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本研究旨在获得高效特异性的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）NS3（P80）非结构蛋白的纳米抗体。用BVDV灭活疫苗免疫羊驼,测得抗体效价后分离全血中的淋巴细胞。通过噬菌体展示技术构建羊驼重链抗体可变区噬菌体展示文库。经过连续3次吸附-洗脱-扩增的生物筛淘,从中挑选出与BVDV-NS3蛋白结合的噬菌体。对经菌液PCR、琼脂糖凝胶电泳鉴定到的单域抗体（VHH）克隆进行基因测序和同源性比对。用ELISA方法验证筛选出的纳米抗体的反应原性,找到与BVDV-NS3蛋白亲和力高的纳米抗体。结果表明,获得插入率为92.8%、库容为1.84×1014 CFU/mL的噬菌体展示文库。ELISA结果和氨基酸序列分析显示,成功得到1条与BVDV-NS3蛋白具有良好反应性且与VHH同源性较高的纳米抗体序列。本研究利用大肠杆菌成功表达BVDV-NS3抗原蛋白,建立BVDV纳米抗体噬菌体展示文库,筛选到针对BVDV重要抗原蛋白相应的纳米抗体且与VHH同源性较高。试验结果为牛病毒性腹泻/黏膜病的防控、诊断、治疗及纳米抗体药物的研制提供参考。 相似文献
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本研究旨在获得高效特异性的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3(P80)非结构蛋白的纳米抗体。用BVDV灭活疫苗免疫羊驼,测得抗体效价后分离全血中的淋巴细胞。通过噬菌体展示技术构建羊驼重链抗体可变区噬菌体展示文库。经过连续3次吸附-洗脱-扩增的生物筛淘,从中挑选出与BVDV-NS3蛋白结合的噬菌体。对经菌液PCR、琼脂糖凝胶电泳鉴定到的单域抗体(VHH)克隆进行基因测序和同源性比对。用ELISA方法验证筛选出的纳米抗体的反应原性,找到与BVDV-NS3蛋白亲和力高的纳米抗体。结果表明,获得插入率为92.8%、库容为1.84×1014 CFU/mL的噬菌体展示文库。ELISA结果和氨基酸序列分析显示,成功得到1条与BVDV-NS3蛋白具有良好反应性且与VHH同源性较高的纳米抗体序列。本研究利用大肠杆菌成功表达BVDV-NS3抗原蛋白,建立BVDV纳米抗体噬菌体展示文库,筛选到针对BVDV重要抗原蛋白相应的纳米抗体且与VHH同源性较高。试验结果为牛病毒性腹泻/黏膜病的防控、诊断、治疗及纳米抗体药物的研制提供参考。 相似文献
3.
旨在获得牛病毒性腹泻病毒(BVDV)特异性纳米抗体。通过用BVDV-E0重组蛋白对羊驼进行免疫,分离血液中的淋巴细胞。利用噬菌体展示技术,构建噬菌体展示文库,经过连续3次生物淘筛获得与BVDV-E0蛋白结合的噬菌体,对所得VHH序列进行测序和基因比对。用ELISA筛选出抗BVDV-E0的高亲和力纳米抗体,并验证纳米抗体的亲和力和活性。结果成功构建了插入率为86%、库容量为1.3×1011 cfu的噬菌体表达文库,经过筛选获得5个BVDV-E0阳性单克隆,将这些基因克隆至原核表达体系,表达和纯化后获得了高纯度的BVDV-E0纳米抗体,经亲和力的鉴定获得2个不同的高亲和力的VHH基因,并且能结合人工抗原E0,还能够被竞争抗体所阻断。研究结果为用于组装检测BVDV试剂盒和研制BVDV疫苗奠定了基础。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白纳米抗体的筛选及其鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白2(Nsp2)的纳米抗体,本研究将截短表达的Nsp2重组蛋白免疫骆驼后分离骆驼外周血淋巴细胞,利用RT-PCR扩增其VHH基因,将VHH基因插入pCANTAB5E噬菌体载体,构建双峰驼重链抗体可变区文库。利用噬菌体展示技术经过3轮淘选,共筛选得到44株Nsp2特异性纳米抗体;经ELISA检测,结果显示44株Nsp2特异性纳米抗体均能与Nsp2蛋白特异性反应。本研究首次筛选到PRRSVNsp2特异性纳米抗体,为Nsp2蛋白的相关研究提供了必要的研究工具,同时为开发新型抗PRRSV药物奠定一定的基础。 相似文献
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抗牛结核分枝杆菌VHH抗体T7噬菌体库的构建与筛选 总被引：1，自引：0，他引：1
为获得抗牛结核分枝杆菌的VHH纳米抗体,本研究利用牛结核分枝杆菌Ag85B蛋白免疫双峰驼,免疫效价达到1∶8 000后采外周血分离淋巴细胞,提取RNA反转录成cDNA,利用巢式PCR方法扩增出编码单域抗体VHH的400 bp基因片段。将目的片段用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,与T7噬菌体载体臂T7Select 10-3RI Arms连接,再通过体外重新包装含目的片段的噬菌体。对建立的VHH噬菌体抗体库进行鉴定,原始文库库容为5.7×10~8 PFU,库阳性率为85.7%。通过4轮生物亲和淘选,筛选并表达出2株高特异性的VHH抗体,均对牛结核分枝杆菌Ag85B蛋白具有特异性。本研究为进一步探讨VHH抗体在牛结核病的诊断和治疗奠定了基础。 相似文献
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猪流行性腹泻病（porcine epidemic diarrhea,PED）是一种高度接触性肠道传染性疫病,主要危害1周龄以内的仔猪,仔猪感染死亡率高达100%,是目前危害世界养猪业的主要疫病之一。本研究旨在制备针对猪流行性腹泻病毒S蛋白的特异性纳米抗体并鉴定其结合活性。作者原核表达并纯化PEDV S1蛋白,将纯化后的PEDV S1重组蛋白免疫双峰驼,第4次免疫后分离其外周血淋巴细胞,提取淋巴细胞RNA,反转录得到cDNA,通过巢式PCR扩增VHH片段,并构建至pCANTAB-5E载体中,电转化至TG1感受态细胞,得到VHH噬菌体抗体展示文库;随后,对构建的噬菌体抗体展示文库进行救援和3轮富集,利用噬菌体展示技术从中筛选针对PEDV S蛋白纳米抗体,通过ELISA验证筛选的纳米抗体的特异性和结合力。通过Western blot和间接免疫荧光验证纳米抗体与PEDV的结合活性。结果显示：成功表达并纯化PEDV S1蛋白,经4次免疫后,双峰驼血清中的特异性抗体效价达到了1∶256 000。构建的噬菌体展示文库的库容量为2.1×107,阳性率85%;对噬菌体展示文库3轮的淘选富集后,最终筛选出6株氨基酸序列不同的纳米抗体,ELISA结果显示,6株纳米抗体均对PEDV S1重组蛋白具有良好的结合力与特异性。随后验证了Nb3能够与PEDV结合,表明其具有良好的活性。成功筛选到针对PEDV S1蛋白的特异性纳米抗体,所筛选纳米抗体有望用于PED的诊断和治疗,同时为PEDV的致病机制研究提供抗体材料。 相似文献
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为获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)GP5蛋白的特异性纳米抗体,并探究其对病毒复制的抑制效应。使用原核表达系统将PRRSV-GP5蛋白大量表达后经镍柱亲和层析法纯化,使用所获的重组GP5蛋白免疫羊驼,并于第0、14、28、42天时采血,检测羊驼体内抗体效价后分离全血淋巴细胞,提取细胞总RNA,反转录后使用巢式PCR扩增出重链抗体可变区(VHH)片段,并与pCANTAB-5E载体相连后转化入TG1感受态细胞,利用噬菌体展示技术构建GP5-VHH噬菌体抗体展示文库。经连续三轮特异性噬菌体的筛选与富集后,淘选出与PRRSV-GP5蛋白高结合力的纳米抗体,通过间接ELISA方法鉴定其反应原性,后将所获的纳米抗体基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,利用Lipofectamine3000转染至Marc-145细胞内,与PRRSV分别共孵育0、24、36、48、60、72 h,以探究所筛针对PRRSV-GP5蛋白的纳米抗体于胞内对病毒复制与转录产生的影响。结果表明,成功对PRR... 相似文献
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《中国畜牧兽医》2020,(6)
为构建特异性犬瘟热病毒(CDV)的纳米抗体库,获得抗CDV的VHH抗体,本试验利用CDV免疫羊驼,四免后采集外周血淋巴细胞,提取总RNA反转录为cDNA,利用巢式PCR扩增纳米抗体序列。将目的片段连接至pComb3x噬菌体展示载体,并电转至TG1宿主菌,挑取40个克隆进行菌液PCR验证,随机挑选13个阳性单克隆进行测序,计算抗体库库容量,加入辅助噬菌粒拯救获得的噬菌体展示抗体库。经过3轮淘选,富集对CDV结合力高的噬菌体。利用毕赤酵母系统表达两株结合力高的噬菌体,经Ni柱纯化后,利用ELISA进行噬菌体结合力的鉴定。结果表明,四免后羊驼血清效价达1∶25 000,达到建库要求,构建的噬菌体展示文库库容量达3.41×10~9 PFU。经过3轮淘选,特异性抗体库经稀释100倍后,ELISA检测仍为阳性,表明特异性结合CDV的噬菌体得到明显的富集。ELISA结果表明,两株纯化的纳米抗体与CDV的反应性显著高于对照组。以上结果提示,本研究成功筛选出2株特异性结合CDV的VHH抗体,为VHH抗体在犬瘟热的诊断和治疗方面的应用奠定了基础。 相似文献
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为防控牛病毒性腹泻的流行，淘选得到抗BVDV-NS5A的纳米抗体序列，并探究其结合活性。通过重组质粒pET30a-NS5A诱导表达并纯化蛋白，免疫羊驼，获得重组质粒pCANTAB 5E-VHH,构建了一个初始的抗BVDV-NS5A纳米抗体展示文库。利用3轮固相亲和筛选，对筛选后的单克隆抗体通过ELISA验证其特异性与结合力并测序、分析。构建出具有较好多样性的噬菌体展示文库，测得库容为5.3×107 CFU/mL,插入率73.9%。通过评价和分析显示，得到20株不同氨基酸序列的纳米抗体，其中7株与NS5A蛋白具有较好反应性。针对抗BVDV-NS5A蛋白淘选纳米抗体，并证明得到的纳米抗体有较好的结合力。研究结果有望用于研发BVDV诊断试剂盒、抗BVDV的候选药物，同时也为后续BVDV的致病机制研究奠定了基础。 相似文献
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为构建特异性犬瘟热病毒（CDV）的纳米抗体库,获得抗CDV的VHH抗体,本试验利用CDV免疫羊驼,四免后采集外周血淋巴细胞,提取总RNA反转录为cDNA,利用巢式PCR扩增纳米抗体序列。将目的片段连接至pComb3x噬菌体展示载体,并电转至TG1宿主菌,挑取40个克隆进行菌液PCR验证,随机挑选13个阳性单克隆进行测序,计算抗体库库容量,加入辅助噬菌粒拯救获得的噬菌体展示抗体库。经过3轮淘选,富集对CDV结合力高的噬菌体。利用毕赤酵母系统表达两株结合力高的噬菌体,经Ni柱纯化后,利用ELISA进行噬菌体结合力的鉴定。结果表明,四免后羊驼血清效价达1：25 000,达到建库要求,构建的噬菌体展示文库库容量达3.41×109 PFU。经过3轮淘选,特异性抗体库经稀释100倍后,ELISA检测仍为阳性,表明特异性结合CDV的噬菌体得到明显的富集。ELISA结果表明,两株纯化的纳米抗体与CDV的反应性显著高于对照组。以上结果提示,本研究成功筛选出2株特异性结合CDV的VHH抗体,为VHH抗体在犬瘟热的诊断和治疗方面的应用奠定了基础。 相似文献
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Dan Liu Lingxia Li Xiaoan Cao Jinyan Wu Guoyu Du Youjun Shang 《Journal of veterinary science (Suw?n-si, Korea)》2021,22(4)
BackgroundPeste des petits ruminants (PPR) is an infectious disease caused by the peste des petits ruminants virus (PPRV) that mainly produces respiratory symptoms in affected animals, resulting in great losses in the world''s agriculture industry every year. Single-domain variable heavy chain (VHH) antibody fragments, also referred to as nanobodies, have high expression yields and other advantages including ease of purification and high solubility.ObjectivesThe purpose of this study is to obtain a single-domain antibody with good reactivity and high specificity against PPRV.MethodsA VHH cDNA library was established by immunizing camels with PPRV vaccine, and the capacity and diversity of the library were examined. Four PPRV VHHs were selected, and the biological activity and antigen-binding capacity of the four VHHs were identified by western blot, indirect immunofluorescence, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) analyses. ELISA was used to identify whether the four VHHs were specific for PPRV, and VHH neutralization tests were carried out. ELISA and western blot analyses were used to identify which PPRV protein was targeted by VHH2.ResultsThe PPRV cDNA library was constructed successfully. The library capacity was greater than 2.0 × 106 cfu/mL, and the inserted fragment size was approximately 400 bp to 2000 bp. The average length of the cDNA library fragment was about 1000 bp, and the recombination rate was approximately 100%. Four single-domain antibody sequences were selected, and proteins expressed in the supernatant were obtained. The four VHHs were shown to have biological activity, close affinity to PPRV, and no cross-reaction with common sheep diseases. All four VHHs had neutralization activity, and VHH2 was specific to the PPRV M protein.ConclusionsThe results of this preliminary research of PPRV VHHs showed that four screened VHH antibodies could be useful in future applications. This study provided new materials for inclusion in PPRV research. 相似文献
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Abi-Ghanem D Waghela SD Caldwell DJ Danforth HD Berghman LR 《Veterinary immunology and immunopathology》2008,121(1-2):58-67
A single-chain antibody library against Eimeria tenella sporozoites was constructed by phage display. Antibody-displaying phage was selected in five panning rounds against cryopreserved E. tenella sporozoites. A 1000-fold increase in phage output and a 3000-fold enrichment were obtained after three rounds of panning, as the binding clones became the dominant population in the library. Ten clones were randomly selected from the last selection round, and their nucleotide sequences were aligned and compared to chicken germ-line sequences. Analysis of the light chain variable regions revealed possible donor pseudogenes which act as donors in gene conversion events, and contribute to the diversification of the V(L) immune repertoire. Possible somatic hypermutation events, a consequence of affinity maturation, were also identified. Soluble antibody was produced in a non-suppressor E. coli strain, purified by nickel affinity chromatography, and characterized by immunoblotting. In an immunofluorescence assay, this recombinant antibody showed specific binding to E. tenella sporozoites. 相似文献
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【目的】 建立抗犬细小病毒（CPV）纳米抗体（Nb）库,从中筛选出具有中和活性的Nb。【方法】 以高免比格犬脾脏组织cDNA进行重链可变区（VH）扩增,与pBSD载体连接,构建pBSD-Nb库。结合细菌展示、流式细胞仪检测,在pBSD-Nb库中筛选高亲和力的Nb,获得阳性克隆并测序。利用Primer Premier 5.0软件设计Nb基因的上、下游引物,将阳性克隆质粒中Nb基因片段进行PCR扩增。利用pET-27b表达目的蛋白,通过变性、复性手段纯化目的蛋白,用SDS-PAGE分析纯化后的蛋白。将Nb包被96孔板,采用ELISA法检测Nb对CPV的亲和力。通过病毒微量中和试验检测Nb抑制CPV感染猫肾细胞（F81）的情况。【结果】 PCR扩增结果显示,在384 bp处可见明显条带,与预期大小相符,证明pBSD-Nb库构建成功。细菌展示后,流式细胞术检测结果显示,有9株阳性峰偏移率高的Nb,分别命名为Nb1、Nb2、Nb3、Nb4、Nb5、Nb6、Nb7、Nb8和Nb9。PCR扩增9株Nb基因片段,获得384 bp的条带。SDS-PAGE结果显示,在约14 ku处有一条带,说明成功获得纯化蛋白。ELISA检测结果表明,9株Nb中有6株Nb对CPV的亲和力较强。体外病毒中和试验检测发现,1株Nb能够中和病毒,抑制F81细胞病变,中和病毒的有效浓度为0.05 mg/mL。【结论】 本研究成功建立pBSD-Nb库,筛选出6株对CPV具有高亲和力的Nb,并成功获得1株具有中和活性的Nb,为CPV治疗性抗体制剂的开发提供了新的思路。 相似文献
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利用噬菌体展示技术构建猪流感病毒噬菌体抗体库,并筛选出猪流感高特异性、高亲和力的单链抗体(scFv)。以猪流感病毒免疫BALB/c小鼠,提取脾细胞总RNA,反转录后以cDNA为模板扩增获得VH基因和VL基因,并采用重叠延伸PCR(SOE-PCR),用柔性多肽Linker接头(Gly4Ser)按VH-Linker-VL方式将VH基因和VL基因拼接成scFv基因片段。将scFv基因和pCANTAB5E载体分别双酶切(SfiⅠ/NotⅠ)后连接,转化宿主菌TG1,经过辅助噬菌体M13K07拯救,构建噬菌体单链抗体库。以猪流感病毒为抗原包被96孔酶标板,经过3轮的亲和富集筛选,用Phage-ELISA鉴定阳性重组抗体。本研究成功构建出库容约为4×106cfu/mL抗猪流感病毒的单链抗体库,并筛选出4株特异性抗猪流感病毒的scFv抗体,能够与鼠源阳性多抗进行竞争结合猪流感病毒,为抗猪流感病毒转基因猪的研究奠定基础。 相似文献