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为了表达奶牛粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)并对其活性进行检测.根据GenBank中登录的牛GM-CSF基因序列(U22385),设计一对特异性引物;采用RT-PCR方法,以LPS体外诱导的奶牛肺泡巨噬细胞为材料,从总RNA中扩增出奶牛GM-CSF cDNA基因,克隆到pGEM-T载体中,经酶切鉴定与序列测定,结果显示克隆的奶牛GM-CSF基因与GenBank中登录的牛GM-CSF基因序列的核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.7%和99.3%.构建pET32a-GM-CSF原核表达重组质粒,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果显示重组蛋白大小约为35 ku.分别运用集落形成试验与MTT比色法测定重组蛋白活性,结果显示重组奶牛GM-CSF蛋白能够诱导粒细胞前体呈集落性生长并具有较强的体外增殖淋巴细胞的活性,为下一步临床试验奠定了基础. 相似文献
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为了方便鸡粒细胞/巨噬细胞集落细胞刺激因子（GM-CSF）作为疫苗佐剂使用,用PCR方法扩增出鸡GM-CSF基因,将其连入人腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,将重组穿梭载体与腺病毒骨架重组后,获得重组腺病毒骨架载体,线性化后转染293SD细胞,获得能够表达鸡GM-CSF的腺病毒。将获得的重组腺病毒转导鸡成纤维细胞系DF1,细胞培养上清中,可以检测到GM-CSF刺激鸡骨髓细胞活性,为鸡GM-CSF进一步应用奠定了基础。 相似文献
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粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)是一种具有多种生物学活性的细胞因子。本试验根据GenBank发表的猪的GM-CSF基因序列设计特异性引物,对GM-CSF基因片段进行扩增,扩增后的PCR产物经酶切后克隆入pET-28a载体。重组质粒转化入大肠杆菌杆菌BL21中经IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果证明,重组蛋白获得了成功表达,并且主要以包涵体的形式存在。Western blot结果证明重组蛋白具有良好免疫反应性。以上结果为进一步应用重组GM-CSF作为血液干细胞动员剂提供了基础。 相似文献
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DNA疫苗具有制备简单,不需要蛋白质的合成、提取与纯化,免疫效果维持时间长,稳定性好,易保存等特点。但由于种与种之间免疫遗传差异,DNA疫苗往往对大动物特别是对哺乳动物的免疫效果不理想。细胞因子常作为基因佐剂用以增强DNA疫苗的免疫原性。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是一个具有多项潜能的造血生长因子,在免疫反应中具有重要作用,编码GM-CSF的质粒能增强DNA疫苗的免疫效果。本文就GM-CSF的分子结构、对增强疫苗免疫原性、协同其他因子作用等方面作一综述。同时介绍了基因佐剂与目的基因表达质粒的构建方案。 相似文献
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本研究运用R T-PCR技术从萧山鸡脾脏细胞总R NA中扩增获得鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)成熟区序列,并进一步通过设计重叠引物构建出GM-CSF-SS(SS:生长抑素)嵌合基因,并将其在大肠杆菌中进行表达。结果表明:实验成功得到鸡GM-CSF成熟区片段(435 bp)和GM-CSF-SS嵌合基因(486 bp),并在大肠杆菌中成功表达出GM-CSF和GM-CSF-SS融合蛋白,分子量分别约为18 ku和20 ku,该研究为通过免疫途径提高动物生长性能提供基础。 相似文献
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《畜牧与兽医》2017,(10):86-90
为了探讨鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因对鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2 DNA疫苗诱导的免疫反应的影响,将pTriEx-4-VP2-GM-CSF质粒免疫SPF鸡,加强免疫2周后,进行IBDV强毒攻击,检测机体免疫相关指标。结果表明:鸡GM-CSF基因能够增强VP2 DNA疫苗诱导的特异性免疫反应,影响细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10的表达水平,对外周血淋巴细胞的增殖没有显著影响。这一结果提示鸡GM-CSF基因对IBDV VP2 DNA疫苗具有一定的免疫调节作用。 相似文献
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《现代畜牧兽医》2021,(10)
试验旨在研究猪卵母细胞体外培养过程中粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)对卵丘细胞的影响。在成熟培养液不变的情况下添加10μg/L和100μg/L的GM-CSF,对卵丘卵母细胞复合体(COC)分别培养12、24、48 h,运用CCK8检测试剂盒检测卵丘细胞活性。收集培养48 h的COC,观察卵丘细胞扩展情况,统计卵母细胞极体排出率。结果显示,GM-CSF对卵母细胞极体排出率无显著影响,但有助于3～4级卵丘细胞的扩散。100μg/L的GM-CSF作用48 h,能够极显著提高卵丘细胞的细胞活性(P0.01)。研究表明,100μg/L的GM-CSF可促进COC中3～4级卵丘细胞的扩展。 相似文献
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犬细小病毒编码的VP2蛋白是该病毒重要的结构蛋白和抗原蛋白.利用VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应.为进一步提高VP2 DNA疫苗的免疫活性,本实验利用犬粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因作为生物佐剂研究其对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用.首先通过RT-PCR方法从犬淋巴细胞中扩增GM-CSF基因,并将其插入到pcDNA3.1栽体上,分别构建该基因的两个分泌型真核表达载体,即非融合表达载体pcDNA-cGMCSF和与Myc His融合的表达栽体pcDNA-cGMCSF/MH.用pcDNA-cGMCSF/MH载体转染HEK293T细胞以确定GM-CSF基因能否在真核细胞中进行分泌表达.然后用本室构建的VP2基因表达栽体单免疫小鼠,用VP2表达载体与pcDNA-cGMCSF共免疫小鼠(pcDNA3.1空载体作为阴性对照).免疫后用ELISA方法检测不同时间小鼠血清的抗体水平.用MTT法检测小鼠免疫后35 d时淋巴细胞的增殖活性,同时用ELISA试剂盒检测小鼠淋巴细胞γ干扰素的表达水平.结果表明,本试验构建的表达载体能够介导重组GM-CSF在真核细胞中进行分泌表达.免疫实验表明,利用GM-CSF基因与VP2基因共免疫小鼠,抗体的水平明显高于VP2基因单免疫组(P＜0.01).共免疫组小鼠淋巴细胞的刺激指数和γ干扰素的表达水平均明显高于单免疫组(P＜0.05).由此可见,GM-CSF表达载体可明显提高CPV VP2 DNA疫苗的免疫应答水平. 相似文献
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猪GM-CSF基因对猪圆环病毒2型DNA疫苗诱导仔猪免疫反应的调节作用 总被引：1，自引：0，他引：1
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）能够诱导树突状细胞的成熟和存活，并提高其抗原递呈功能，是非常有潜力的分子佐剂之一。为了探讨猪GM-CSF对猪圆环病毒2型（PCV2）DNA疫苗诱导免疫反应的调节作用，本研究将表达猪GM-CSF和PCV2衣壳蛋白的重组质粒混合物（pcDNA3．1-gm-csf和pcDNA3．1-orf2）及在同一载体上表达PCV2衣壳蛋白与猪GM-CSF的双表达重组质粒（pIRES-orf2／gm-csf），分别接种于7日龄健康仔猪，共肌肉注射3次，每次间隔2周。结果表明猪GM-CSF基因能够明显增强PCV2DNA疫苗诱导的特异性体液免疫反应，提高外周血淋巴细胞（PBLC）对ConA刺激的增殖活性，增强NK细胞的杀伤功能，影响细胞因子IL-12、IFN-γ、IL-4和IL-10的表达水平。但GM-CSF基因单独表达和与PCV2衣壳蛋白基因在同一载体上表达，对上述4个细胞因子表达的影响有一定差异。 相似文献
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粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的克隆、原核表达及生物活性鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为了探讨粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)在免疫中的作用,根据GenBank上发表的鸡GM-CSF基因序列设计特异引物,采用RT-PCR法对球虫免疫后的海蓝灰蛋鸡盲肠扁桃体中GM-CSF基因进行克隆和序列分析;设计GM-CSF原核表达引物,原核表达GM-CSF融合蛋白,通过菌体裂解,包涵体的洗涤、溶解、复性后,过Sepharose4B柱纯化融合蛋白,采用抗病毒试验和淋巴细胞增殖试验检测表达蛋白的生物活性。结果显示,从人工感染柔嫩艾美耳球虫的海蓝灰蛋鸡盲肠扁桃体中扩增到了435bp的DNA片段;序列分析表明其与GenBank中报道的鸡GM-CSF序列仅有1个碱基的差异,与哺乳动物的同源性在35.2%～45.4%;原核表达了海蓝灰蛋鸡GM-CSF,分离纯化的融合蛋白在抗病毒活性试验和淋巴细胞增殖试验中证明具有一定的生物学活性。 相似文献
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为构建表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)S1与GM-CSF融合基因的重组腺病毒,通过FMDV的2A基因序列做为Linker将密码子优化的S1基因和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因连接。构建重组穿梭质粒pShuttle-GM-CSF 2A-S1(m),并将其电转化至含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠埃希菌BJ5183感受态细胞中,通过同源重组制备重组腺病毒质粒pAd-GMCSF2A-S1(m)。重组腺病毒质粒经PacI线性化后转染HEK-293A细胞,获得重组腺病毒rAd-GMCSF2A-S1。间接免疫荧光和Western blot结果显示,S1和GMCSF蛋白在重组腺病毒感染的HEK-293A细胞中获得表达。该重组腺病毒的制备为PEDV重组活载体疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
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白细胞介素18 (Interleukin- 18,IL-18)主要由单核-巨噬细胞系分泌,在结构上属于IL-1家族[1],在功能上与IL-12相似,而且与IL-12有协同效应,是重要的调节先天性免疫和获得性免疫的因子.IL-18除了能够明显诱导Th1、NK及NKT细胞产生IFN-γ外,还可诱导诸如IL-2、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及肿瘤坏死因子(TNF-α)等其它多种细胞因子的产生[2]. 相似文献
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根据GenBank中鸡白细胞介素18(IL-18)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的序列设计2对特异引物,以白来航鸡脾淋巴细胞总RNA为模板进行RT-PCR扩增,克隆白来航鸡IL-18和GM-CSF工基因并进行序列分析.测序结果表明,白来航鸡IL-18基因开放阅读框为597 bp,编码199个氨基酸;序列分析表明,所获得的白来航鸡IL-18基因与GenBank中鸡IL-18的核苷酸同源性为99.0%～99.8%,氨基酸同源性为97.5%～99.5%.白来航鸡GM-CSF基因开放阅读框为435 bp,编码145个氨基酸;序列分析表明,所获得的白来航鸡GM-CSF基因与GenBank鸡GM-CSF的核苷酸同源性为99.3%～100%,氨基酸同源性为99.3%～100%,生物信息学分析表明,IL-18与GM-CSF基因编码的蛋白具有亲水性,都有很强的抗原性,IL-18共有2个潜在的N-糖基化位点,可能存在4个蛋白激酶C磷酸化位点,存在3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点;GM-CSF共有1个潜在的N-糖基化位点,可能存在1个蛋白激酶C磷酸化位点,存在4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点. 相似文献
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根据GenBank上公布的猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(pGM-CSF)基因序列(U67175.1)扩增该基因,克隆至pET30b载体,构建重组表达载体pET30b-pGM-CSF,并与分子伴侣辅助质粒pG-KJE8共同转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE分析,可见表达的目的蛋白大小约为23ku,主要以包涵体形式存在,且在分子伴侣的辅助下,增大了可溶性蛋白的表达量。经镍离子亲和层析纯化后,通过淋巴细胞增殖试验初步检测了pGM-CSF蛋白促进淋巴细胞增殖的活性。结果表明,猪GM-CSF具有明显的体外刺激淋巴细胞增殖的生物学活性,为进一步研究猪GM-CSF的生物学功能以及临床应用奠定了基础。 相似文献
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牛GM-CSF与金黄色葡萄球菌黏附素FnBPB共表达质粒的构建与原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
采用PCR方法对牛粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和金黄色葡萄球菌FnBPB的D区进行特异性的扩增,并通过重叠延伸PCR扩增GM-CSF-FnBPB串联基因,构建了克隆质粒pMD19-GM-CSF-FnBPB。利用表达载体pET-32a(+)对该融合基因片段进行原核表达,SDS-PAGE分析表明,在1mmol/L IPTG诱导浓度下,在39ku处出现了与目的蛋白一致的外源蛋白带,Western blot分析表明,该蛋白具有反应原性,进而证明该融合基因成功在原核细胞中表达。 相似文献
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羊传染性脓疱(orf)是由羊传染性脓疱病毒(orf virus,ORFV)感染引起的绵羊和山羊的一种接触性人兽共患病。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)/白细胞介素(IL-2)抑制因子(GIF)基因为ORFV编码中晚期病毒基因,它能够与GM-CSF、IL-2结合并且抑制二者的活性,从而抑制宿主抗病毒作用。为了比较疫苗毒株和流行毒株间GIF的差异,本试验扩增并测定了ORFV疫苗株和野毒株的GIF基因序列,比较分析了ORFV疫苗弱毒株和野毒株GIF基因的核酸水平和氨基酸水平的差异情况,以及二、三级蛋白结构。结果表明:本次测定的ORFV疫苗株与野毒GIF基因核苷酸序列相似性为94.3%,氨基酸序列相似性为92.5%,两者的蛋白三级结构预测上也有差异。本研究结果为该病的防控提供了参考依据。 相似文献
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根据GenBank中鸡白细胞介素18（inteleukin 18,IL-18）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF）基因序列,克隆白来杭鸡IL-18和GM-CSF基因并进行序列分析。结果显示：白来杭鸡IL-18基因开放阅读框为597 bp,编码199个氨基酸,所获得的白来杭鸡IL-18基因与GenBank鸡IL-18的核苷酸同源性为99.0%～99.8%,氨基酸同源性为97.5%～99.5%。白来杭鸡GM-CSF基因开放阅读框为435 bp,编码145个氨基酸,所获得的白来杭鸡GM-CSF基因与GenBank鸡GM-CSF的核苷酸同源性为99.3%～100%,氨基酸同源性为99.3%-100%。IL-18与GM-CSF基因编码的蛋白具有亲水性,都有很强的抗原性。IL-18共有2个潜在的N-糖基化位点,可能存在4个蛋白激酶C磷酸化位点及3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。GM-CSF共有1个潜在的N-糖基化位点,可能存在1个蛋白激酶C磷酸化位点及4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。本研究结果为进一步研究鸡IL-18、GM-CSF基因表达、生物学活性和应用奠定了基础。 相似文献