation to those of trehalose formation were inversely correlated to the peak trehalose yields. 相似文献
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本文以3个亲缘关系较远的高产木薯品种（SC124,SC8和Arg7）为材料,对块根发育过程中的AGPase活性和淀粉含量进行了测定,并利用AGPase同工酶电泳技术（非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）对AGPase酶活性较高时期同工酶位点进行检测,旨在分析木薯块根AGPase同工酶位点与AGPase酶活性和淀粉积累的关系。结果表明：木薯块根发育过程中AGPase酶活性和淀粉含量呈极显著正相关（R=0．80212）,Arg7的AGPase酶活性和淀粉含量在块根发育都显著高于SC124和SC8。同工酶分析表明,木薯至少有6个同工酶位点（AGPa,AGPb,AGPc,AGPd,AGPe和AGPf）,且品种间具有多态性。其中,3个品种共有的4个同工酶位点分别为AGPa、AGPc、AGPd和AGPf,AGPe位点只在Arg7中出现,初步判断同工酶位点AGPe可能与其较高的酶活性和淀粉含量有关。本研究为系统研究木薯品种间AGPase酶活性与淀粉积累的关系提供了参考。 相似文献
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干旱胁迫对丹参幼苗气体交换特征和保护酶活性的影响 总被引：2，自引：1，他引：1
以大叶型丹参(SA)和小叶型丹参(SI)为材料,设置了对照正常供水(CK)、轻度干旱胁迫(LD)、中度干旱胁迫(MD)、重度干旱胁迫(SD)4个处理,研究了不同程度干旱胁迫对丹参叶片气体交换特征与保护酶的影响.结果显示:(1)干旱胁迫下2个丹参品种叶片的净光合速率(Pn)、蒸腾速率(T.)、气孔导度(Gs)都有不同程度... 相似文献
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己有研究表明叶绿体内有200种蛋白酶,然而,多数蛋白酶的作用机制尚不清楚,尤其哪些蛋白酶参与了D1蛋白周转。其中Deg2蛋白酶体外实验证明,其参与了光损伤D1蛋白的的初步剪切。为了进一步研究Deg2蛋白酶在植物体内的作用机制,我们筛选了拟南芥De醇蛋白酶功能缺陷型突变体。在120μmol·m-2：·S^-1光照生长条件下,出萨突变体与野生型的生长曲线基本一致;在进一步的高光胁迫（1800μmol·m-2·S^-1）处理及相同的光胁迫处理条件下,无论林可霉素存在与否,突变体PSⅡ的最大光化学效率（Fv／Fm）都和野生型没有区别;利用蛋白免疫印迹实验同样证明了光损伤D1蛋白的降解速度在cfe霞突变体和野生型之间也没有明显区别。我们认为Deg2蛋白酶在光抑制情况下对于光损伤D1蛋白的降解以及PsⅡ的修复不是必需的。 相似文献
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Sugar reduction in low‐moisture cookies is a challenge for the baking industry, because detrimental gluten development and starch gelatinization/pasting increase as sugar concentration decreases. In this study, sucrose and two healthful carbohydrate oligomers (i.e., isomaltulose and Mylose 351 syrup/Glucodry 314 powder) were used to explore the effects of the sucrose alternatives on results from solvent retention capacity (SRC), differential scanning calorimetry (DSC), rapid viscoanalysis (RVA), and AACC International wire‐cut cookie baking. Wheat flour SRC results indicated lower swelling of solvent‐accessible arabinoxylans in isomaltulose solution, but higher swelling in Glucodry 314 and Mylose 351 solutions, compared with that in sucrose solution. DSC and RVA results showed retardation of wheat flour starch gelatinization and pasting onset, respectively, both in the order water < Glucodry 314 ≤ Mylose 351 < sucrose ≤ isomaltulose. Isomaltulose, when predissolved, exhibited cookie‐baking responses similar to those for sucrose, suggesting that this sugar could be used successfully as a sucrose alternative to produce wire‐cut cookies with lower glycemic impact. Cookie baking with blends of sucrose and Glucodry 314 alleviated a cookie‐geometry issue observed for 100% sucrose replacement by Glucodry 314, suggesting that Glucodry 314 or Mylose 351 could partially replace sucrose for sugar‐reduction purposes. 相似文献
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以GFP叶绿体转基因烟草及对照烟草（非转基因烟草）为材料,在实验室条件下研究了叶绿体转基因烟草及对照烟草（非转基因烟草）在茎叶降解过程中及完全降解后对土壤微生物主要类群（细菌、真菌、放线菌）的影响,并对相关的土壤酶活性进行了分析。结果表明,在烟草茎叶降解过程中及完全降解后：（1）叶绿体转基因烟草及对照烟草（非转基因烟草）对微生物的数量影响不显著;（2）土壤微生物总量相比为细菌〉放线菌〉真菌;（3）叶绿体转基因烟草茎叶降解对土壤酶活性没有显著影响;（4）GFP基因没有水平转移到土壤微生物基因组中。以上结果显示GFP叶绿体转化烟草茎叶降解对土壤微生物数量及土壤酶活性没有显著的影响。 相似文献
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采用盆栽模拟实验研究了具化感作用的芝麻（Sesamum indicum）、花生（Arachis hypogaea）和田菁（Sesbania cannabina）秸秆全株还田对萝卜（Raphanus sativus）、黑麦草（Lolium multiforum）和黄瓜（Cucumis sativus）生长及土壤养分状况的影响,旨在评价秸秆还田释放养分与化感作用对后茬作物幼苗生长效应的综合影响。结果表明：秸秆还田能改善土壤养分状况,对后茬作物幼苗生长具有较好的促进作用。3种作物秸秆还田促进幼苗生长的大小顺序为花生秸秆〉田菁秸秆〉芝麻秸秆〉对照,其中芝麻秸秆对土壤速效磷、速效钾含量提高最大,而花生和田菁秸秆对土壤有机质、全氮的贡献值远远高于另两种处理。3种秸秆还田均对后茬作物幼苗生长和土壤养分具有促进作用,其释放的养分因子占主导作用,而化感作用并未明显表现出阻碍后茬作物幼苗生长。可能原因在于秸秆还田后导致较高pH和土壤养分利于植物生长,并影响了秸秆化感物质的活性和化感作用的发挥。 相似文献
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丙二烯氧化物合酶（allene oxide synthase,AOS）是茉莉酸合成途径中第一个特异性的酶。本研究从＂嘎啦＂苹果中克隆了一个AOS的基因序列,将其命名为MdAOS,并对其进行了结构和表达分析。MdAOS基因编码区共有1 605 bp碱基,编码531个氨基酸,等电点为4.92,分子量为134.9 kD。MdAOS属于细胞色素P450基因家族的CYP74A亚类,并具有典型的P450成员特征,其编码的蛋白包含4个保守区域,分别为：Heme-Binding结构域、Ⅰ-Helix区、ETLR基序和PEEF基序。MdAOS蛋白的N末端有典型叶绿体信号肽。同源性分析表明MdAOS与碧桃（Amygdalus persica var.persica f.duplex.）AOS基因的同源性很高,且聚类结果也与双子叶植物聚为一类。实时荧光定量PCR分析结果显示,MdAOS在苹果各组织中均有表达且在茎中表达量最高。MdAOS能响应茉莉酸、水杨酸、脱落酸和乙烯的诱导,并在机械伤处理时表达上调。 相似文献
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为了揭示纳米碳管和无机矿物与富勒烯（c砷）的相互作用机理,采用溶剂交换法制备出富勒烯胶体悬浮液,选取三种多壁纳米碳管：【羟基化多壁纳米碳管（MH）、羧基化多壁纳米碳管（MC）、石墨化多壁纳米碳管（MG）】和五种无机矿物：【二氧化硅（SiO2）、蒙脱土KIO（ML-KIO）、蒙脱土KSF（ML-KSF）、高岭土325（KL-325）、高岭土6000（KL-6000）1作为吸附剂,通过批量吸附试验方法研究了富勒烯在不同吸附剂上的吸附行为。结果显示,三种纳米碳管和五种无机矿物均对富勒烯有一定的吸附能力,且Freundlich模型对其吸附行为具有较好的拟合度。在三种纳米碳管中,由于静电作用和疏水作用使得石墨化多壁纳米碳管（MG）对富勒烯的吸附能力最强;而五种无机矿物对富勒烯的吸附能力也存在差异：ML-KSF〉ML-K10-KL-6000〉KL-325-SiO2。这可能与无机矿物本身的结构和性质有关。 相似文献
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碳水化合物结合组件（carbohydrate—binding module,CBM）是一些糖基水解酶分子上的结构域,它在纤维素酶降解不可溶纤维素中起着重要的作用。本研究的目的是检测一个新的内切葡聚糖酶Umcel5N（GenBank登录号为ACH67609）加上一个碳水化合物结合组件后得到的融合酶是否获得降解结晶纤维素的能力。本文将编码内切葡聚糖酶Umcel5N的催化结构域（catalytic工能力domain,CD）的序列与编码Umcel6A的CBM序列通过接头序列进行基因融合,得到融合基因umCel5N-CBM,并实现了融合基因在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中的表达。研究结果表明,融合酶Umcel5N-CBM与结晶纤维素（avicel）以及滤纸粉末的结合能力比原始酶Umcel5N提高了约一倍,但未显示出降解结晶纤维素的新活性,说明在结晶纤维素的降解过程中,纤维素酶的催化功能域起到关键作用。 相似文献