共查询到20条相似文献，搜索用时 31 毫秒
1.
抗体是蛋白质功能研究的重要试剂。玉米蛋白的功能研究因缺乏相应的抗体而难以开展。玉米淀粉合酶Ⅱb与淀粉合酶Ⅱa均属于淀粉合酶,其主要负责支链淀粉的延伸。但对淀粉合酶Ⅱb的报道较少,本研究以原核表达的淀粉合酶Ⅱb的C端(455～704 aa) GST融合蛋白为抗原,免疫新西兰大白兔,分离血清制备SSⅡb多克隆抗体。Western blot试验发现, SSⅡb多克隆抗体不但能识别SSⅡb-C (455～704 aa)抗原,而且能识别玉米不同发育阶段胚乳中SSⅡb蛋白。利用该多克隆抗体的Western blot试验表明,玉米SSⅡb蛋白的表达在授粉后10 d到30 d的胚乳中表达模式是先增后降,授粉后15 d表达量最高,而半定量RT-PCR的结果表明授粉后20 d SSⅡb的转录水平最高。这些结果表明成功制备了特异的玉米SSⅡb的多克隆抗体,并能在Western blot中特异识别玉米内源SSⅡb蛋白,为进一步深入研究SSⅡb蛋白功能奠定基础。 相似文献
2.
为构建灰葡萄孢犬尿氨酸单加氧酶(Bc KMO)基因的原核表达载体并进行高效表达,获得纯化的Bc KMO蛋白。以灰葡萄孢野生型BC22为试材,通过反转录PCR扩增Bc KMO基因,回收Bc KMO基因片段克隆到p MD19-T载体中,测序正确后,酶切p MD19-T-Bc KMO和带有GST标签蛋白的p GEX4T-1质粒,将目的片段进行连接,构建Bc KMO基因的原核表达载体p GEX4T-1-Bc KMO-GST。经酶切和测序鉴定正确后,将构建好的原核载体转化大肠杆菌BL21。经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21菌株中成功表达了与GST标签蛋白融合的Bc KMO蛋白,大小约71 k Da。SDS-PAGE分析表明,该蛋白在0.2 mmol/L IPTG诱导12 h时高效表达;Western Blot结果发现目的蛋白能与GST特异性抗体起特异性反应,表明Bc KMO基因的体外诱导表达成功。 相似文献
3.
稻瘟病菌一假定α-甘露糖苷酶多克隆抗体的制备及应用 总被引：1，自引：1，他引：0
摘要：【研究目的】为检测α-甘露糖苷酶的表达及其可能的功能,制备了稻瘟病菌一假定α-甘露糖苷酶多克隆抗体,并探索其可能应用。【方法】将与-His标签融合的过量表达一假定α-甘露糖苷酶蛋白的稻瘟病菌转化子,在液体完全培养基中培养,收集其上清液,经Ni2+-NTA亲和柱纯化后,得到可溶的融合蛋白α-甘露糖苷酶-His。【结果】纯化后的融合蛋白免疫新西兰兔,得到抗α-甘露糖苷酶蛋白的多克隆抗体,ELISA检测结果表明抗体效价达1：51200,特异性高。利用该多克隆抗体以ELISA方法检测并Western验证分析稻瘟病菌30个田间菌株培养液α-甘露糖苷酶的表达量。【结论】不同菌株α-甘露糖苷酶表达量有明显差异。进一步分析表明,菌株70-15接种水稻后,不同时期α-甘露糖苷酶的表达量差异明显。菌株间致病型等生物学和生理学差异可能与α-甘露糖苷酶表达的差异有关。 相似文献
4.
HOG MAPK途径参与植物病原真菌生长发育、致病和对杀菌剂敏感性等过程,CsPbs2基因是HOG MAPK信号通路的关键成员。为研究CsPbs2蛋白的互作蛋白及其调控机制,本研究克隆了橡胶树炭疽菌(Colletotrichum siamense) CsPbs2基因,构建融合蛋白表达载体,利用SDS-PAGE和Western Blot检测蛋白表达。结果显示橡胶树炭疽菌(C. siamense)的CsPbs2基因全长2 051 bp,编码667个氨基酸,包含个1个内含子,具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域。CsPbs2基因在进化关系上与球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的Pbs2基因有最近的亲缘关系。构建的GST-CsPbs2蛋白融合表达载体在供试条件下(IPTG:0.6 mmol/L, 0.8 mmol/L,1.0 mmol/L温度16℃和25℃)均可较好诱导表达,GST-CsPbs2融合蛋白大小约为96 kD。用GST亲和层析柱纯化获得蛋白,经Western Blot检测显示该蛋白可与GST单克隆抗体特异性结合。本研究成功构建了GSTCsPbs2蛋白融合表达载体,纯化得到GST-CsPbs2融合蛋白,为后续利用Pull-down技术钓取Cs Pbs2的互作蛋白提供基础。 相似文献
5.
为了制备家蚕CSP9的多克隆抗体，研究该蛋白在家蚕中的表达特征和功能。利用PCR扩增家蚕csp9基因，构建其原核表达载体，诱导CSP9蛋白表达并纯化。纯化后的CSP9蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，Western杂交检测CSP9在家蚕中的表达特征。最终成功构建csp9/pET-28a原核表达载体，并纯化获得与预测分子量一致的CSP9蛋白；成功制备了CSP9多克隆抗体；Western杂交结果表明，CSP9在家蚕不同时期和不同组织中都有特异表达。本研究成功表达纯化并制备了家蚕CSP9多克隆抗体，分析了CSP9在家蚕中的表达特征，为后续该蛋白在家蚕中的功能和调控研究奠定了基础。 相似文献
6.
为研究玉米Zmcen基因的特征及生物学功能,并对其编码蛋白结构与功能进行分析。以玉米c DNA为模板,将其构建到带有GST表达标签的原核表达载体p GEX-6p-1中,构建的重组载体p GEX-6p-ZmCen转化至大肠杆菌BL21(DE3),通过0.3 mmol/L IPTG在27℃下诱导表达20 h,获得了可溶性的GST融合蛋白。采用GST亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,经12%SDS-PAGE电泳和GST标签抗体Western Blotting检测,鉴定为含有GST-Tag的融合蛋白,纯化的蛋白经Pre Scission Protease(PPase)过夜酶切切除GST标签,得到较纯的ZmCen蛋白;同时利用生物信息学的方法,解析ZmCen蛋白质的结构特征。结果表明,该基因定位于玉米第7#染色体上,全长基因含有6个外显子和7个内含子,519 bp的开放阅读框,编码172个氨基酸,分子量约为19.78 k Da,等电点为4.78。采用maize GDB数据库对玉米整个生命周期的表达水平进行分析表明,细胞分裂旺盛的部位,Zmcen基因的表达量较高。对16种植物进行系统发育树分析显示,Zmcen基因与水稻、小麦、拟南芥等的centrin基因同源性高达80.21%,该结果为探索Zmcen蛋白的未知生物学功能提供了线索。 相似文献
7.
内蒙古羊源细粒棘球蚴Eg95基因原核表达及蛋白鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
在克隆内蒙古羊源细粒棘球蚴疫苗候选基因Eg95的基础上,构建原核表达载体pET-Eg95并转化E.coli BL21(DE3),优化表达体系,获得Eg95纯化蛋白.将Eg95基因从克隆质粒pMD19-T-Eg95亚克隆到原核表达载体pET44a(+)上,构建原核表达载体pET-Eg95,转化E.coli BL21(DE3)诱导表达,优化表达条件.纯化的 Eg95 融合蛋白经 SDS-PAGE和Western Blot鉴定其正确性和免疫学活性.原核表达载体pET-Eg95在大肠杆菌中高效表达,优化的原核表达条件为:当菌液OD600值为0.6时,加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG,37℃,振荡培养5 h.纯化后的蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定为目的蛋白并具有生物学活性.原核表达载体pET-Eg95构建正确并可高效表达可溶性Nus-Eg95融合蛋白,可作为特异性抗原应用于免疫印迹法检测血清抗体. 相似文献
8.
本文在分析su_1,sh_2,bt_2,o_2,wx玉米胚乳突变基因与互作对籽粒成分影响的基础上,探讨了胚乳突变基因影响下籽粒各成分之间的关系并讨论了这些关系对玉米品质改良的意义。研究表明,玉米胚乳突变基因及其互作可以不同程度地增加籽粒蛋白质、赖氨酸、可溶性糖、蔗糖、还原糖、清蛋白、球蛋白及谷蛋白含量,降低淀粉和醇溶蛋白含量,但突变体百粒重多明显降低。在籽粒各成分的关系中,百粒重、淀粉和醇溶蛋白含量三性状呈正相关关系,三性状和其它性状间呈负相关关系,其它性状间均呈正相关关系。分析表明淀粉和醇溶蛋白含量是影响籽粒品质的主要因素,胚乳突变基因主要通过降低淀粉和醇溶蛋白含量来增加其它成份的含量,进而提高籽粒的营养品质,但淀粉和醇溶蛋白含量的降低会导致粒重下降。所以,利用胚乳突变基因互作效应改良玉米品质应该综合考虑产量和品质二方面的问题。 相似文献
9.
随着市场对工业用玉米淀粉需求的日益增加,培育高淀粉玉米新种质新品种目前成为解决这一问题的关键.本试验针对这一问题开展工作,成功克隆了水稻胚乳特异型启动子RP5和玉米合成关键酶基因AGPL,利用中间载体pGM-T-RP5和pGM-T-AGPL,将RP5和AGPL定向连接到表达载体pCAMBIA3301上,构建表达载体pRP5-AGPL.以东北骨干玉米自交系Y9812幼胚为受体材料,通过农杆菌介导法,获得玉米再生植株,经PCR分子检测,共有17株呈阳性,转化率达到4.4%.本研究成功地将目的基因和启动子转到玉米自交系Y9812中,并建立了一套稳定的玉米遗传转化体系,为今后转化玉米淀粉合成相关基因奠定坚实基础. 相似文献
10.
不同品质类型玉米籽粒充实期的胚乳细胞增殖与生理活性比较 总被引：7，自引：3，他引：4
以普通玉米、糯玉米和爆裂玉米为试材,比较研究了籽粒胚乳细胞数目、物质积累特点、激素含量变化和淀粉合成相关酶活性等方面的类型间差异。结果表明,3种类型玉米籽粒胚乳细胞增殖进程早于干物质的增加进程,普、糯、爆籽粒胚乳细胞数目分别在授粉后24、18和13 d达到最大值,粒重分别在授粉后45、40和30 d达最大值;在籽粒淀粉积累全程,糯玉米总淀粉含量高于同时期普通玉米和爆裂玉米,尤其是在授粉后30 d内差异最明显,普通玉米与爆裂玉米间差异不大;籽粒淀粉积累速率的类型间差异主要表现在积累速率极值大小及其出现时间的早晚两个方面,糯玉米淀粉积累速率最大值分别是普通玉米和爆裂玉米的1.61倍和1.34倍,糯玉米淀粉积累速率最大值出现在授粉后10 d,普通玉米和爆裂玉米则在授粉后20 d。普通玉米的胚乳细胞数目与籽粒灌浆速率极显著正相关,糯玉米显著正相关,爆裂玉米相关不显著。在整个籽粒充实期,普通玉米籽粒的玉米素(ZR)含量都高于同时期的糯玉米和爆裂玉米,而糯玉米又高于爆裂玉米;籽粒生长素(IAA)、脱落酸(ABA)和赤霉素(GA3)含量在3个类型间的差异规律则与ZR刚好相反。3个品质类型的籽粒蔗糖合成酶(SS)活性类型间差异不显著,但在籽粒充实后期普通玉米SS活性下降最慢,而爆裂玉米下降最快;糯玉米的可溶性淀粉合成酶(SSS)和ADPG焦磷酸化酶(ADPGPPase)的籽粒充实期平均活性明显高于普通玉米和爆裂玉米;爆裂玉米的束缚态淀粉合成酶(GBSS)的籽粒充实期平均活性高于普通玉米和糯玉米。 相似文献
11.
《分子植物育种》2016,(6)
丝氨酸乙酰转移酶(serine acetyltransferase,SAT)是甲硫氨酸和半胱氨酸合成途径的关键酶,利用该基因提高作物中甲硫氨酸水平具有广阔的应用前景。为了研究拟南芥SAT1(Arabidopsis thaliana SAT1)基因的蛋白表达情况及相关功能,构建了带有His标签的AtSAT1基因原核表达载体p ET-30b(+)-SAT1-His(6)。将其导入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经固定化金属离子亲和层析(IMAC)纯化获得了抗原蛋白SAT1-His(6)。该抗原蛋白经免疫兔子,成功制备了具有较高特异性和灵敏性的SAT1蛋白多克隆抗体。Western blotting表明,该抗体可用来检测转AtSAT1基因的转基因玉米株系中SAT1蛋白的积累量,为后期对该基因开展进一步深入研究具有重要意义。 相似文献
12.
利用甲基磺酸乙酯(EMS)对玉米自交系B73进行诱变,获得一个可以稳定遗传的小籽粒突变体smk7(small kernel 7)。smk7成熟籽粒表现为体积变小,胚和胚乳发育缺陷,百粒重显著降低。突变籽粒发芽率仅为10%,且幼苗黄化不能生长成正常植株。成熟smk7胚乳中淀粉、蛋白、油分含量与野生型籽粒相比无显著差异,但突变体胚乳淀粉粒体积明显变小且形状不规则。smk7突变籽粒在授粉后12 d即可观察到明显的小籽粒和空瘪表型,石蜡切片显微观察显示突变籽粒的胚和胚乳发育迟缓,胚乳基部转移层细胞(BETL)相对于野生型细胞壁向内生长减少,发育受阻。用杂合植株(+/smk7)与多个自交系分别杂交,构建不同背景的F2分离群体,遗传分析结果表明该性状受单隐性核基因控制。利用靶向测序基因型分型(genotyping by target sequencing,GBTS)技术将基因初定位于2号染色体短臂,进一步精细定位发现该基因位于RM1433917和RM1535316两个标记之间约120 kb的物理范围内,共有8个蛋白编码基因。本研究为进一步克隆和解析SMK7基因调控玉米籽粒发育的分子机制奠定了基础。 相似文献
13.
重组人早孕因子的表达与纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
早孕因子(EPF)是具有免疫抑制和生长调节活性的妊娠相关蛋白,为目前最早确认妊娠的生化指标之一。为获得人早孕因子重组蛋白,利用PCR技术扩增人早孕因子基因,克隆入原核表达载体pGEX-6p-1,与GST基因相融合,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌表达菌株BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,以SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白的表达,利用GST树脂纯化表达蛋白。结果成功构建重组表达质粒pGEX6P-EPF,在大肠杆菌中诱导表达了GST- EPF融合蛋白,表达蛋白分子量为37.3kDa,并能被抗GST单克隆抗体特异识别,GST亲和层析纯化,制备了EPF重组蛋白。 相似文献
14.
通过原核表达系统表达猪传染性胃肠炎病毒( TGEV) S基因不同编码区,以鉴定不同编码区表达产物与TGEV抗体的结合能力。在对TGEV S蛋白抗原位点分析的基础上,针对S蛋白N端的4个抗原位点C、B、D和A,设计引物分别扩增含C、B位点的TCB片段(411 bp)、含D位点的TD片段(441 bp)和含A位点的TA片段(456 bp),经克隆测序后分别插入原核表达载体pET-32a中进行表达,SDS-PAGE电泳显示各片段均高效表达,表达的TCB片段、TD片段和TA片段融合蛋白大小分别为34.6,35.1,36.1 kDa。 Western Blot结果表明,表达蛋白与TGEV感染猪阳性血清和His标签抗体均产生阳性反应。结果显示,3个S基因编码片段均具有与TGEV抗体结合的能力,为进一步鉴定不同编码区的免疫原性及抗原保护能力奠定了基础。 相似文献
15.
为了在体外获得表达量高、储存容易、成本低且免疫活性高的H9N2亚型HA蛋白,利用水稻胚乳表达系统表达HA蛋白。首先,将HA基因根据水稻偏好密码子进行优化,合成到pUC57载体上,通过双酶切、连接将HA基因先后构建到中间载体pMP3和植物表达载体pCAMBIA1300上;再通过电极法将pCAMBIA1300-HA导入到根癌农杆菌EHA105中;然后用农杆菌侵染TP309水稻愈伤组织;最后经潮霉素筛选、分化、生根、移栽至田间种植。利用CTAB法提取叶片基因组DNA,PCR鉴定T_0阳性植株;利用Dot Blot和Western Blot检测HA蛋白在水稻胚乳中的表达;提取阳性的T_1叶片DNA,通过荧光定量PCR方法筛选纯合植株;利用温汤杀雄剪颖授粉法,将含有HA蛋白的TP309与低谷蛋白水稻杂交;利用Western Blot检测杂交后的T_3植株蛋白表达量;利用双抗夹心ELISA方法比较水稻源和昆虫表达HA蛋白的活性。结果显示,成功构建了中间载体pMP3-HA和植物表达载体pCAMBIA1300-HA,且pCAMBIA1300-HA成功导入到根癌农杆菌EHA105中;PCR检测到有66株植株的HA基因成功整合到水稻基因组;Dot Blot和Western Blot检测结果表明,HA蛋白在水稻胚乳中成功表达;利用荧光定量PCR方法,107株T_1中筛选到31株纯合植株;Western Blot检测结果表明,杂交后的HA蛋白表达量大幅度提高;双抗夹心ELISA结果证实,水稻胚乳表达的HA蛋白的活性高于杆状病毒-昆虫细胞。 相似文献
16.
糯玉米是主要鲜食玉米类型, opaque2 (o2)基因导入可增加籽粒赖氨酸含量,但同时引起籽粒皱缩、淀粉含量下降等,限制了其育种应用。为发掘优良糯玉米受体,以籽粒饱满圆型o2近等基因系(o2-NIL)糯2/wx1wx1o2o2和皱缩型黄糯2/wx1wx1o2o2为研究材料,通过对鲜食期、成熟期的百粒重和籽粒成分测定,发现淀粉和可溶性糖含量不同可能是导致2份糯玉米o2-NILs表型差异的主要原因。利用实时荧光定量PCR技术分析,发现授粉后10～24d两糯玉米o2-NILs中6个淀粉合成基因动态表达模式不同,其中Sh1、Sh2、SSIIIa和SBEIIb差异较大。分析胚乳转录组数据,发现两糯玉米o2-NILs中24个海藻糖和糖基水解酶编码基因和48个o2胚乳修饰基因变化不同,以上结果表明淀粉合成关键基因前期表达量高,后期与对照无差异,且糖代谢基因表达变化有利于淀粉合成可能是糯2/wx1wx1o2o2淀粉含量和百粒重不受o2突变影响,籽粒性状明显优于黄糯2/wx1wx1o2o2的重要原因,同时多个胚乳修饰基因的差异表达可能与该结果直接相关。本研究结果可为o2突变体在玉米育种中的应用提供重要... 相似文献
17.
《分子植物育种》2021,19(10):3306-3313
槟榔坏死环斑病毒(areca palm necrotic ringspot virus, ANRSV)是新发现的一种槟榔黄化病致病病毒。本研究利用马铃薯X病毒(potato virus X, PVX)表达载体pgR107,在烟草中表达ANRSV的外壳蛋白(coat protein, CP),旨在分离纯化该蛋白并开展对病毒蛋白的功能研究和利用该蛋白制备多克隆抗体。为方便纯化,将8肽Strep蛋白标签序列融合到ANRSV-CP编码基因的3'端,利用In-Fusion无缝克隆策略将其克隆到PVX载体,构建重组表达质粒PVX-ANRSV-CP-Strep。采用电转化法将质粒PVX-ANRSV-CP-Strep转入根瘤农杆菌GV3101中,通过农杆菌介导注射侵染接种本氏烟,14 d后对收集的16 g表达ANRSV-CP-Strep蛋白、PVX侵染的本生烟草样品进行了蛋白提取,采用SDS-PAGE和Western blot检测ANRSV-CP-Strep蛋白的表达情况。测序结果显示植物病毒表达载体PVX-ANRSV-CP-Strep构建成功。经Strep-Tactin~?XT High Capacity亲和层析柱纯化,SDS-PAGE和Western blot检测结果显示ANRSV-CP-Strep重组蛋白可通过PVX载体在烟草中有效表达,其表达量为22μg/g (鲜叶质量)。本研究为后续利用该蛋白制备多克隆抗体并建立ELISA方法进行病毒检测提供了理论依据。 相似文献
18.
19.
玉米授粉后的10—12天是玉米籽粒发育的一个关键时期。这个时期决定着籽粒以后的生长和发育。决定着胚乳积累干物质的能力,并且影响着形成胚乳细胞和淀粉粒的数目,在玉米的生殖生长期间,外界温度经常比它所需要的最适温度高,在最适温度(25℃)以上,每增加1℃将导致籽粒产量降低3%—4%,因此研究高温胁迫对玉米籽粒发育的破坏和限制机制非常重要。 我们实验室的研究表明:在玉米胚乳细胞分裂和淀粉体生物合成期间,高温胁迫使胚乳细胞的分裂速率和持续时间降低。因此,导致细胞的数目和淀粉体的 相似文献
20.
为研究猪Viperin蛋白在猪体内的抗病毒活性,用IFN-α刺激PK-15细胞24 h,收集细胞提取RNA后,采用RT-PCR方法扩增猪Viperin基因,并连接至p EASY-blunt simple平末端连接测序载体,PCR鉴定后送公司测序正确。采用DNAStar分析猪Viperin蛋白的免疫原性和疏水性,选取抗原性较好的一段基因,采用PCR扩增后,插入pET-28a+大肠杆菌表达载体,在37℃条件下用IPTG诱导含有重组质粒的大肠杆菌BL21,SDS-PAGE分析证明,Viperin重组蛋白以包涵体的形式表达,包涵体蛋白经过纯化后得到目的蛋白,将纯化蛋白与弗式佐剂进行乳化后颈背部皮下注射9日龄的BALB/c小鼠,14 d后加强免疫一次,收集小鼠血清。采用Western Blot、IFA鉴定制备多克隆抗体的特异性,该多克隆抗体可以和阳性sViperin真核表达载体pCI-sVIP等表达的猪源Viperin蛋白进行特异性反应。试验成功克隆了猪Viperin基因,并制备了良好Viperin蛋白的多克隆抗体。 相似文献