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1.
通过RT-PCR技术从欧鳗(Anguilla anguilla)脾脏总RNA中获得了编码成熟免疫球蛋白(Ig)重链的基因序列(GenBank accession No.GQ249838),该序列长1 686 bp,编码562个氨基酸残基,分子质量为62.2 ku.将该基因片段与pET-his载体连接构建原核表达载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达,其表达产物经SDS-PAGE和Western-blotting分析表明新增的66 ku蛋白条带与预期值相符,且能够与兔抗欧鳗IgM血清发生强烈的特异性反应,证实了欧鳗免疫球蛋白重链(IgH)基因能够在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达;利用荧光定量PCR检测了Ig基因在欧鳗背肌注射山羊IgG前后不同组织的表达水平,结果显示欧鳗在免疫前后其肾脏与脾脏Ig基因的表达量均明显高于其它组织,在鳃、肌肉中的表达量也较高,而在肝脏、心脏中的表达量较低.此外,对同一组织免疫前后的Ig基因表达量比较发现,除肝脏外,其它组织Ig基因表达水平在免疫后均上升,在鳃和肌肉中达到显著水平,而在脾脏中达到极湿著水平. 相似文献
2.
欧洲鳗鲡免疫球蛋白阳性细胞的组织化学定位与分布特点 总被引：4，自引：3，他引：1
采用蛋白A亲和层析法分离纯化欧洲鳗鲡(Anguilla anguila,欧鳗)血清免疫球蛋白(Ig),制备其特异性兔抗血清,并运用免疫组织化学技术研究了嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染的试验组鳗鲡和未经感染的对照组鳗鲡脾脏、肾脏和肝脏Ig阳性(Ig )细胞定位与分布特点.结果表明:纯化后的Ig经SDS-PAGE检测含有分子质量约68 ku重链和26 ku轻链的2条清晰蛋白条带,由其制备的兔抗Ig血清效价达1:51 200.对照组欧鳗脾脏Ig 细胞数较少,肾脏相对较多,肝脏未发现.试验组欧鳗脾脏Ig 细胞数量明显比对照组增多,肾脏中有所增多但不明显,肝脏中未发现.在试验组和对照组中,黑色素巨噬细胞在脾脏和肾脏中均见明显聚集并与淋巴细胞形成黑色素巨噬细胞中心(melano-macrophage centres,MMCs),其中脾脏MMCs多数位于血管附近,脾脏Ig 细胞均主要分布在MMCs及其周边,且在试验组中数量多而密集,而肾脏Ig 细胞在对照组中明显分布于MMCs及其周边,但在试验组不明显.与对照组相比,试验组中脾脏和肾脏黑色素巨噬细胞数量和体积均有明显增多.试验结果说明欧鳗肾脏和脾脏是具有Ig 细胞的重要免疫器官,其中黑色素巨噬细胞数量和体积变化与免疫应答过程密切相关. 相似文献
3.
通过RT-PCR技术克隆欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)Ig轻链基因cDNA全长序列,命名为AaIgL,其全长为1 016bp,开放阅读框为714bp,编码238个氨基酸。将该基因片段与pET-his载体连接构建原核表达载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达,其表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析,结果表明新增的27ku蛋白条带与预期值相符,且与兔抗欧洲鳗鲡IgM血清发生特异性显色反应,证实了AaIgL基因能够在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达;实时荧光定量PCR检测结果发现:AaIgL在欧洲鳗鲡各组织中均有表达,其中脾脏的表达量最高,肾脏和心脏中也有较高的表达水平,而肝脏、肌肉、鳃以及肠中的表达量较低;欧洲鳗鲡经山羊IgG肌肉注射后脾脏和肾脏的AaIgL表达水平明显上升,其峰值分别为第7天和第14天,AaIgL在脾脏的表达量显著高于肾脏,但是第21天后均恢复至正常水平。以上结果表明,AaIgL在欧洲鳗鲡机体免疫防御中发挥重要作用,脾脏是AaIgL基因的主要表达器官。 相似文献
4.
纯化双峰驼血清IgG并制备兔抗骆驼IgG抗血清,为制备针对特定蛋白的特异性纳米抗体储备材料,利用Protein G纯化双峰驼血清IgG,并用纯化的IgG免疫成年家兔后采用ELISA方法检测抗血清效价;采用间接ELISA方法,利用制备的抗血清检测PCV2 Cap蛋白免疫双峰驼血清中抗Cap蛋白的抗体水平,Western blot技术检测制备的抗血清与从噬菌体纳米抗体库中筛选到的针对不同蛋白的纳米抗体的反应性,以确定抗血清的适用性。结果显示,从双峰驼血清中纯化到骆驼IgG,SDS-PAGE分析显示纯化的骆驼IgG包括3条链,约50ku的传统重链IgG1,约43ku缺失CH1的重链IgG3和约30ku的传统轻链;3次免疫后兔抗骆驼IgG抗血清效价达1∶512 000;应用制备的抗血清检测PCV2 Cap蛋白免疫5次的双峰驼血清中抗Cap蛋白的抗体效价达1∶1 024 000;制备的抗血清可以与原核表达的针对不同病毒蛋白的纳米抗体反应;说明制备的兔抗骆驼IgG抗血清可用于免疫骆驼血清和表达的纳米抗体的检测。研究结果为目标蛋白免疫骆驼后抗体效价检测及纳米抗体文库构建提供关键材料。 相似文献
5.
采用饱和硫酸铵法对斑点叉尾鮰IgM进行粗提,用亲硫树脂对IgM进行纯化,将纯化的IgM免疫家兔,并用ELISA检测兔抗斑点叉尾鮰IgM抗体效价;制备重组C5a肽酶(pSCPI),分别用1、2和3 μg/g的抗原免疫斑点叉尾鮰,以PBS作为对照;测定了第21、28、35、42和49天斑点叉尾鮰产生的特异性抗体的水平,并于免疫后第4周用海豚链球菌DGX07株进行攻毒。结果显示:通过亲硫树脂亲和层析后得到了较纯的IgM重链和轻链,分别约70 ku和27 ku,浓度达到6.4 mg/mL,免疫家兔后的兔抗斑点叉尾鮰IgM抗体效价达1∶51200;重组蛋白pSCPI免疫斑点叉尾鮰后第3周抗体水平开始增加,第4周达到峰值,第5周后开始下降,且3 μg/g浓度组第4周抗体水平最高,但与2 μg/g浓度组第4周抗体水平差异不显著;攻毒实验显示,3个组14 d平均累计死亡率分别为 47.5%、45%和47.5%,平均相对保护率分别为40.63%、43.75%和40.63%,且死亡鱼体内分离到唯一海豚链球菌。以上结果表明重组pSCPI蛋白具有较好的免疫保护作用,能够作为海豚链球菌亚单位疫苗的候选之一。 相似文献
6.
采用饱和硫酸铵法对斑点叉尾(鱼回)IgM进行粗提,用亲硫树脂对IgM进行纯化,将纯化的IgM免疫家兔,并用ELISA检测兔抗斑点叉尾(鱼回)IgM抗体效价;制备重组C5a肽酶(pSCPI),分别用1、2和3μg/g的抗原免疫斑点叉尾(鱼回),以PBS作为对照;测定了第21、28、35、42和49天斑点叉尾(鱼回)产生的特异性抗体的水平,并于免疫后第4周用海豚链球菌DGX07株进行攻毒.结果显示:通过亲硫树脂亲和层析后得到了较纯的IgM重链和轻链,分别约70 ku和27 ku,浓度达到6.4 mg/mL,免疫家兔后的兔抗斑点叉尾(鱼回)IgM抗体效价达1∶51200;重组蛋白pSCPI免疫斑点叉尾(鱼回)后第3周抗体水平开始增加,第4周达到峰值,第5周后开始下降,且3 μg/g浓度组第4周抗体水平最高,但与2 μg/g浓度组第4周抗体水平差异不显著;攻毒实验显示,3个组14 d平均累计死亡率分别为47.5％、45％和47.5％,平均相对保护率分别为40.63％、43.75％和40.63％,且死亡鱼体内分离到唯一海豚链球菌.以上结果表明重组pSCPI蛋白具有较好的免疫保护作用,能够作为海豚链球菌亚单位疫苗的候选之一. 相似文献
7.
采用Protein A亲和层析法对鲫Carassius auratus血清中的IgM进行快速分离纯化,所得产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western blotting）进行分析检测。结果表明：采用Protein A亲和层析法可以很好地分离到高纯度的鲫血清IgM,电泳条带中重链和轻链清晰可辨,重链、轻链的相对分子质量分别为85 000、25 000左右,无明显杂带;利用纯化的鲫血清IgM免疫小鼠,获得了高效价抗IgM抗血清,可以特异性识别鲫血清和黏液中IgM重链。应用间接ELISA方法对浸泡免疫后的鲫血清和皮肤黏液中抗体的动态进行检测,结果显示：鲫皮肤黏液中的抗体滴度在免疫后第6天达到峰值,血清中抗体滴度在免疫后第15天达到峰值,前者高峰期出现较早,但持续时间短,后者高峰期出现较晚,但持续时间较长。本试验中所建立的Protien A亲和层析法为鱼类抗体制备、病原检测及免疫学相关研究提供了一种便捷的方法。 相似文献
8.
《上海海洋大学学报》2015,(3)
采用饱和硫酸铵法对斑点叉尾IgM进行粗提,用亲硫树脂对IgM进行纯化,将纯化的IgM免疫家兔,并用ELISA检测兔抗斑点叉尾IgM抗体效价;制备重组C5a肽酶(pSCPI),分别用1、2和3μg/g的抗原免疫斑点叉尾,以PBS作为对照;测定了第21、28、35、42和49天斑点叉尾产生的特异性抗体的水平,并于免疫后第4周用海豚链球菌DGX07株进行攻毒。结果显示:通过亲硫树脂亲和层析后得到了较纯的IgM重链和轻链,分别约70ku和27ku,浓度达到6.4mg/mL,免疫家兔后的兔抗斑点叉尾IgM抗体效价达1∶51200;重组蛋白pSCPI免疫斑点叉尾后第3周抗体水平开始增加,第4周达到峰值,第5周后开始下降,且3μg/g浓度组第4周抗体水平最高,但与2μg/g浓度组第4周抗体水平差异不显著;攻毒实验显示,3个组14d平均累计死亡率分别为47.5%、45%和47.5%,平均相对保护率分别为40.63%、43.75%和40.63%,且死亡鱼体内分离到唯一海豚链球菌。以上结果表明重组pSCPI蛋白具有较好的免疫保护作用,能够作为海豚链球菌亚单位疫苗的候选之一。 相似文献
9.
《西南农业学报》2015,(6)
研究猪瘟兔化弱毒苗在免疫猪体内的动态分布,在注射猪瘟兔化弱毒苗后第1、7、14、21、28、35、63天采集免疫猪的脾、肾、肺、腹股沟淋巴结、扁桃体及血清,应用免疫组化、RT-PCR、猪瘟抗原、抗体检测试剂盒等方法,检测分析猪瘟病毒在猪体内的动态分布、存留时间及抗体水平。结果表明:应用免疫组化方法于免疫后第7~14天在脾脏、第7~21天在腹股沟淋巴结、第14~28天在肾脏组织分别检测到猪瘟病毒。在免疫后第7天检测到猪瘟病毒抗体,随后抗体水平持续上升至免疫后第63天;病毒抗原的分布与RT-PCR检测结果吻合。结论:猪瘟兔化弱毒苗在猪体内主要分布器官为脾、肾和腹股沟淋巴结,免疫后第7天脾和腹股沟淋巴结最早检测到猪瘟病毒,猪瘟病毒在肾停留时间可至免疫后第28天。实验过程中未在扁桃体、肺、外周血检测到猪瘟病毒。 相似文献
10.
优化了免疫磁珠分离法纯化抗血清的实验条件,并与A蛋白亲和层析法比较纯化效果,以求得到一种简便、快速、高效的纯化IgG方法.结果表明：从5只新西兰兔获得210 mL试管凝集效价高达1∶5 120的兔抗鳗弧菌抗血清,磁珠与IgG结合10 min达到平衡,其最大结合量为0.227 mg/mL;免疫磁珠分离法与A蛋白亲和层析法得到的IgG纯度都很高,经过SDS-PAGE电泳都只得到25 ku和55 ku左右的两条带;免疫磁珠分离法得到的抗体ELISA效价高于A蛋白亲和层析法;免疫磁珠分离法反应所需时间（10 min）小于A蛋白亲和层析法所需的20 min,其得率（11.5 mg/mL）也高于A蛋白亲和层析法的10.25 mg/mL. 相似文献
11.
本研究采用了病毒接种技术、普通病理学方法、酶联免疫吸附试验等方法,研究了不同日龄SPF雏鸡人工感染AEV-NH937株后的血清IgM、IgG的动态变化规律。实验结果显示IgM在攻毒后第3天达到峰值(0.57mg/m l),说明已有一部分B淋巴细胞分化为浆细胞并产生IgM;IgG从第10天开始呈上升趋势,在第20天达到峰值(5.05mg/m l);感染鸡外周血清中先出现IgM,后出现IgG,说明IgM为初级反应最早出现的免疫球蛋白,在感染早期起着先锋免疫作用。当IgG出现后,IgM的合成即受到抑制。抗AEV的血清IgM和IgG在时间上和强度上出现双峰现象。 相似文献
12.
采用蛋白 A 亲和层析法对健康美洲黑石斑鱼血清中的免疫球蛋白(IgM)进行分离纯化。实验结果表明,蛋白 A亲和层析法一步纯化即可得到电泳纯IgM,其重链和轻链的分子量约 74.1 ku和26.0 ku。用纯化的黑石斑鱼IgM免疫实验兔,获得效价高达1∶128 000的兔抗黑石斑鱼IgM血清。Western-blot和间接ELISA 检测证明,本工作制备的兔抗美洲黑石斑鱼IgM血清具有较高的特异性,为后续的黑石斑鱼免疫学研究奠定了基础。 相似文献
13.
《新疆农业大学学报》2019,(1)
为分析牛乳源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)EsxB蛋白的免疫特性,扩增EsxB基因并构建了pET-28a-EsxB重组质粒,转化后的重组菌经诱导表达后用SDS-PAGE和Western blotting检测重组蛋白;以纯化的EsxB蛋白免疫小鼠,检测其抗体水平、滴度及亚型、测定攻击保护率和观察小鼠肺、肾病理组织学变化。结果显示,成功纯化了EsxB蛋白,且该蛋白具有良好的抗体反应特性。免疫小鼠的血清抗体水平与对照组相比显著升高;抗体滴度可达1∶24 300,抗体亚型以IgG1和IgG2b为主,免疫小鼠的攻击保护率可达75%;且免疫后降低了S.aureus攻击对小鼠肺脏及肾脏的病理损伤。重组EsxB蛋白具有良好的免疫原性和保护效果。 相似文献
14.
吴斌 《福建农林大学学报(自然科学版)》2017,46(2)
制备了"新吉富"罗非鱼血清免疫球蛋白IgM单克隆抗体(McAb)并进行了特性分析,以血清IgM McAb为基础,建立了IgM捕获ELISA检测方法.采用亲和层析法纯化健康"新吉富"罗非鱼IgM,纯化蛋白经SDS-PAGE检测,重链、轻链的相对分子质量分别为75~78、23~25 ku;以纯化的IgM为抗原制备IgM McAb,制备McAb杂交瘤细胞株系3株,分别命名为2H5、2D4、2B11,抗体亚型均为IgM,小鼠腹水效价分别为1.0×10~(-5)、1.0×10~(-4)、1.0×10~(-5),对IgM敏感度测定表明,2H5、2D4、2B11检测灵敏度分别为31.25、125.00、62.50 ng.以抗罗非鱼IgM McAb包被酶标板,建立IgM捕获ELISA检测方法.以无乳链球菌灭活疫苗免疫罗非鱼,受免血清按建立的IgM捕获ELISA方法检测特异性抗体,结果表明,建立的IgM捕获ELISA检测方法可应用于免疫应答抗体水平分析. 相似文献
15.
为进一步研究肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition proteins,PGRPs)在先天性免疫应答中的生物学功能,在前期克隆黄颡鱼长型肽聚糖识别蛋白(pfPGRP-L)c DNA全长的基础上,根据pfPGRP-L基因中高亲水性区域序列设计特异性引物扩增出编码序列,将该基因片段克隆到p GEX-4T-1质粒,构建重组表达载体。SDS-PAGE电泳检测该目的蛋白大小约为51 ku,与理论值大小符合,回收蛋白并纯化,与弗氏佐剂等量混合后注射新西兰大白兔制备多克隆抗体,用ELISA和Western blotting分别检测该抗体,结果显示:抗体效价可达1∶256 000,且有特异性条带,表明pfPGRP-L的多克隆抗体制备成功。此外,Western blotting检测黄颡鱼不同组织pfPGRP-L蛋白的表达,发现在鳃、胸腺、肝脏、肾脏、头肾、脾脏、血液和肠道等不同组织中都有目的条带,而在脾脏和肠道中表达更强。为pfPGRP-L的抗菌作用和功能研究奠定基础。 相似文献
16.
17.
实验性免疫应激雏鸡免疫器官抗体生成细胞的动态变化研究 总被引：4，自引：0，他引：4
本试验用新城疫I系苗肌肉注射 2周龄健康雏鸡 ,剂量是 2头份 /只 ,复制免疫应激模型。通过对免疫应激后第 1、 3、 5、 1 0、 1 5、 2 0d的法氏囊、胸腺、脾脏和盲肠扁桃体各器官组织病理学、活性B淋巴细胞和IgG、IgM抗体生成细胞的动态变化研究 ,结果发现 :(a)与对照组相比 ,各器官中浆细胞、巨噬细胞 (MΦ)、淋巴细胞数量增多 ,而且脾脏、盲肠扁桃体中的淋巴小结数增多。 (b)各免疫器官中活性B淋巴细胞在第 5天开始显著增多 ,并且在第 1 0天达到高峰 (P <0 0 1 )。 (c)各免疫器官中IgG抗体生成细胞在应激第 1 5天达到高峰 ,呈持续增长趋势 ;IgM抗体生成细胞法氏囊在第 5天 ,脾脏和盲肠、扁桃体在第 1 0天达到高峰 ,以后缓慢下降 ,且仍显著高于对照组(P <0 0 1 )。这表明在本试验的免疫应激条件下体液免疫功能未被抑制。 相似文献
18.
[目的]探讨犬血清IgG的纯化方法。[方法]采用硫酸铵盐析法结合SephadexG-200凝胶柱层析提取纯化犬血清IgG,利用SDS-PAGE电泳和免疫印迹法鉴定所得产品的纯度和免疫活性。[结果]获得的纯化犬血清IgG的SDS-PAGE图谱中存在2条蛋白条带,表明获得了高纯度的犬血清IgG;重链分子量为58kD,轻链分子量为27kD,IgG分子量为170kD。特异性检测发现犬血清IgG重链和轻链都能与鼠抗犬血清IgG抗体结合,表明纯化犬血清IgG具有免疫原性和反应原性。[结论]硫酸铵盐析法结合SephadexG-200凝胶柱层析可获得纯度高、活性好的纯化犬血清IgG,为犬血清IgG相关的免疫学试验提供了高质量的免疫材料。 相似文献
19.
构建迟钝爱德华氏菌外膜蛋白重组表达载体后,表达纯化获得分子质量约53ku的外膜蛋白。将100尾日本鳗鲡均分为2组,分别腹腔注射牛血清白蛋白(BSA,0.5mg/mL)和迟钝爱德华氏菌外膜蛋白(Omp,0.5mg/mL)0.2mL/尾。于免疫后第7、14和28天采集鳗鲡血液、粘液、肝脏和肾脏,测定各时间点的补体活性、溶菌酶活性、全血细胞转化水平和血清抗体效价。结果发现,外膜蛋白组鳗鲡的补体活性于免疫后第7天极显著高于对照组;其抗体效价于第14天和第28天显著或极显著高于对照组。免疫后第28天以迟钝爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和创伤弧菌(1.0×107 cfu)腹腔注射感染鳗鲡。结果发现,外膜蛋白组鳗鲡对迟钝爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和创伤弧菌的相对免疫保护率分别为71.4%、50.0%和12.5%。表明鳗鲡注射迟钝爱德华氏菌基因工程表达外膜后显著提高了其对迟钝爱德华氏菌感染的抵抗力,对嗜水气单胞菌的感染也有明显的交叉保护效果,但对创伤弧菌的交叉保护效果较弱。 相似文献
20.
为了探明鱼类恒定链类似蛋白(Iclp)能否作为免疫载体,提高基因疫苗的免疫效果,以拟态弧菌OmpU蛋白的黏附功能域(OmpU_(AP))为疫苗靶点,构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-OmpU_(AP)和基于草鱼Iclp的pcDNA3.1-Iclp-OmpU_(AP)。用2种真核表达重组质粒分别免疫草金鱼,同时设置空质粒pcDNA3.1(+)对照组与PBS对照组。于免疫后不同时间(7、14、21、28和35 d)采用PCR和RT-PCR方法检测重组质粒在鱼体不同组织中的分布与转录水平的表达情况,使用双抗体夹心ELISA检测血清抗体水平,并于免疫后第35天进行攻毒保护性实验,检测其免疫保护率。结果显示,免疫后第7天在肌肉、鳃、头肾、肝脏和脾脏中均有重组质粒分布,并在35 d内持续表达。pcDNA-OmpU_(AP)免疫组草金鱼的血清抗体水平缓慢上升,除第21天外,其余检测时间点的抗体水平与空质粒对照组无显著差异。pcDNA3.1-Iclp-OmpU_(AP)免疫组草金鱼在免疫后7 d即有血清抗体产生,随着免疫时间延长,抗体水平不断上升,至28 d达到峰值,随后抗体水平开始下降;除第7天外,其余各检测时间点的血清抗体水平均显著或极显著高于pcDNA3.1-OmpU_(AP)免疫组与空质粒对照组。攻毒后pcDNA3.1-Iclp-OmpU_(AP)和pcDNA-OmpU_(AP)免疫组草金鱼的相对免疫保护率为别为46.7%和20%,而空质粒对照组和PBS对照组的实验鱼全部发生死亡。表明Iclp可以作为免疫载体,提高鱼类基因疫苗的免疫效果。 相似文献