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黄曲霉Aspergillus flavus是一种广泛存在的致病真菌,早期准确检测黄曲霉并加以控制是减少黄曲霉毒素产生的有效措施。本研究利用真菌通用引物ITS1/ITS4扩增黄曲霉转录间隔区并进行克隆测序,通过序列比对,设计1对黄曲霉特异性引物S1/X2,由此建立的PCR检测体系对包括黄曲霉在内的5种曲霉菌及其他17种不同的真菌、细菌基因组DNA进行扩增,结果只有不同来源的黄曲霉菌株能扩增出334bp的特异性条带,而其余参试菌株均无扩增产物,其检测灵敏度在DNA水平上可达到280fg。该检测体系能从自然发病的花生或玉米组织中扩增到334bp的特异片段,实现对黄曲霉的快速可靠检测。 相似文献
3.
实验运用改良的SDS碱裂解法对30株镰刀菌基因组DNA进行了抽提,并对rDNA ITS区域进行了特异性扩增。结果表明:被测菌株DNA片段大于20 kb,其OD260/OD280大都在1.6~2.0之间,可见用改进的方法抽提的基因组DNA比较完整,纯度较高。实验采用对镰刀菌属有特异性的寡聚核苷酸为引物,对镰刀菌基因组rDNA基因进行扩增,该引物可以扩增出18S、28S部分片段及ITS区域,电泳检测其片段大小在1 041~1 135 bp之间,且特异性良好,为进一步进行RFLP及核苷酸序列分析奠定了基础。 相似文献
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《山西农业科学》2018,(12)
以山西左权地区一株野生的鹅膏菌作为研究材料,提取鹅膏菌基因组DNA后,将r DNA的ITS和LSU区段进行克隆后连接到T载体上进行测序。通过GenBank核酸数据库对测序得到的ITS和LSU序列进行同源性比对,并从GenBank检索获得7个相似物种的ITS和LSU序列,与测序得到的ITS和LSU序列分别做系统发育树。测序结果表明,ITS序列有666 bp,LSU序列有968 bp;系统发育树结果显示,ITS序列以100%的支持值与拟橙盖鹅膏菌聚在一起,LSU序列以98%的支持值与拟橙盖鹅膏菌聚在一起。结合形态学观察,将山西左权鹅膏菌鉴定为拟橙盖鹅膏菌(Amanita caesareoides)。 相似文献
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根肿病菌核糖体基因ITS区段的克隆测序及其在检测中的应用 总被引：19，自引：2，他引：19
应用真菌核糖体基因ITS区段通用引物ITS1和ITS4,对十字花科蔬菜根肿病菌（Plasmodiophora brassicae）rDNA进行PCR扩增,并将扩增到的目的片段克隆到pGEM-T载体上。对重组克隆进行测序和碱基编码结构特点分析,结果表明:十字花科蔬菜根肿病菌ITS1区长141 bp,5.8 S区长160 bp,ITS2区长187 bp,rDNA总长为488 bp. 根据此序列设计一对根肿病菌特异性寡聚核苷酸引物（前引物:5’AGG TGA ACC TGC GGA AGG AT 3’和后引物:5’TTC AGC GGG TAA TCC TAC CT 3’）,应用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）技术,对分离自十字花科蔬菜（白菜、青菜、甘蓝、芥蓝、花椰菜等）根肿病菌全基因组DNA进行特异性扩增试验。试验结果表明,该对引物能从十字花科根肿病菌全基因组DNA中扩增到约500 bp长度的分子片段,而对照菌株和健康对照则无扩增产物。该实验结果对有效追踪根肿病菌在田间的发生动态监测和预测预报提供了重要的信息和手段。 相似文献
6.
向日葵黑茎病菌Leptosphaeria lindguistii和向日葵茎溃疡病菌Diaporthe helianthi是向日葵上寄生的2种重要的检疫性真菌病害.针对这2种致病菌,目前国内外已有形态学鉴定和危害的研究报道以及向日葵黑茎病菌的ITS序列分析和RFLP初步研究,但未见有2种病原菌同步分子检测的报道.本研究首先通过培养,观察比较了2种病原菌的菌落和形态特征.发现前者菌落絮状,分生孢子器深褐球型,分生孢子为单胞肾形;后者菌落短绒毛状,分生孢子器柠檬黄,分生孢子为线型.通过油菜黑茎病菌L.biglobosa的肌动蛋白基因设计供试材料的通用引物act F/act R,扩增产物片段约为720 bp,然后采用真菌通用引物ITS1/ITS4和引物act F/act R,针对所有菌株菌丝DNA进行ITS区域和Actin基因PCR扩增,经克隆测序结果比对分析发现,向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的ITS区域存在极高的相似度.因此,依据Actin基因特异位点分别设计出向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的特异引物LLF/LLR和DHF/DHR.在同一PCR管中3组引物(ITS1/ITS4,LLF/LLR和DHF/DHR)经优化体系后,ITS1/ITS4扩增序列作为所有菌株菌丝基因组DNA提取模板的质量监控,针对向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌单一模板的ITS区域与Actin基因中的两个位点同时进行三重PCR扩增.利用此方法检测向日葵黑茎病菌出现580 bp的ITS保守区扩增片段和255 bp的Actin基因的特异扩增带,向日葵茎溃疡病菌出现580 bp的ITS保守区扩增片段和394 bp的Actin基因特异扩增带.所有菌株均未见非特异性片段的干扰.此三重PCR检测体系的建立为此两种检疫性真菌病害的同步分子检测提供了特异方法. 相似文献
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小麦A GPase4个亚基的克隆及其组织特异性表达 总被引：2，自引：1，他引：2
采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号发育籽粒中克隆出小麦淀粉合成关键酶-AGPase的胞质型小亚基(cytosolic small subunit,SSU Ⅰ)、质体型小亚基(plastidial small subunit,SSU Ⅱ)、胞质型大亚基(cy-tosolic large subunit,LSU Ⅰ)和质体型大亚基(plastidial large subunit,LSU Ⅱ)的cDNA序列.所克隆的基因cDNA序列长度分别为1 465、1 631、1 941和535 bp.序列比对结果显示SSU Ⅰ、LSU Ⅰ和LSU Ⅱ与已往报道的大麦、小麦、玉米、水稻等相关基因的同源性较高,而SSU Ⅱ的cDNA序列为首次克隆,与大麦SSU Ⅱ相比,5'端缺失编码转移肽的一段序列,表明其可能对质体AGPase活性产生一定影响.通过半定量PCR法发现SSU Ⅰ与LSU Ⅰ在籽粒中表达量较高,而SSU Ⅱ和LSU Ⅱ在叶片中丰富表达. 相似文献
8.
[目的]对严重危害斑石鲷鱼苗的卵鞭虫病病原——渤海分离株(Bohai-1407 isolate)进行分子生物学鉴定和系统发育分析。[方法]设计4对特异性引物,应用PCR方法克隆并测定渤海分离株的核糖体DNA(rDNA)序列;应用Blast比对分析渤海分离株rDNA的结构;依据rDNA序列,分别构建10种胚沟科鞭毛虫和19株眼点淀粉卵涡鞭虫分离株/克隆的系统发育树,分析渤海分离株的系统分类地位。[结果]扩增出了渤海分离株的4个DNA片段,拼接出长度为6 530 bp的r DNA操纵子序列;该操纵子由74 bp的部分外转录间隔区(ETS)、1 813 bp的小亚基(SSU)、352 bp的内转录间隔区1(ITS1)、159 bp的5.8S、698 bp的内转录间隔区2(ITS2)和3 388 bp的大亚基(LSU)串联而成,3'端还有46 bp的部分非转录间隔区(NTS);渤海分离株与眼点淀粉卵涡鞭虫宁德株(Ningde1412)的rDNA序列相似性高达99.5%;依据SSU序列建立了包含10种胚沟科鞭毛虫的系统发育树,渤海分离株与世界各地分离到的眼点淀粉卵涡鞭虫聚类在一起,将其鉴定为眼点淀粉卵涡鞭虫;依据ITS1和ITS2序列建立了包含19株眼点淀粉卵涡鞭虫的2个系统发育树,渤海分离株与从美国弗罗里达盐水池塘中分离到的墨西哥湾分离株FL_21(DQ490260.1)总是聚类在一起。[结论]斑石鲷卵鞭虫病的病原——渤海分离株可以鉴定为眼点淀粉卵涡鞭虫,该分离株与墨西哥湾分离株FL_21的亲缘关系最近。 相似文献
9.
在鱼类分子系统学的研究中,常常会碰到样本难以采集而博物馆中保存的大量标本又因经过福尔马林处理而无法利用的难题,比如:鲟形目鱼类。为了研究鲟鱼的系统分类,获取福尔马林固定标本的线粒体基因组,我们将匙吻鲟(Polyodon spathula)样本用福尔马林进行不同时间的固定(1 h、1 d、3 d、10 d、30 d和150d),采用提取古DNA的方法获得样本的DNA,以新鲜匙吻鲟线粒体基因组设计诱饵(Baits),通过靶基因富集"钓取"固定样本中的线粒体基因组序列,进行Illumina测序,获得线粒体基因组序列。结果表明处理1 h、1 d、10 d、30 d、150 d的匙吻鲟样本测得的线粒体基因组序列长度均为16 524 bp,覆盖率为100%,目标序列占总数据的比率均大于45%,错误率均为0。另外,采用Q-ratio方法检测固定时间对DNA片段化的影响:前端引物保持不变,设计4种右端引物分别进行PCR扩增,目标片段长度分别为41、129、305和650 bp。结果前3组引物在各样本DNA中均扩增成功,650 bp片段引物仅在固定1 h的样本DNA中扩增成功;固定时间越长,各组引物所得到的Q-ratio值(不同长度扩增片段和41 bp扩增片段的比值)越低,DNA片段化程度越大。此研究结果可为提取福尔马林固定标本DNA用于分子遗传学研究提供参考。 相似文献
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柞蚕微孢子核糖体基因和转录间隔区的序列及系统进化分析 总被引：3，自引：0，他引：3
【目的】研究柞蚕微孢子（Nosema antheraeae）的核糖体基因，转录间隔区（ITS）以及它们的排列顺序，为柞蚕微孢子的分类和系统进化分析提供分子生物学方面的依据。【方法】采用特异引物进行PCR扩增，克隆和测序。用DNAStar软件，用Clustal W 的比对方法得到遗传距离和系统进化树。【结果】得到柞蚕微孢子的核糖体小亚基rRNA（SSU rRNA），转录间隔区（ITS），5S rRNA的全长，得到核糖体大亚基rRNA（LSU rRNA）的部分序列。【结论】柞蚕微孢子的核糖体基因排列顺序为LSU－ITS1－SSU－ITS2－5S与Nosema bombycis 相同，是一种比较特殊的排列方式。将微孢子SSU rRNA基因和ITS结合起来分析微孢子的亲缘关系是一个新的尝试。 相似文献