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1.
为了原核表达鸭疫里默氏菌噬菌体RAP44的裂解酶基因,以噬菌体RAP44的基因组为模板,用PCR方法扩增裂解酶基因,与表达载体p GEX-6P-1连接,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中表达,利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和柱纯化表达蛋白。结果成功构建了表达载体p GEX-N,转化菌经IPTG诱导后成功表达出了分子量约为37 k D的可溶性重组蛋白。本研究获得了纯化的鸭疫里默氏菌噬菌体裂解酶重组蛋白,为裂解酶的功能研究奠定了基础。 相似文献
2.
为构建拟南芥抗病相关T1N6_22基因的原核表达载体并进行高效表达,获得纯化的T1N6_22蛋白,以拟南芥Col-0的c DNA为模板,扩增获得了T1N6_22基因CDS,对其进行克隆、测序后与含有GST标签蛋白的p GEX4T-1载体相连,构建T1N6_22的原核表达载体p GEX4T-1-T1N6_22-GST。经酶切和测序鉴定正确后,将构建好的载体及空载体转化大肠杆菌BL21。结果表明,在大肠杆菌BL21菌株中成功表达了与标签蛋白融合的T1N6_22蛋白,大小约57 k Da。SDS-PAGE分析表明,高效表达的诱导条件为0.1 mmol/L IPTG诱导培养3 h。研究结果为进一步T1N6_22互作蛋白的筛选及其调控拟南芥抗病分子机制的研究奠定了基础。 相似文献
3.
羽衣甘蓝泛素结合酶ubc7基因分离、原核表达及纯化 总被引：1，自引：1，他引：0
为分离羽衣甘蓝(Brassica oleracea var. acephala)自交不亲和系(S13-bS13-b)泛素结合酶7(ubc7)基因,探讨Ubc7重组蛋白的原核表达及纯化。利用CTAB的方法提取羽衣甘蓝柱头总RNA,通过RT-PCR的方法分离ubc7基因,将编码ubc7基因的cDNA序列亚克隆到pET-14b原核表达载体中,将阳性重组表达质粒转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)pLysS中,利用IPTG进行诱导表达,并通过Ni2+-NTA树脂进行亲和层析的方法纯化重组蛋白。结果表明,获得的Boubc7含有一个长度为501 bp的开放读码框,编码一个含有166个氨基酸残基的蛋白质。预测BoUbc7的相对分子质量约为18.7 kDa,理论等电点(pI)为5.35。利用IPTG诱导的细菌蛋白中,SDS-PAGE显示出在分子量大小23 kDa处有蛋白特异性的表达,这与预测的His6融合的BoUbc7蛋白分子量相符;利用Ni2+-NTA树脂进行亲和层析纯化后,成功获得了BoUbc7融合蛋白。该试验分离了羽衣甘蓝ubc7基因,并通过原核表达系统获得了BoUbc7重组蛋白,为进一步分析其生物学功能奠定了基础。 相似文献
4.
重组人早孕因子的表达与纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
早孕因子(EPF)是具有免疫抑制和生长调节活性的妊娠相关蛋白,为目前最早确认妊娠的生化指标之一。为获得人早孕因子重组蛋白,利用PCR技术扩增人早孕因子基因,克隆入原核表达载体pGEX-6p-1,与GST基因相融合,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌表达菌株BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,以SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白的表达,利用GST树脂纯化表达蛋白。结果成功构建重组表达质粒pGEX6P-EPF,在大肠杆菌中诱导表达了GST- EPF融合蛋白,表达蛋白分子量为37.3kDa,并能被抗GST单克隆抗体特异识别,GST亲和层析纯化,制备了EPF重组蛋白。 相似文献
5.
为构建灰葡萄孢犬尿氨酸单加氧酶(Bc KMO)基因的原核表达载体并进行高效表达,获得纯化的Bc KMO蛋白。以灰葡萄孢野生型BC22为试材,通过反转录PCR扩增Bc KMO基因,回收Bc KMO基因片段克隆到p MD19-T载体中,测序正确后,酶切p MD19-T-Bc KMO和带有GST标签蛋白的p GEX4T-1质粒,将目的片段进行连接,构建Bc KMO基因的原核表达载体p GEX4T-1-Bc KMO-GST。经酶切和测序鉴定正确后,将构建好的原核载体转化大肠杆菌BL21。经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21菌株中成功表达了与GST标签蛋白融合的Bc KMO蛋白,大小约71 k Da。SDS-PAGE分析表明,该蛋白在0.2 mmol/L IPTG诱导12 h时高效表达;Western Blot结果发现目的蛋白能与GST特异性抗体起特异性反应,表明Bc KMO基因的体外诱导表达成功。 相似文献
6.
《华北农学报》2018,(6)
为探讨玉米AGPL2在籽粒发育时期淀粉积累过程中的功能机制,通过AGPL2基因克隆和构建带有GST标签的原核表达载体PGEX-6 T-1-AGPL2,并利用大肠杆菌诱导表达体系,用0. 5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在28℃条件下诱导表达6 h后,GST-AGPL2融合蛋白能够得到高水平表达,然后利用GST(Glutathione S-transferase)标签蛋白纯化介质进行亲和层析纯化,能够得到质量较高的GST-AGPL2融合蛋白;利用纯化所得的GST-AGPL2重组蛋白免疫新西兰大白兔制备了AGPL2多克隆抗体,分离并纯化抗血清,然后用rTEV Protease去除抗原GST-AGPL2融合蛋白的GST标签,并用纯化后的AGPL2多克隆抗体进行Western Blot检测,结果发现,AGPL2多克隆抗体具有较高特异性和灵敏性,可用于检测纳克级抗原蛋白;并利用Western Blot方法研究了AGPL2蛋白在玉米不同组织和不同授粉时期胚乳中的分布和表达模式,结果显示,AGL2蛋白在玉米不同组织中的表达具有组织特异性,且在胚乳中含量最高。AGPL2蛋白在玉米胚乳不同授粉时期表达量先增加后降低,且在授粉中期达到最大值。其结果与玉米籽粒发育过程中淀粉的积累规律一致,说明AGPL2主要存在于玉米胚乳中,且可能参与淀粉的合成,也说明AGPL2多克隆抗体具有很好的特异性,能够识别玉米体内的AGPL2抗原。 相似文献
7.
为了对羊口疮病毒(ORFV)安徽株121基因进行原核表达及生物信息学分析。以ORFV AH-F10株为模板对121基因进行PCR扩增,将扩增产物克隆至p GEX-6P-1原核表达载体,构建重组质粒p GEX-6P-1-121,并进行测序鉴定。经鉴定正确后的重组质粒转化至E. coli Rosetta感受态细胞进行IPTG诱导表达,并对重组蛋白的诱导条件进行优化,确定了ORFV 121重组蛋白表达的最佳条件。SDS-PAGE及Western-blot鉴定结果表明,重组蛋白大小约为60 ku,在Rosetta中高效表达,主要以包涵体形式存在且具有良好的反应原性。包涵体蛋白经过纯化后得到目的蛋白,将纯化蛋白与弗氏佐剂进行乳化后皮下注射6周龄的BALB/c雌鼠。每14 d后加强免疫1次,4次后收集小鼠血清。对收集到的血清进行Western-blot特异性鉴定,该抗体血清可以和阳性原核表达的ORFV 121蛋白进行特异性反应,表明成功制备鼠源多抗血清。利用生物信息学相关软件对目的基因编码蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构域、磷酸化位点、二级结构和B细胞表位进行预测。结果显示该蛋白等电点为8. 86,属不稳定的亲水性蛋白;预测有50个可能的磷酸化位点,无信号肽和跨膜结构域;二级结构中以无规则卷曲结构居多占62. 25%,α-螺旋、β-转角、延伸链分别占27. 81%,2. 98%,6. 95%;预测该蛋白存在8个潜在B细胞优势表位。成功表达了ORFV AH-F10 121蛋白并预测其生物学特性,为该蛋白结构与功能及ORFV致病机理的深入研究奠定基础。 相似文献
8.
为了研究稻瘟病菌效应蛋白基因功能,本研究构建了稻瘟病菌效应蛋白基因BAS1和BAS4与3×FLAG标签融合的原核表达载体及其与GFP融合的瞬时表达载体。以持有BAS1和BAS4基因的稻瘟病菌株的cDNA为模板,RT-PCR扩增目的基因BAS1和BAS4编码区,选用p3×FLAG-CMV-10为模板扩增3×FLAG基因,分别将BAS1和BAS4与3×FLAG连接到原核表达载体p GEX-4T-1中,获得原核表达载体p GEX-BAS1-3×FLAG和p GEX-BAS4-3×FLAG,测序结果表明克隆到的BAS1、BAS4和3×FLAG序列及连接方向正确。将构建好的原核表达载体转化到表达感受态细胞Transetta(DE3)中得到转化子,利用IPTG诱导表达原核表达产物,SDS-PAGE电泳结果表明,目的蛋白约为40 kD,与理论值相符。为了进一步研究BAS1和BAS4的亚细胞定位,利用同源重组方法构建了pBWA(V)HS-BAS1-GLosgfph和pBWA(V)HS-BAS4-GLosgfp瞬时表达载体。本研究所构建的BAS1和BAS4与3×FLAG融合的原核表达载体及瞬时表达载体将为进一步研究BAS1和BAS4功能及定位提供一定的实验基础。 相似文献
9.
为了进一步研究MAPKK激酶的生理功能,利用RT-PCR技术扩增了DsMAPKKK的开放阅读框序列,并利用T4连接酶与质粒pGS21a连接,构建了原核表达载体pGS21a-DsMAPKKK。将该重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导成功表达了融合蛋白。经SDS-PAGE检测,融合蛋白在上清和包涵体中均存在。可溶性蛋白经过GST柱纯化,电泳分析结果表明,在68kD左右有单一的蛋白条带,说明融合蛋白得到有效纯化。蛋白印迹结果显示在68kD左右有明显的杂交条带,初步证明纯化的蛋白就是带有GST标签的MAPKK激酶。DsMAPKKK的成功表达与纯化,为深入探讨DsMAPKK激酶的性质及功能打下了坚实的基础。 相似文献
10.
为克隆、表达单核细胞增生李斯特菌sRNA分子伴侣蛋白hfq基因,并纯化重组蛋白,通过PCR的方法从单核细胞增生李斯特菌基因组DNA中扩增出hfq基因,将扩增产物克隆于pMD18-T载体中,测序验证后,再将hfq基因亚克隆至表达载体pET-32a（＋）中,成功构建pET-32a（＋）-hfq原核表达载体。然后,转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,通过IPTG进行诱导表达,对表达蛋白进行可溶性分析,并采用Ni-NTA纯化目的蛋白。结果显示：克隆的hfq基因全长234 bp,编码77个氨基酸,通过SDS-PAGE可以检测到27 kDa的蛋白特异性条带;并从上清中纯化得到了Hfq融合蛋白。为进一步研究该蛋白的生物学功能奠定了基础。 相似文献
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重组人肿瘤坏死因子TNF-α的克隆与原核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
为了构建人肿瘤坏死因子TNF-α与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合基因表达载体,并进行原核表达。以人肿瘤坏死因子TNF-α全长转录本为模板,设计特异性引物,经PCR扩增目的基因将其定向克隆到pMD-l8T simple vector中,构建重组质粒pMD-18T-TNFα。然后通过亚克隆将测序正确的TNF-α基因插入表达载体pGEX-4T-1中,筛选出阳性质粒转化宿主菌株BL21(DE3),通过温度、时间等不同条件诱导表达重组蛋白。结果表明,成功克隆到大小为702 bp的TNF-α全长cDNA序列,通过限制性酶切、PCR扩增证实pMD-18T-TNFα和pGEX-4T-1-TNFα载体已构建成功。诱导表达得到约51 kDa重组蛋白GST-TNFα。说明重组蛋白GST-TNFα的表达成功,为进一步获得纯化TNF-α,研究其生物功能、作用机理,制备抗TNF-α单克隆抗体奠定基础。 相似文献
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根据猪α1干扰素(pocine interferon-alpha1,poIFN-α1)的全基因序列(EU364896)设计合成1对特异引物,通过RT-PCR从三元杂交仔猪外周血淋巴细胞扩增出poIFN-α1全基因,将该基因克隆到pGEM-T载体,构建重组质粒pGEM-T-poIFN-α1,进行测序。以pGEM-T-poIFN-α1为模板,经PCR扩增带有酶切位点的poIFN-α1基因,将其定向克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建重组表达载体pGEX-6P-poIFNα1,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白诱导表达和鉴定,并确定蛋白最佳表达条件。序列分析表明,克隆的poIFN-α1基因全长546bp,编码181个氨基酸,前23个氨基酸组成信号肽,无糖基化位点。SDS-PAGE和Western blotting证实重组表达菌经IPTG诱导后,可表达相对分子质量约46ku的融合蛋白(GST-poIFN-α1)。当以1.0mmol/L的IPTG于37℃下诱导表达9h时,蛋白表达量最高。poIFN-α1基因的克隆与表达为进一步研究其抗病毒活性,开发病毒治疗和疫苗免疫增强用生物制剂奠定了基础。 相似文献
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克隆甘蔗谷胱甘肽硫转移酶(Glutathione S-transferase,GST)基因,并分析其序列特征和表达谱,为甘蔗抗旱育种提供基因来源。本研究采用电子克隆和RT-PCR技术从甘蔗品种‘新台糖22号’中克隆到一个甘蔗GST基因,命名为SoGST-1a。通过生物信息学软件分析其序列特征,采用实时荧光定量PCR检测其表达谱。序列分析表明该基因cDNA全长702 bp,编码224个氨基酸,预测的蛋白分子式为C1117H1750N300O328S6,蛋白分子量为24.82 kDa,等电点为5.96。蛋白疏水性分析推测其为亲水性蛋白。保守结构域预测表明SoGST-1a蛋白具有2个GST结构域。系统进化树分析表明该基因与玉米Zeta类GST蛋白亲缘关系最近。荧光定量PCR分析显示,干旱胁迫下SoGST-1a基因下调表达。研究结果表明,SoGST-1a基因可能在甘蔗干旱胁迫中并不发挥一定作用。这些结果为深入了解SoGST-1a基因的生物学功能奠定了基础。 相似文献
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摘 要：为了研究含有跨膜结构域TAT基因的重组奶牛神经肽Y融合蛋白的生物学活性。利用基因工程技术,在牛神经肽Y基因序列中插入TAT蛋白基因序列,构建原核表达载体pGEX-3X-NPY-PTD,导入到BL21宿主菌中,进行表达,对表达产物进行鉴定、表达条件优化和纯化。并且经过活性检测,融合蛋白对鸡胚血管生成的促进作用,表明含有PTD结构的重组奶牛神经肽Y具有生物功能活性,为动物试验奠定了基础。为了获得重组TAT-NPY融合蛋白,并研究其生物学活性。利用基因工程技术,从犊牛下丘脑组织中克隆得到神经肽Y基因序列,通过基因比对符合率为100%。同时,在牛神经肽Y基因序列中插入TAT蛋白基因序列,构建原核表达载体pGEX-3X-NPY-PTD,导入到BL21宿主菌中,进行原核表达,并对表达产物进行鉴定、表达条件优化和纯化。并且经过活性检测,融合蛋白对鸡胚血管生成起促进作用。表明含有PTD结构的重组奶牛神经肽Y具有生物功能活性,为下一步的研究提供了物质基础。 相似文献
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本研究对编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）非青霉素结合蛋白2a（PBP2a）的转肽酶区（TPase）原核表达并进行Western blot鉴定。首先通过PCR方法由MRSA基因组中扩增转肽酶区基因片段,并构建pGEX-6p-1-TPase重组质粒,转化BL-21,诱导目的蛋白表达,然后进行Western blot鉴定。结果表明,成功构建出pGEX-6p-1-TPase原核表达载体,并成功表达出PBP2a的转肽酶区蛋白（TPase）,为其进一步的研究和应用奠定了基础。 相似文献
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草莓轻型黄边病毒CP基因的克隆、序列分析及原核表达 总被引：2，自引：0，他引：2
克隆草莓轻型黄边病毒CP基因,并构建其原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达CP蛋白。利用SMYEV的检测引物,通过RT-PCR技术筛选带SMYEV的草莓植株;根据NCBI中SMYEV序列设计扩增CP基因全长引物,通过RT-PCR获得SMYEV沈阳分离物CP基因全长序列;将CP基因克隆到原核表达pGEX-6P-1上,利用IPTG诱导CP基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达蛋白。利用RT-PCR扩增获得SMYEV分离物SY05的CP基因全长序列,由729个核苷酸组成,编码242个氨基酸残基。SY05与其他SMYEV分离物的核苷酸同源性为80.1%～97.4%,氨基酸同源性为92.1%～99.6%,其中,与SMYEV分离物SY03的氨基酸一致性为98.3%。将SY05的CP基因成功克隆到原核表达载体pGEX-6P-1上,构建了重组表达载体p6P-EV-CP,并将其导入大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE分析表明,IPTG诱导SMYEV分离物SY05的CP基因在大肠杆菌中表达出分子量为52.0 kDa的融合蛋白。克隆出SMYEV分离物SY05的CP基因,实现了其在原核细胞中的表达,为SMYEV抗血清的制备奠定了重要基础。 相似文献
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开花期是影响玉米产量的重要因子之一。Indeterminate1 (ID1)编码玉米Indeterminate domain (IDD)家族蛋白,是玉米开花期的重要调控因子。然而,其他玉米IDD蛋白家族基因及其生物学功能有待深入研究。本文利用生物信息学技术在玉米基因组中鉴定并分离了37个IDD家族基因,记作ZmIDD。表达分析发现这些ZmIDD基因在8个玉米组织中显示出多种表达模式。为进一步探讨ZmIDD基因在调控玉米开花期上的作用,检测了37个ZmIDD在172个自交系中的遗传多样性,发现35个ZmIDD基因在自交系间具有多态性,平均每个基因具有37.8个多态性位点。关联分析鉴定到包含ID1在内的7个ZmIDD基因在多个环境下与开花期性状显著关联。对Zm00001d020683基因2 kb的启动子区和600 bp编码区重测序,共鉴定到64个多态性位点。候选基因关联分析鉴定到2个启动子区的插入缺失(In/Del)位点与开花期显著关联,其中2个位点分别插入3 bp和2 bp的单倍型为一种提早开花的基因型。研究结果为玉米开花期相关基因的分离和利用研究提供了候选基因和选择靶点。 相似文献
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将组成型表达的玉米泛素启动子与苏云金杆菌杀虫蛋白基因Bt连接，插入根瘤农杆菌双T-DNA质粒，构建一个T-DNA结构域含有抗潮霉素选择标记基因hyg，另一个T-DNA结构域含有抗虫基因的双T-DNA单子叶植物表达载体，用以转化农杆菌菌株，再通过共培养转化玉米胚性愈伤组织。通过潮霉素培养基抗性筛选，用特异PCR扩增和Southern杂交检测，从分化再生的T0代植株中，鉴定出4个转化Bt基因的阳性植株。目前，正结合进行田间分离纯合和DNA分子鉴定，培育去除选择标记基因的转基因抗虫玉米自交系。 相似文献