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以短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到几丁质酶基因chiD序列,再将chiD序列连接到pMD18-T克隆载体上,形成重组载体pMD18-T-chiD,转化大肠杆菌DH5ɑ并测序,经过核苷酸和氨基酸序列分析获得几丁质酶基因chiD的序列片段为1 524 bp,编码507个氨基酸,理论蛋白质分子量约54.55 ku,其等电点约为5.77,表明该几丁质酶为酸性几丁质酶。将重组质粒pMD18-T-chiD双酶切后与表达载体pET-28a连接,构建重组表达载体pET28a-chiD,并转入大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达,结果表明:重组蛋白质的分子量约55 ku,与预测的蛋白分子量结果一致。为了提高重组蛋白的表达量,对培养时间、IPTG浓度和温度3个参数进行优化,并将表达产物进行SDS-PAGE分析,最后得出重组载体pET28a-chiD的最佳诱导表达参数分别为8 h、0.5 mmol/L和28℃。这为短短芽胞杆菌来源的几丁质酶的进一步研究奠定了良好基础。 相似文献
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以已经克隆到亚麻木质素合成关键酶咖啡酸-O-甲基转移酶基因(COMT)全长cDNA序列为基础,通过扩增RNAi顺式及反式片段(均为249 bp),先连接到中间载体pBSK,再连接表达载体pCAMBIA-1301-multi,构建成COMT基因的RNAi表达载体,通过农杆菌介导转化亚麻,获得转基因植株,通过GUS染色和PCR检测,表明干扰载体已经转入亚麻中。这为推进亚麻纤维品质改良的分子育种提供了基础。 相似文献
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为考察酸碱条件对枯草芽胞杆菌FJAT-14254代谢物产生的影响,采用气相色谱-质谱联用分析枯草芽胞杆菌FJAT-14254菌株的胞内成分。结果表明：通过谱库扫描得到32种高匹配率代谢物的初步鉴定结果,主要包括氨基酸类、酸类、烷烃类等,其中含量相对较高的有7种;枯草芽胞杆菌FJAT-14254代谢物的种类和含量与其培养环境的酸碱度变化呈一定的相关性,强酸性(pH＝3)条件下培养的胞内代谢物具有特异性,而接近中性(pH＝5、7)条件及碱性(pH＝9、11)条件下培养胞内代谢物则相似。由此推断,不同pH条件影 相似文献
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在Genebank中搜索花粉致死基因Zm AA1、花粉育性恢复基因Ms45、粉质胚乳突变基因Mucronate及各基因特异调控因子和终止子序列,并在目的片段的上下游设计增加同尾酶Spe I(Nhe I、Xba I)和酶切后具有各种类型的DNA片段的Esp3I酶切位点,基因合成构建到克隆载体puc57上,命名为puc-Zm AA1、puc-Ms45、puc-Mc。采用传统酶切连接的方法将目的片段构建到植物表达载体p CAMBIA3300上,并用热击法将重组质粒导入农杆菌LBA4404及EHA105中,酶切、PCR检测及核苷酸序列测定证明,植物表达载体构建成功。 相似文献
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木薯淀粉分支酶基因双价块根特异性反义表达载体的构建 总被引：2，自引：1，他引：1
淀粉分支酶(starch branthing enzyme,SBE)是高等植物淀粉生物合成的关键酶之一,包括分支酶I(SBEI)和分支酶II(SBEII)两种类型,调控着支链淀粉的合成.利用DNA重组技术,将这两种分支酶反义基因片段构建在一个植物表达载体中,形成双价反义表达载体p1301-SBEII-Spo-SBEI,其中SBEI反义基因置于CaMV35S启动子之后,SBEI反义基因置于块根特异型启动子.Sporamin之后,两者具有各自的Nos终止子.通过反复冻融法,将双价表达载体转入农杆菌EHA105,并采用PCR技术对所构建的农杆菌工程菌株进行了鉴定分析. 相似文献
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根据草莓（Fragaria ananassa Duch）NCED基因序列（GenBank： HQ399498），克隆NCED基因开放阅读框，将该片段插入植物表达载体pBI 121的CaMV 35S 启动子和NOS 终止子之间，构建了正义表达载体pBI 121NCED。克隆NCED基因正义、反义片段和作为内含子的gusA基因片段，以植物表达载体pBI 121为基础，以pCAMBIA2301作为中间载体，通过多次酶切和连接，成功构建了草莓NCED基因RNAi表达载体pBI 121NCEDRNAi和反义表达载体pBI 121NCEDF。经PCR、限制性内切酶酶切和测序鉴定后，成功将pBI 121NCED、pBI 121NCEDF和pBI 121NCEDRNA 3个重组表达质粒导入农杆菌EHA105中。研究结果为进一步研究草莓NCED基因的功能奠定了基础。 相似文献
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利用同源克隆方法从大豆中克隆到一个耐盐基因HAL3,命名为GmHAL3a,组织表达分析发现GmHAL3a基因在大豆根中表达量最高,荚中次之,叶中表达量最低;非生物胁迫实验表明该基因受NaCl、LiCl和山梨醇诱导表达;通过生物信息学的方法分析发现该基因具有2个跨膜螺旋区域,可能定位于叶绿体中;同源序列比对证实该基因氨基酸序列具有与其他物种相似的保守位点:黄素单核苷酸(FMN)结合位点和磷酸泛酰半胱氨酸(PPC)脱羧酶活性位点。同时扩增了这个基因的2个干扰片段,用Gateway技术将扩增的片段通过BP反应连接到入门载体pDONR221,测序后又通过LR反应分别将目的片段插入到RNAi载体pB7GWIWG2(Ⅱ),再转入根癌农杆菌EHA105中。这2个载体的构建对于进一步研究大豆中GmHAL3a基因的功能具有重要意义。 相似文献
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应用PCR方法从感染香蕉束顶病毒的香蕉植株幼嫩假茎和叶片总DNA中克隆了Rb(Rb-binding-like protein)基因的编码区,将其插入原核表达载体pET-28b中构建重组质粒pET28b-Rb。转化重组质粒的E.coli BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析结果表明,表达产物大小为22.6ku,且主要以包涵体形式稳定表达。目的蛋白经Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化后免疫家兔并获得抗血清。Western blot检测结果表明,抗血清与诱导表达的BBTV编码Rb蛋白发生特异性反应。间接ELISA法测定的抗血清效价大于1:250000。用抗血清对感病香蕉和健康香蕉进行检测,结果表明,抗血清对感病香蕉有很高特异性,最佳工作浓度为1:1500。 相似文献
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小麦热激蛋白WHSP90基因的原核表达及多克隆抗体制备 总被引：1，自引：0，他引：1
为了进一步研究HSP90基因的功能,将WHSP90基因构建到原核表达载体pET-28a(+)中,得到His-WHSP90融合表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,发现1 mmol/L IPTG诱导4 h蛋白表达量最大;经过蛋白标记亲和层析柱(HisTrapTMHP)纯化得到的纯化蛋白浓度达到0.4 mg/mL.免疫家兔制备抗体,用间接ELISA法检测免疫后家兔抗血清效价大于125 000,满足后续试验要求的效价值,为在蛋白水平上研究WHSP90基因功能提供了基础. 相似文献
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通过PCR方法从pCAMBIA1305载体上克隆了新霉素磷酸转移酶基因nptⅡ的全编码序列,并插入到原核表达载体pET30a（+）中,构建了重组质粒pET30a nptⅡ。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌,经IPTG诱导,获得了相对分子量为35 kD的表达蛋白,约占全菌总蛋白的45％。表达蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在。用5 mmol/L 二硫苏糖醇和1％十二烷基肌氨酸钠变性溶解包涵体,经透析后复性获得了可溶性重组蛋白。将可溶的表达蛋白用Ni2+ NTA亲和层析纯化,获得纯化的NPTⅡ蛋白,电泳谱带扫描分析表明蛋白纯度达95％以上。体外活性检测显示,NPTⅡ蛋白具有良好的生物活性,在浓度30 μg/mL以上时可使卡拉霉素失去抑菌活性。 相似文献
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茶氨酸生物合成工程菌构建 总被引：8，自引：2，他引：8
通过PCR扩增E.coli DH5α的γ-ggt基因,产物经纯化后用Kpn I和Xho I双酶切,回收γ-谷氨酰转肽酶基因目的片断,并与经相同双酶切的表达载体pET-32a连接,得到重组质粒pET-GGT。将重组质粒转化到E.coli BL21中,获得工程菌。工程菌株经0.05βmol/L IPTG,32℃诱导表达,湿菌体的酶活达到2.0βU/g,大约是出发菌株E.coli DH5α的15倍。工程菌催化L-谷氨酰胺和盐酸乙胺反应生成茶氨酸的产量达到29.40βg/L,L-Gln的转化率为48.22%,其催化L-谷氨酰胺和盐酸乙胺反应生成茶氨酸的能力比出发菌株E.coli DH5α提高了100多倍。 相似文献
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通过PCR方法,从E.coliJM109基因组DNA中扩增到全长为1296bp的glgC基因,对其进行定点突变,获得第296位和336位氨基酸同时突变的glgC336基因。将2者亚克隆进pET-30a,成功构建了重组表达载体pET-C和pET-C336,转化大肠杆菌BL21(DE3),在1mmol/LIPTG诱导下进行表达。SDS-PAGE电泳分析显示,在约53kD处有1条明显的蛋白表达带,证明目的基因已得到高效表达,且重组蛋白表达量占菌体蛋白总量的77.3%。 相似文献
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Mirmomeni MH Kiani S Sisakhtnezhad S 《Pakistan journal of biological sciences: PJBS》2008,11(11):1497-1501
This study is directed towards the method of amplifying and cloning the SopE gene, that encodes Salmonella outer protein E. Strains used in this study were S. dublin collected from Kermanshah province. Genomic DNA was extracted by the general boiling method. Using the specific primers, a part of SopE gene was multiplied. The PCR product was inserted into the cloning vector (pTZ57R/T). Furthermore, E. coli DH5alpha bacteria were transformed to amplify the recombinant plasmid. Recombinant clones were identified by blue/white selection. Recombinant plasmids were purified by alkaline lysis procedure. Moreover, identity of the SopE/pTZ57R/T product was confirmed by restriction enzyme digestion assay and sequencing. Finally, the cloned gene was compared with that published by the NCBI Genbank (L78932). The results showed that the obtained sequence differed in four nucleotides which resulted in two amino acid differences. The cloned SopE was submitted to the NCBI Genbank (EU399750). 相似文献
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Mirmomeni MH Sisakhtnezhad S Sharifi A 《Pakistan journal of biological sciences: PJBS》2008,11(3):428-432
The emergence of Salmonella enteritidis as an important food-borne pathogenesis in humans, demands the development of novel detection and intervention strategies. It is generally accepted that fimbriae are an important factor in bacterial survival and persistence in the host. This study is directed towards the method of amplifying and cloning the SefA gene, which encode Salmonella enteritidis fimbrial protein. Strains used for these studies were S. enteritidis (E3), which were collected from Kermanshah region. Chromosomal DNA was extracted by boiling method and PCR reaction was performed and single band of 511 bp amplified by SefA-F and SefA-R primers. The resulting PCR product was inserted into the cloning vector (pTZ57R/T). In order to amplify the recombinant plasmid, E. coli DH5 alpha bacteria were transformed with SefA-pTZ57R/T. Recombinant clones were identified by blue/white selection and purified recombinant plasmids were indicated by an alkaline lysis procedure. Identity of the SefA-pTZ57R/T product was confirmed by RFLP and sequencing. Nucleotide and protein alignment with BLAST software showed that the sequence of the SefA gene derived from S. enteritidis (E3), which was cloned in the pTZ57R/T vector, was 99% identical to that of the Genbank (L11008). The sequence of the SefA gene from S. enteritidis (E3) differed only in two nucleotides and one amino acid. The cloned SefA gene from S. enteritidis (E3) was submitted to the NCBI Genbank (EF553334). 相似文献
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酸性蛋白酶pepB基因植物表达载体的构建及在玉米中的转化 总被引：1，自引：1，他引：0
以黑曲霉基因组DNA为模板, 利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增了酸性蛋白酶pepB基因序列,并将其克隆到pMD18-T Vector上,对重组子进行了PCR检测和限制性内切酶分析并测序。DNA序列分析表明：克隆片段长为1 340 bp,与已发表的pepB基因序列同源性达99.85%。将pepB基因片段插入到带有耐盐基因的表达载体pCAMBIA1301-BADH上,构建了无抗生素选择标记的重组质粒pB-pepB-35S,从而得到了植物表达载体,该载体利用耐盐基因BADH替代抗生素基因作为筛选标记。通过花粉管通道法将其导入玉米自交系,获得了转基因植株,并得到了转化植株的种子。 相似文献
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利用GS基因构建茶氨酸生物合成工程菌的研究 总被引：4，自引：1，他引：3
为了高效合成茶氨酸,本研究通过将荧光假单胞菌GS基因转接入pET32a质粒中,再将重组质粒转化到E.coli BL21中,构建了一种生物合成茶氨酸的基因工程菌。工程菌株经0.1mmol/LIPTG,28℃诱导表达,湿菌体的酶活达到41.79U/mg prot,大约是出发菌株E.coli BL21的126.64倍。工程菌催化L-谷氨酸钠和盐酸乙胺反应生成茶氨酸的产量达到6.2g/L,其催化L-谷氨酰胺和盐酸乙胺反应生成茶氨酸的能力较出发菌株E.coliBL21有显著提高。 相似文献
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豆豉纤溶酶基因的克隆及其在枯草杆菌中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
以实验室筛选的UD8豆豉芽孢杆菌的总DNA为模板,应用PCR技术根据豆豉纤溶酶基因DNA序列(GeneBank AY720895.2)设计并合成1对引物,扩增出了豆豉纤溶酶基因,将该基因克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒EC-BS8上,构建成表达质粒EC-BS8,再将其转化到枯草芽孢杆菌Bs6中。筛选表达菌株,实现了豆豉纤溶酶基因在枯草杆菌中高效表达。获得重组菌纤溶酶活力高达9 830 IU.mL-1,是出发菌株活力的2.9倍。经纯化SDS-PAGE鉴定重组豆豉纤溶酶相对分子质量为31.0 kDa。 相似文献