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为了改善甜瓜果实的品质及研究甜瓜蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因的生物学功能,本试验分别构建了甜瓜果实SPS基因的正义及反义表达载体。用PCR方法将克隆到pMD18-T载体上的甜瓜SPS基因用带有KpnⅠ和XbaⅠ酶切位点的引物扩增,然后将该扩增片段克隆到pMD19-T Simple载体上,再用KpnⅠ和XbaⅠ双酶切,得到该基因编码区3.37 kb的cDNA片段,将其定向插入到植物表达载体pROK2的KpnⅠ/XbaⅠ克隆位点,构建了甜瓜果实SPS基因的正义表达载体。将已克隆到pMD18-T载体上的甜瓜SPS基因用KpnⅠ和HincⅡ双酶切,得到该基因编码区830 bp的cDNA片段,将其定向插入到植物表达载体pROK2的KpnⅠ/SmaⅠ克隆位点,构建了甜瓜果实SPS基因的反义表达载体。 相似文献
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【研究目的】对猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点进行克隆和原核表达载体的构建。【方法】参考GenBank上公布的TGEV S基因A抗原位点序列,应用Primer6.0设计一对含酶切位点的引物,用于RT-PCR扩增A抗原位点目的片段,将扩增产物连接于paesy-T克隆载体上构建克隆载体,用EcoR I和Xhol I对表达载体PET-32a（+）和重组质粒进行酶切,将酶切产物亚克隆至PET-32a（+）多克隆位点上,连接、转化至BL21(DE3),构建A位点的原核表达载体,并对阳性重组质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。【结果】所扩增的目的片段的大小为534bp,与原核表达载体连接后,经核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其它猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,说明成功地构建了TGEV S 基因A抗原位点的原核表达载体。【结论】TGEV S 基因A抗原位点原核表达载体的成功构建,填补了中国国内单独针对此位点进行研究的空白,也为TGEV诊断方法的建立提供良好的技术基础。 相似文献
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为构建番鸭源禽1型副黏病毒HN主要抗原结构域(HNd)和V基因融合表达载体,经PCR及融合PCR分别从重组质粒pMDHN和pMDP中扩增HN基因主要结构域和V基因cDNA.将HNd经KpnⅠ和BamHⅠ双酶切、V基因用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,分别定向插入真核载体pcDNA3的多克隆位点相应的酶切位点中,对2个单表达质粒pcDNAHNd和pcDNAV进行酶切和测序鉴定.利用融合PCR技术扩增出HNd-V基因,定向克隆至pcDNA3的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切酶切位点之间,转化感受态细胞后,经PCR反应初筛后,对阳性克隆进行酶切分析及测序鉴定.对单表达重组质粒进行酶切分析及测序鉴定,结果表明:HNd和V基因已被正确定向克隆至真核表达载体peDNA3,成功构建了2个基因的单表达质粒pcDNAHNd和pcDNAV;对融合重组质粒酶切分析和测序鉴定表明,HNd-V融合基因正确克隆进真核表达质粒pcDNA3中,成功构建了融合表达载体pcDNAHNd-V. 相似文献
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[目的]构建以pUC19质粒为基础可利用XcmⅠ内切酶制备的T载体。[方法]化学合成2条含有双XcmI酶切位点的互补寡聚核苷酸链,经过变性、复性后克隆入pUC19质粒的HindⅢ和BamHⅠ位点之间,通过XcmI酶切后得到一个线性化的带有3末端突出一个T碱基的T载体。[结果]经TA克隆验证,制备的pUC19-HB-T载体对PCR产物的克隆率达到95%以上。[结论]所构建的pUC19-HB-T载体可用于PCR产物的克隆、测序及后续分子生物学操作。 相似文献
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【目的】利用正负筛选策略,构建猪肌肉生长抑素（Myostatin,MSTN）基因的双筛选标记打靶载体。【方法】以猪胎儿成纤维细胞DNA为模板,PCR扩增MSTN基因同源长、短臂;采用PCR和Overlap PCR扩增打靶载体正筛选标记嘌呤霉素和绿色荧光蛋白基因及负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因。以pUC57载体为骨架载体,在其多克隆位点连接一段包括Frt序列在内的酶切位点的多克隆位点序列,在2个Frt序列之间连接正筛选标记嘌呤霉素基因和绿色荧光蛋白基因,在Frt序列两侧分别连接5.7和1.9 kb的MSTN基因同源长、短臂;在同源短臂后连接负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,将目的片段与载体定向连接克隆。用脂质体法将打靶载体转染猪肾细胞（PK15细胞）,用嘌呤霉素和丙氧鸟苷进行正负筛选,验证正负筛选标记基因的功能。【结果】成功克隆了猪MSTN基因同源长、短臂及正筛选嘌呤霉素和绿色荧光蛋白基因及负筛选单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,构建了猪MSTN基因双筛选标记打靶载体,打靶载体长14 kb。在打靶载体转染的PK15细胞中,正负筛选标记基因均有生物学活性。【结论】成功构建了猪MSTN基因双筛选标记打靶载体。 相似文献
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本文描述了一种构建与PCR产物直接连接的克隆载体的方法。以高拷贝克隆载体 pUC118为骨架载体,在 pUC118质粒Ampr 基因的Eam110 5I酶切位点上,以点突变的方式封闭Eam110 5I酶切位点。经转化大肠杆菌JM 10 9证实,该改造过的pUC118质粒,可使宿主细胞具有氨苄抗性,仍可作为氨苄选择标记的克隆载体。将一人工合成的具有两个Eam110 5I酶切位点的互补寡聚核苷酸链(两端具有BamHI接头)插入已封闭Eam110 5I酶切位点的pUC118 载体的BamHI位点,构成新的克隆载体,此质粒命名为pUC118E。该载体经Eam110 5I酶切后,可产生 3 端突出一个T碱基的T -vector,能与PCR产物直接连接。 相似文献
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[目的]克隆和表达嗜酸乳杆菌S-层蛋白基因,用其构建能承载外源抗原表位的乳酸菌细胞表面展示系统。[方法]以染色体DNA为模板克隆S-层蛋白基因SlpA,通过酶切、连接将其插入大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pW425et,构建表面展示系统pW425et-S,并对酶切位点进行分析。[结果]将pW425et-S转化入thyA基因缺陷型E.coli X13感受态细胞,SDS-PAGE、Western-blotting、全细胞ELISA检测表明,在重组菌表面表达出S-层蛋白,构建出表面展示系统,确定BstEⅡ作为融合外源保护性抗原基因的酶切位点。[结论]克隆出嗜酸乳杆菌S-层蛋白基因,成功构建表面展示系统pW425et-S,为开发乳酸菌活载体口服活菌疫苗提供了可行性操作平台。 相似文献
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基于Xcm I酶切的pUC19-T载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]构建以pUC19质粒为基础可利用Xcm I内切酶制备的T栽体。[方法]化学合成2条含有双XcmI酶切位点的互补寡聚核苷酸链,经过变性、复性后克隆入pUCl9质粒的HindIII和BamHI位点之间,通过XcmI酶切后得到一个线性化的带有3’末端突出一个T碱基的T栽体。[结果]经TA克隆验证,制备的pUC19-HB-T载体对PCR产物的克隆率达到95％以上。[结论]构建的pUC19-HB-T载体可用于PCR产物的克隆、测序及后续分子生物学操作。 相似文献
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口蹄疫病毒P1+2A基因真核表达载体的构建 总被引：4，自引：4，他引：4
通过RT-PCR方法获得了口蹄疫病毒O型,编号为OF3毒的P1+2A区的目的基因,并将其克隆到克隆载体pMD18-T上,再根据表达载体pQE-Trisystem的特性及酶切位点设计合适的表达引物.由表达引物通过PCR技术从克隆载体上扩增出带有特定酶切位点的目的片段,再对载体和目的片段进行酶切处理,处理后由T4 DNA连接酶将二者连接.通过PCR及酶切鉴定,结果证明口蹄疫病毒目的基因片段已被正确克隆到表达载体pQE-Trisystem上. 相似文献
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为提高水稻的抗病性,利用哈茨木霉(Trichoderma hazianum)P1菌株的3个胞壁降解酶基因ech42、nag70与gluc78构建了7个植物表达载体,每个基因受独立的Act1启动子调控.构建的7个载体不仅包含3个外源基因的所有组合(A,B,C,A+B,A+C,B+C,A+B+C),而且具有双元载体本身携带的HPT基因与Gus基因,为研究不同T-DNA长度、不同基因组合与不同基因排列方向对植物遗传转化效率以及外源基因在转基因植株中表达的影响提供了一套比较完整的材料.利用本实验室的农杆菌高效转化体系,将所有组合的7个载体分别转入粳稻品种石狩白毛(Oryza sativa L ssp. Japonica cv. Ishikari-shiroge)中,共获得再生植株1800余株.对部分再生植株进行了PCR检测,证明96%的植株至少携带有外源基因中的一个,80%以上的植株整合有完整的外源基因片断. 相似文献
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根据已报道的单链monellin基因序列，设计合成5段核苷酸序列，利用这些片段末端的碱基互补序列经链延伸、PCR扩增合成双链DNA，克五笔型于质粒载体pUC18的BamHI、SalI位点之间，经限制酶切分析，序列分析等方法证实获得了monellin基因的克隆，与报道的monellin基因的序列完全符合，为下一步构建高效表达质粒，并将monellin基因转入植物并获得高含量的monellin转基因植物奠定基础。 相似文献
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[目的]构建草莓Ers1基因反义植物表达载体,为探明该基因的功能以及采用生物技术方法改良草莓品种奠定基础。[方法]根据已克隆的草莓乙烯受体Ers1基因序列及表达载体pBI121上的酶切位点设计1对带限制性内切酶位点的特异性引物,以Ers1基因的测序质粒为模板,PCR扩增到草莓Ers1基因片段,克隆片段及载体经双酶切消化后,回收产物定向连接,将克隆片段反向补插入到植物表达载体pBI121的35S和gusA之间,构建成该基因的反义植物表达载体。[结果]经酶切鉴定,成功构建了草莓Ers1基因反义植物表达载体。[结论]该研究为进一步探讨Ers1基因功能及利用生物技术方法调控果实成熟衰老进程,从而改善草莓果实的贮运性能奠定基础。 相似文献
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牛干扰素-γ基因的克隆与真核表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
根据Genebank中已发表的INF-γ蛋白cDNA序列保守区设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术从Con A活化的牛外周血单核细胞中扩增到编码牛INF-γ蛋白基因,其大小为510 bp左右。将该基因克隆到pMD18-T载体中,测序结果与Genebank上发表的INF-γ基因序列进行比较,其同源性为99.8%。将该基因从重组pMD18T-IFN质粒中克隆到表达载体pcDNA3.1(+)质粒中,构建真核表达重组质粒,经酶切和PCR鉴定后表明构建的重组质粒为阳性。 相似文献
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根据已发表的IL-18蛋白cDNA序列保守区设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术从ConA活化的牛外周血单核细胞中扩增到编码牛IL-18蛋白基因,其大小为582 bp。将该基因克隆到pMD18-T载体中,经序列测定表明该基因与gengbank上发表的牛白细胞介素-18基因序列同源性为98%。将该基因从重组pMD-gIL-18质粒中亚克隆到表达载体pET-32 a（＋）质粒中,构建原核表达重组质粒,经酶切和PCR鉴定后表明构建的重组质粒为阳性。 相似文献
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水貂阿留申病毒VP2基因主要抗原表位区的原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中已发表的水貂阿留申病毒(ADV)VP2基因核苷酸序列分别设计合成两对引物,用PCR方法扩增ADV国内分离株VP2基因中主要抗原表位区的两个片段,分别将其克隆到原核表达载体pMAL-c2的多克隆位点中。经酶切、PCR扩增和测序分析证实其已正确插入到表达载体中,且阅读框是正确的,构建原核表达载体pMAL-VPa和pMAL-VPb。阳性重组质粒转化宿主菌TB1,用IPTG进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE检测和免疫印迹分析。结果表明两段蛋白均获得了表达,表达产物的分子质量分别约为63、65kD,与理论推测的分子质量一致;并在终浓度为1mmol/L的IPTG诱导下,4h时其表达量达到高峰;Western blot分析表明表达蛋白能被兔抗MBP抗体所识别,具有一定的抗原性。 相似文献