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1.
【目的】研究根癌农杆菌介导的芪合酶基因转化烟草遗传体系的优化条件。【方法】以"中烟99"叶片为受体,采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,GV3101)介导法,将芪合酶基因导入烟草基因组,并对其遗传体系进行了优化,对筛选获得的转基因烟草植株进行检测。【结果】根癌农杆菌介导的芪合酶基因遗传转化的最佳条件为:将预培养2 d的烟草外植体,用稀释10倍的GV3101菌株菌液(OD600=0.6)浸染8 min后,共培养3 d,然后转入含卡那霉素(Km)50 mg/L和羧苄青霉素(Cb)500 mg/L的筛选分化培养基上诱导分化,待抗性芽长到2~3 cm后,转入含Km 50 mg/L和Cb 500 mg/L的筛选生根培养基上进行筛选,在以上最佳遗传转化条件下,初步筛选到54株转化体,经PCR和RT-PCR检测获得25株转化烟草植株。【结论】经卡那霉素筛选、PCR、RT-PCR检测后,初步证明芪合酶基因已被整合到烟草基因组中,并可以正常转录。 相似文献
2.
外源GO基因导入番茄后对叶霉病的抗性机制 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】研究转GO基因番茄的抗病机制。【方法】通过测定转GO基因番茄和对照未转基因番茄接种叶霉菌Fulvia fulva后，体内超氧物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性变化。【结果】接种后转基因番茄株系的SOD、POD、CAT活性均比对照明显增加，且转基因番茄的活性高峰比对照早。转基因番茄在接种后PAL和PPO活性都出现2个活性高峰，且第2个峰值比第1个高，而对照只有1个活性高峰,其总体水平明显低于转基因番茄。用番茄叶霉病（Fulvia fulva）病原菌1.2.3.4生理小种侵染T1代转基因植株。【结论】 结果显示转基因番茄植株的抗病性有不同程度的提高，多数发病时间推迟，病情明显减轻。 相似文献
3.
【目的】从玉米幼根基因组DNA中克隆β-葡萄糖苷酶基因根部特异性启动子序列ZmGLU1P,并对其功能进行分析。【方法】利用PCR技术从玉米品种P138幼根基因组DNA中克隆玉米根部特异性启动子片段ZmGLU1P,将其与GUS基因融合,构建植物表达载体pCAMBIA121-ZmGLU1P,转化到EHA105根癌农杆菌中,通过根癌农杆菌介导法转化烟草NC89,对转化烟草植株进行PCR和Southern杂交检测。采集PCR和Southern杂交检测为阳性的转基因烟草的根、茎、叶,进行GUS活性的组织染色检测。【结果】克隆获得了ZmGLU1P片段,其长度为1 846 bp,与已报道的序列同源性达99%以上。转基因烟草植株的PCR和Southern杂交结果显示,成功地获得了转基因阳性植株;GUS活性检测表明,根中GUS活性最强,而在茎和叶等组织中GUS活性甚微,表明ZmGLU1P片段具有根部特异性启动子功能。【结论】玉米β-葡萄糖苷酶基因上游1 846 bp的片段ZmGLU1P具有根部特异性启动子功能,为根部特异性启动子。 相似文献
4.
将烟草花叶病毒复制酶54 KD蛋白基因构建到质粒pSSZ32.54K,导入根癌农杆菌EHA105株系,用农杆菌介导的叶盘法转化含CMV CP基因的纯合系烟草,获得了含CMV CP基因和TMV RepE基因的转基因烟草,以及只含TMV RepE基因的转基因烟草.以繁殖于新鲜普通烟叶片上的TMV为毒源,机械摩擦接种含双基因的烟草和只含CMV CP基因的烟草.接种15 d后,观察植株发病情况,发现转双基因的烟草无花叶症状出现,而对照植株(只含CMV CP基因)出现花叶症状.通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测病毒含量,发现转基因植株体内无病毒积累,而对照植株体内有病毒积累.因此,含RepE基因的烟草对TMV有一定抗性. 相似文献
5.
【目的】制备转MnSOD基因仙客来植株,检测其对高温胁迫的抗性。【方法】以仙客来组培苗的叶片为受体材料,采用根癌农杆菌介导法将MnSOD基因导入仙客来,对获得的抗性株系进行分子生物学检测,并测定转MnSOD基因仙客来组培苗在36℃高温胁迫下的SOD活性、MDA含量、细胞膜相对透性和可溶性蛋白含量。【结果】获得35个仙客来抗性株系,其中3个株系经GUS组织化学染色、PCR和Southern印迹检测表现为阳性,表明外源基因整合到仙客来基因组中。转基因仙客来的SOD活性始终高于非转基因植株,细胞膜透性和MDA含量上升的速度低于非转基因植株,可溶性蛋白含量高于非转基因植株。【结论】获得了转MnSOD基因仙客来植株,其对高温胁迫的抗性高于非转基因植株。 相似文献
6.
自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)克隆获得attM基因。采用叶盘转化法,农杆菌介导转化烟草,经过卡那霉素抗性筛选获得抗性愈伤组织,对其分化产生的植物株系进行PCR、PCR-Southern和荧光定量PCR及GUS染色检测分析。结果表明:attM基因被成功插入烟草基因组DNA中。在转基因株系中均能够表达,相对表达量最大可达125.8,最小为31.0。以野生型烟草和转pBI121空载体的烟草为对照,分别进行了离体及活体检测试验,结果表明:转attM基因烟草植株对茄科雷尔氏菌引起的青枯病抗性显著。1×107～1×108CFU.mL-1的青枯菌接种离体叶片,野生型烟草和转pBI121空载体的烟草的中毒面积与接种面积比值为15～25,转基因植株的比值低于3;青枯菌3×106CFU.mL-1伤根接种盆栽烟草植株14d,野生株和转空载体烟草均青枯死亡,病情指数为100,转基因植株病情指数为31.25。 相似文献
7.
【目的】克隆小麦蓝矮病(WBD)植原体β-1,4-内切葡聚糖酶基因(FrvX),验证其在植原体侵染寄主中的作用,为更好地防控小麦蓝矮病奠定理论基础。【方法】采用PCR技术从小麦WBD植原体中扩增到FrvX全基因,将其插入到病毒载体pgR107中,构建重组病毒载体pgR107-FrvX,用农杆菌介导法侵染本氏烟草,观察烟草表型的变化。【结果】FrvX基因全长1071bp,编码356个氨基酸。重组病毒载体接种烟草22d后,有9株烟草植株表现出明显的花叶、黄化症状,RT-PCR检测到发病植株接种7d后的叶片有FrvX基因的转录。【结论】FrvX基因接种烟草导致烟草表型发生变化,推测其与植原体病害的发生有关。 相似文献
8.
[目的]探讨转截短hpalXoo基因烟草中与抗病性有关的5种防御酶系的活性变化.[方法]以转截短hpalXoo基因烟草A6-1和对应的非转基因烟草Xanthi叶片为材料,接种烟草花叶病毒（TMV）,测定苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）的活性.[结果]未接TMV时,转截短hpalXoo基因烟草中POD、PPO和CAT酶活性均高于未转基因对照品种,而SOD和PAL活性与未转基因烟草无显著差异.接种TMV后,转截短hpalXoo基因烟草中5种防御酶活性均显著增加,且高于未转基因烟草,并维持在一个较高的水平.[结论]截短的hpalXoo基因在烟草中表达能显著提高其抗病防御酶活性水平. 相似文献
9.
【目的】克隆中国野生毛葡萄（Vitis quinquangularis）‘丹凤-2’芪合酶（stilbene synthase）基因（STS）并研究其功能,为提高欧洲葡萄（V. vinifera）的白粉病抗性及品质提供依据。【方法】利用同源克隆法获得中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合酶基因VqSTS9和VqSTS21,构建植物过表达载体;用无核白单芽茎段诱导出分生愈伤组织,作为农杆菌介导法遗传转化的受体材料,获得抗性植株,经过不同水平检测,确定转基因植株;对野生型和转基因植株叶片人工接种葡萄白粉病菌（Uncinula necator）,通过显微技术观察叶片受白粉病菌侵染后的情况,比较两者对白粉病的抗性;利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析野生型和转基因植株在自然条件和接种白粉病菌后STS及其相关基因的表达,用高效液相色谱法（HPLC）检测转基因植株中芪类物质的种类与含量。【结果】同源序列克隆得到VqSTS9（JQ868689）与VqSTS21（JQ868677）的cDNA序列,长度为1 179 bp。经PCR和Western blot检测,鉴定出过表达VqSTS9无核白植株4株和过表达VqSTS21无核白植株3株。显微观察发现,与野生型植株相比,转VqSTS9 和VqSTS21植株叶片上的菌丝生长较慢,表现出对白粉病的抗性。qRT-PCR结果表明,自然生长条件下,与野生型植株相比,转VqSTS9和VqSTS21植株STS的表达量提高,STS上游苯丙氨酸裂解酶基因（PAL）、下游白藜芦醇糖基转移酶基因（RSGT）、转录因子基因（MYB14、MYB15）的表达量均不同程度上升,而查尔酮合成酶基因（CHS）表达量降低;人工接种白粉病菌后,与野生型植株相比,转基因植株STS表达量显著上调。高效液相色谱分析表明,自然条件下,芪类物质主要以反式云杉新苷形式存在,转基因植株芪类物质的含量高于野生型植株;在接种白粉病菌诱导表达后,除了反式云杉新苷,还产生了反式白藜芦醇和葡萄素,即转基因植株体内芪类物质的种类和含量均有所增加。【结论】将VqSTS9、VqSTS21转入无核白后,转基因植株STS的表达量增高,芪类物质的含量与种类增加,并抑制白粉病菌的生长。因此,中国野生毛葡萄‘丹凤-2’携带的VqSTS9和VqSTS21能够增强欧洲葡萄对白粉病的抗性,‘丹凤-2’可用作葡萄抗病性育种的种质资源。 相似文献
10.
共转化获得无抗性标记的转反义蜡质基因籼稻 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】利用转基因技术将反义蜡质基因导入籼稻成熟胚愈伤组织中,改良籼稻稻米直链淀粉含量。【方法】用根癌农杆菌介导的方法将p13W8质粒（含反义蜡质基因）和pCAMBIA1300质粒（含抗潮霉素抗性基因）对2个籼稻品种的成熟胚愈伤组织进行遗传共转化。【结果】供试材料愈伤组织继代培养18～24 d后具有较高的转化频率和分化频率,可作为共转化的良好受体;抗性愈伤组织PCR检测结果表明,抗潮霉素抗性基因的阳性检测率为97.6%,反义蜡质基因的阳性检测率为27.1%。在46株转基因潮霉素抗性植株中,反义蜡质基因阳性株为5株,占转基因植株的10.9%。经PCR检测,发现上述4个株系T1群体中发生抗潮霉素抗性基因和反义蜡质基因片段的分离,从286个T1单株中筛选到了39个单株只带反义蜡质基因片段,而无潮霉素抗性基因的转基因植株,占T1单株总数的13.6%。部分转反义蜡质基因植株种子的直链淀粉含量有不同程度的降低。【结论】通过农杆菌介导的遗传共转化方法,将反义蜡质基因Waxy导入籼稻成熟胚愈伤组织,获得了直链淀粉含量明显降低的仅含反义蜡质基因籼稻株系。 相似文献
11.
[目的]了解苦豆子凝集素基因(SAL)的功能,将该基因构建到植物表达载体并转化烟草,获得转基因植株.[方法]利用RT-PCR技术,提取苦豆子总RNA进行反转录得到cDNA,通过PCR扩增得到苦豆子凝集素基因SAL,并将其克隆到植物表达载体pCAMBIA1301上,产生重组质粒pCAMBIA1301-SAL.采用农杆菌介导法将重组质粒转化烟草,并进行分析鉴定.[结果]构建了植物表达载体pCAMBIA1301-SAL,转化烟草后经筛选获得76株转基因植株,经抗性筛选及PCR和RT-PCR鉴定,其中27株显示为阳性植株.[结论]苦豆子凝集素基因已经在烟草中成功表达,为进一步研究验证转基因烟草的抗病效果奠定了基础. 相似文献
12.
【目的】研究转棉花GhCYP1对烟草耐旱能力的影响。【方法】利用Gateway技术构建GhCYP1的植物表达载体pGWB-GhCYP1,采用农杆菌介导的遗传转化技术,获得融合目的基因的转基因烟草植株。以烟草野生型（WT）、L1和L2转基因系为试验材料,测定水分胁迫条件下烟草叶圆片中叶绿素的相对含量、叶片中相对水分含量、丙二醛含量和相对电导率。【结果】与野生型烟草植株相比,转GhCYP1烟草植株根系粗壮、发达。水分胁迫下转基因烟草叶圆片中的叶绿素相对含量显著高于野生型。水分胁迫3 d,WT、L1和L2中相对含水量、丙二醛含量和相对电导率无显著差异（P<0.05）。水分胁迫13 d,转基因系叶片中相对含水量明显高于野生型（P<0.05）,丙二醛含量和相对电导率均明显低于野生型（P<0.05）。【结论】干旱胁迫对野生型烟草产生了较大影响,而转基因烟草显示出较强的耐旱能力,表明GhCYP1的过量表达有助于提高烟草的耐旱能力。 相似文献
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CP基因3'端短片段介导的对马铃薯Y病毒的抗性 总被引：3，自引：0，他引：3
【目的】探明马铃薯Y病毒脉坏死株系（PVYN）CP基因3′端序列短片段的不同结构转基因诱导转基因植物产生RNA介导抗性的有效性。【方法】以PVYN的CP基因cDNA 3′端202 bp片段构建非翻译的正向重复和反向重复结构的植物表达载体转化烟草。【结果】攻毒试验表明前者没有一例转基因植株表现为抗病，而转化反向重复结构的转基因植株82.8%表现近似免疫的高度抗病型，Southern印迹杂交证明目的基因已整合到烟草基因组，Northern印迹杂交结果显示反向重复结构转基因植物的抗病性与RNA的表达量呈现负相关。【结论】抗病性是RNA介导的病毒抗性。3′端短片段诱导产生的转基因抗病株比例比5′端短片段诱导产生的高。 相似文献
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多抗PVY、TMV和CMV转基因烟草的培育 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】利用RNA介导抗性培育抗多种植物病毒的转基因烟草。【方法】分别以马铃薯Y病毒（PVY）、烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）全长衣壳蛋白（CP）基因为模板,通过设计PCR引物和亚克隆获得PVY CP 3′端长度100 bp、TMV CP 3′端长度100 bp和CMV CP 3′端长度200 bp的cDNA片段并拼接成嵌合基因,并以此为模板构建反向重复结构嵌合基因的植物表达载体pRHPTC。将pRHPTC通过冻融法导入农杆菌LBA4404,采用叶盘法转化烟草NC89,然后测定转基因烟草对3种病毒的抗性。【结果】经卡那霉素筛选和PCR检测,共获得276株转基因烟草。Southern和Northern blot分析表明,外源基因以不同拷贝数整合于烟草基因组中;不同转基因植株中病毒RNA的积累量存在显著差异。抗病性检测显示：23%左右的转基因植株表现出对3种病毒侵染的抗性。对转基因植株扩繁后代和T1代的抗性分析表明：多病毒抗性表现稳定。【结论】利用RNA介导的抗病毒基因工程可获得同时抗多种病毒的转基因烟草,其抗病性在T0代扩繁植株和T1代植株中得到稳定遗传。 相似文献
16.
禾谷缢管蚜取食5种山羊草的诱导抗性 总被引：5，自引：2，他引：3
【目的】研究5种山羊草（Aegilops）对禾谷缢管蚜（Rhopalosiphum padi）取食的诱导性抗性机理,探索多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）与苯丙氨酸解氨酶（PAL）的诱导性抗性及协同抗蚜性,探索利用禾谷缢管蚜取食产生的叶片受害斑点面积进行抗性评价的可行性。【方法】利用薄层层析定量分析芦竹碱、紫外分光光度计测定PPO、POD、PAL酶活,用PHOTOSHOP 7.0估算受害斑点面积等。【结果】不同抗性野生山羊草旗叶受害斑点面积大小具有一定的规律性且与蚜量比值呈极显著正相关（r=0.951**）,与山羊草抗蚜性密切相关。在蚜虫取食诱导后,不同抗性水平的植株体内PPO、POD及PAL的酶活提高率随物种抗性水平的增加而增加,且与蚜量比值表现出一定的负相关;而与受害斑点面积表现出显著负相关,其多元逐步回归方程为Yarea＝0.187－0.0356XPOD [F=17.0065,F0.05（1,3）=10.1,F0.01（1,3）=34.1];PPO酶活诱导性提高率与蚜量比值的相关有56.37％是由POD协同作用而产生的,反之则为46.85％。在蚜虫取食诱导后,山羊草芦竹碱的含量提高率与蚜量比值呈显著的负相关,相关系数分别为－0.884*。【结论】蚜虫取食危害产生的叶片受害斑点面积大小与小麦抗蚜性密切相关。PPO、POD、PAL酶活提高率与蚜虫取食诱导有关。PPO与POD在山羊草抗蚜性方面具有协同作用。芦竹碱对禾谷缢管蚜种群数量发展具有一定的抑制作用。 相似文献
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小麦糖原合成酶激酶(TaGSK1)的亚细胞定位及其功能鉴定 总被引：5，自引：0，他引：5
【目的】对小麦糖原合成酶激酶（TaGSK1）进行亚细胞水平定位以及功能鉴定。【方法】构建Tagsk1-gfp融合基因表达载体并转化拟南芥，以仅携带gfp基因的拟南芥作为对照，利用共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白在转基因植株根部细胞的分布；利用含不同浓度NaCl的MS培养基对携带有融合基因的拟南芥和Columbia型拟南芥进行耐盐性鉴定，观察主根生长量和侧根生长数目。【结果】发现TaGSK1存在于细胞质内，且该激酶在根尖分生组织和与侧根发生有关的中柱鞘细胞中分布较多；耐盐性鉴定结果表明，转Tagsk1-gfp融合基因的植株的平均主根生长量和侧根生长数目与Columbia型拟南芥植株的差异均达到极显著水平（P<0.01）。【结论】TaGSK1定位于细胞质内，该激酶具有促进细胞分裂及提高转基因拟南芥抗渗透、抗胁迫的能力。 相似文献
18.
【目的】利用病菌粗毒素离体筛选大蒜抗叶枯病变异系,建立抗病变异系离体筛选方法。【方法】以蒜瓣茎盘为外植体诱导愈伤组织;以大蒜叶枯病菌培养滤液制取的粗毒素为筛选剂,离体筛选大蒜抗叶枯病变异系;通过接种病菌粗毒素和病菌孢子鉴定变异株的抗病性,分析变异株的防御酶活性。【结果】大蒜叶枯病菌粗毒素对大蒜愈伤组织增殖有显著抑制作用,抑制作用随病菌粗毒素质量分数的增加而增强,不同大蒜品种愈伤组织对病菌粗毒素的抗性不同;利用不同体积分数的病菌粗毒素分步筛选分别获得大蒜品种G039变异系苗12株,G073变异系苗2株,它们对大蒜叶枯病菌粗毒素具有稳定的抗性。经病菌孢子悬浮液接种鉴定,变异系苗较其对照抗病性提高。大蒜抗叶枯病变异系苗接种病菌后叶片过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解胺酶（PAL）的活性在短时间内即达到峰值,且与抗病品种G064接近或更高,而感病品种G039的酶活性则明显低于前两者。【结论】利用不同体积分数的大蒜叶枯病菌粗毒素分步筛选可以获得大蒜抗叶枯病变异系,适宜大蒜抗叶枯病变异系分步筛选的上限粗毒素体积分数为30%;POD、PPO和PAL活性可作为大蒜抗叶枯病鉴定的生化指标。 相似文献
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【目的】克隆桑树（Morus alba L.）二氢黄酮醇4-还原酶（dihydroflavonol-4-reductase,DFR）基因,并通过烟草过表达研究其对烟草黄酮生物合成的影响,为该基因功能分析及应用提供理论参考。【方法】采用RT-PCR的方法从桑树中克隆出MaDFR,采用农杆菌介导的遗传转化技术,将MaDFR导入模式植物烟草中,获得具有卡那抗性的转基因烟草植株,通过基因组PCR鉴定转基因阳性植株,采用反向PCR的方法分析T-DNA在烟草中的插入位点。通过定量PCR的方法分析MaDFR在烟草中的表达水平,AlCl3分光光度法测定转基因烟草中总黄酮含量,通过DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）清除能力分析总黄酮酸水解前后的抗氧化活性,最后通过高效液相色谱（HPLC）分析烟草花冠中花青素的含量及种类。【结果】从中桑5801中克隆并获得了全长为1 026 bp的MaDFR,编码341个氨基酸残基,其蛋白质具有典型的NADPH结合位点。获得7株具有卡那抗性的烟草转基因株系。分子鉴定4株为转基因阳性株系。MaDFR在转基因烟草中能够表达,但不同转基因株系之间MaDFR表达水平存在较大差异。转基因烟草叶片中总黄酮含量明显增加,其中,DFR-4和DFR-7 2个株系分别增加了30.4%和27.6%,DFR-2和DFR-5分别增加了19.8%和14.2%。抗氧化活性分析发现转基因株系叶片中未酸解总黄酮抗氧化活性存在较大差异,DFR-2、DFR-4的抗氧化能力比对照组提高了近5倍,而DFR-5和DFR-7与对照组没有显著性的差异,转基因株系叶片中总黄酮的抗氧化活性与MaDFR的表达水平具有显著的正相关性。转基因株系叶片中酸解总黄酮抗氧化活性与总黄酮的含量具有显著的正相关性。MaDFR在烟草中的过表达能够增加花冠中花青素的含量,DFR-4株系中花青素含量增加了15%,DFR-5和DFR-7 2个株系中花青素的含量增加了一倍,但转基因烟草花冠中花青素种类没有发生改变。【结论】MaDFR在烟草中的过表达能够显著增加烟草的总黄酮含量及抗氧化作用,也可以显著增加烟草花冠中花青素的含量,但不能改变花青素的种类,说明该基因在矢车菊素类花青素的生物合成代谢路径中具有重要作用。 相似文献