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猪流行性腹泻病毒间接ELISA抗体检测方法建立与应用 总被引：1，自引：0，他引：1
猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是目前引起我国猪急性肠炎并水样腹泻的重要病原之一,但尚无商品化病毒血清抗体检测试剂盒。本研究以纯化的PEDV为包被抗原,通过优化ELISA反应条件,建立了间接ELISA抗体检测方法,其反应条件为:抗原最佳包被浓度为3μg/mL,血清样品最佳稀释度为1∶100,包被时间为37℃作用2 h,1.5%BSA 37℃封闭3 h,二抗1∶10 000稀释,37℃作用30 min,抗体临界值为OD450nm≥0.306判为阳性,OD450nm≤0.268判为阴性,介于二者之间为可疑。该方法检测6份已知PEDV阳性血清效价为1∶3 200,检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病毒和口蹄疫病毒血清抗体均为阴性,批间和批内重复试验变异系数2.5%～8.3%,对江苏、上海、浙江、安徽地区587份猪血清样品进行检测,抗体阳性率达56.76%,证明该方法具有较好敏感性、特异性和重复性,可用于PEDV抗体检测和流行病学调查。 相似文献
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《中国畜牧兽医》2017,(11)
本研究旨在建立检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)不同毒株抗体的间接ELISA方法。试验以纯化的非结构蛋白7(nonstructural protein 7,Nsp7)作为包被抗原,通过优化ELISA反应条件建立了PEDV不同毒株抗体检测的间接ELISA方法。结果显示,其最佳反应条件为:抗原包被量为0.2μg/孔,包被条件为37℃孵育1h后4℃过夜;血清稀释度为1∶300,作用时间为2h;酶标二抗最适稀释度为1∶10 000,作用时间为1.5h;TMB显色液作用时间为15min。在优化条件下,临界值的判定标准为:样品S/P值0.1694判为阳性,S/P值0.1398判为阴性。所建立的ELISA方法特异性、重复性及敏感性均良好。用所建立的ELISA方法对40份来自于疑似猪PEDV血清样品进行检测,该方法与商品化试剂盒检测之间的符合率为95%。本研究建立的ELISA方法在临床上可用于PEDV不同毒株抗体水平的检测,也有用于PEDV早期诊断的潜质,从而为制定有效防控PEDV的措施提供一定的参考依据。 相似文献
3.
利用猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）GP5抗原表位串联表达重组蛋白作为包被抗原,建立检测PPRSV抗体的间接ELISA方法。重组蛋白最佳包被浓度为7.5 μg/mL,最佳封闭液为5%脱脂奶粉,37 ℃封闭2 h;血清最适稀释度为1∶100,37 ℃作用2 h;兔抗猪IgG/辣根酶（HRP）（1∶3000）,37 ℃作用2 h;37 ℃避光显色15 min读取D450 nm值。结果经统计学分析得出,S/P值≥0.254为阳性,S/P值≤0.212为阴性。所建立的ELISA方法检测其他5种猪常见病原阳性血清,其D450 nm值均小于0.212。利用建立的ELISA方法对临床免疫勃林格殷格翰猪繁殖与呼吸综合征活疫苗4周后的猪血清70份进行检测,其D450 nm值均大于0.85,表明本研究建立的重组GP5表位蛋白间接ELISA方法可用于临床样品的监测。 相似文献
4.
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染主要引起母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道症状,目前尚无有效的血清学检测方法评价猪群疫苗免疫或感染后抗体水平与免疫保护力之间的关系。为建立PRRSV GP5蛋白的ELISA方法,本研究选择GP5蛋白亲水区进行原核表达,以表达的重组蛋白tGP5为包被抗原建立了检测针对GP5蛋白抗体的ELISA方法,优化后反应条件为:抗原包被浓度2μg/mL,37℃包被2 h,5%脱脂乳37℃封闭2 h,待检血清稀释度1∶100,37℃作用1 h,二抗1∶20 000稀释,37℃作用45 min,37℃显色3 min,抗体临界值OD450nm≥0.22判为阳性,OD450nm<0.183判为阴性,介于两者之间为可疑。特异性和重复性试验证明,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪口蹄疫病毒血清抗体无交叉反应,批内、批间重复性较好。 相似文献
5.
建立了检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)IgA抗体的间接ELISA方法,旨在为PEDV感染检测与免疫效果评价提供技术手段。以重组PEDV结构蛋白(S1蛋白)作为包被抗原,采用方阵滴定法确定抗原包被浓度、封闭液、稀释液以及待测血清和酶标抗体的最佳工作浓度,建立了PEDV IgA抗体检测间接ELISA方法。进而检测方法的特异性、批内与批间重复性,评价建立方法与国外试剂盒的符合率,分析ELISA检测血清特异性IgA抗体水平与中和抗体的相关性。结果显示,ELISA方法的最佳抗原包被浓度为1 mg/L,封闭液和抗体稀释液为含5%犊牛血清的PBS,待检血清和酶标抗体的工作浓度分别为1∶40与1∶1 500倍稀释。结果表明,该ELISA能够特异地检测PEDV抗体,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型等病毒的抗血清无交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数低于10%,与现有试剂盒的总符合率为94.8%,血清特异性IgA抗体水平与中和抗体呈正相关(r=0.69,P<0.001)。 相似文献
6.
《中国畜牧兽医》2020,(7)
为快速准确地评价猪血清和乳汁中猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)IgA抗体水平,本研究从4株PEDV单克隆抗体中筛选得到1株可高效捕获PEDV全病毒粒子(灭活的病毒细胞培养原液)的特异性IgG单克隆抗体8A3,将其用作检测孔内的包被抗体以捕获病毒粒子制备抗原板,从而建立了用于检测母猪血清和乳汁中PEDV特异性IgA抗体的间接ELISA方法。该方法中,单克隆抗体8A3的最适包被浓度为6.0μg/mL,阴性判定临界值(D_(450 nm))为0.34,且在检测中不与常见的猪病毒阳性血清反应。与传统的免疫过氧化物酶单层检测(immuno-peroxidase monolayer assay,IPMA)相比,所建立的ELISA方法检测阳性和阴性血清的符合率分别为98.7%(152/154)和98.0%(145/148);检测初乳和乳汁样品的阳性和阴性符合率分别为100%(60/60)和95.8%(23/24);检测初乳和泌乳期样品中的IgA水平与中和效价的趋势高度相关(kappa=0.835)。本研究建立的检测PEDV IgA的间接ELISA方法灵敏度、敏感性和特异性与传统方法高度一致,可简化检测步骤,适用于大规模评价临床样本乳汁和血清中PEDV IgA抗体的快速检测。 相似文献
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猪流行性腹泻防控关键技术 《畜牧与饲料科学》2019,40(11):109-112
介绍了猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）的病原学特征,提出了针对猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）防控的有效措施及关键技术,以期为生猪养殖场在寒冷季节科学预防PED的发生和流行提供参考。 相似文献
9.
猪流行性腹泻病毒(PEDV)是引发猪群腹泻的主要病原之一，给我国生猪养殖业造成了重大的经济损失。为建立IgA-ELISA抗体检测方法，本研究采用变异PEDV真核表达的S-N融合蛋白作为包被抗原，通过系列反应条件优化，建立了PEDV的IgA-ELISA抗体检测方法。该方法的最佳反应条件为包被抗原质量浓度2 mg/L,用5%BSA于37℃封闭2 h;将待检血清1∶50稀释于37℃作用1 h,加1∶20 000稀释酶标二抗于37℃作用30 min, TMB显色10 min;以D450 nm ≥0.326判定为阳性，当D450 nm ≤0.277判定为阴性，介于两者判定为可疑。检测猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、轮状病毒(PoRV)标准阳性血清抗体均为阴性，且重复性变异系数均低于10%。通过对我国福建地区304份样品(血清179份和乳汁125份)进行检测，并与商品试剂盒进行参照对比，总符合率达到93.2%以上，表明该试剂盒检测方法具有较高的特异性、敏感性和重复性，可用... 相似文献
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为了建立猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)抗体检测的间接ELISA方法,本研究以纯化的原核表达的PEDV截短N蛋白作为包被抗原,建立了PEDV抗体检测的间接ELISA方法,将该方法命名为rnPED-ELISA。该抗原不与其他常见的7种猪病的阳性血清发生交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数均小于13%;rnPED-ELISA相对于血清中和试验(SN)试验的敏感性为93.33%,特异性为90.00%;rnPED-ELISA与TSZ全病毒抗体检测试剂盒的符合率达91.67%。采用rnPED-ELISA方法检测200份临床样品,PEDV抗体阳性检出率为69.5%。本试验建立的rnPED-ELISA方法具有良好的敏感性和特异性,可为免疫猪群抗体监测和猪流行性腹泻流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。 相似文献
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WANG Li-zhen LUO Gui-fang ZHANG Yan-ping SHEN Yong WU Yuan-xiao SHI Yan CHEN Rui-ai HE Dong-sheng 《中国畜牧兽医》2017,44(2):377-383
Porcine epidemic diarrhea (PED) is an acute, highly contagious enteric disease of pigs. Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) is the causative agent of PED. PED has caused significant economic losses to the pig industry. In this study,the purified PEDV as the coating antigen, by optimizing the ELISA reaction conditions,the indirect ELISA antibody detection method was established. The optimized reaction conditions were as follows: Antigen working concentration was 20 μg/mL; Serum sample dilution was 1:500;It was coated at 4℃ overnight; The plates were blocked by 5% calf serum incubated at 37℃ for 1 h; The secondary antibody was diluted at 1:10 000,incubated at 37℃ for 1 h. It was judged as positive when the cutoff value D450 nm≥0.289,as negative when D450 nm≤0.236,and as suspicious between 0.289 and 0.236.It could not react with the positive sear of other six viruses such as porcine respiratory and reproductive syndrome virus,porcine circovirus 2, classical swine fever virus, porcine parvovirus,pseudo rabies virus and foot-and-mouth disease virus. The variation coefficient of repeated test was less than 10%.74 pig serum samples from Jiangsu, Jiangxi, Fujian and Guangdong were detected,and the positive rate was 84%.It indicated that this method could be used for PEDV epidemiological surveys and diagnosis in the future. 相似文献
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Porcine epidemic diarrhea (PED) caused by porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) is a contagious acute gastrointestinal infection, which has brought great economic losses to the pig industry in recent years.The article reviewed advances in molecular biology, methods of detection, genetic variation and vaccine development to provide references for further study in preventing porcine epidemic diarrhea. 相似文献
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猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起猪的高度接触性肠道传染病,感染PEDV的猪群主要表现为腹泻、呕吐、厌食、脱水等临床症状。PEDV可感染各个阶段的猪群,临床上PEDV主要造成7日龄以内的仔猪高发病率及高死亡率(可达100%)。PEDV的迅速传播给养猪行业造成了巨大的经济损失。本文针对PEDV的病原学、病毒编码蛋白及其生物学功能、感染细胞机制进行综述,以期为深入研究PEDV的致病机制提供参考。 相似文献
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猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是危害养猪业健康发展的重要疾病之一,具有急性、高度传染性的特征,给养猪业造成了严重的经济损失。猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）感染会破坏动物机体的消化系统,造成患病猪食欲下降、呕吐以及严重腹泻等,且药物治愈后的仔猪也会因为生长发育不良等因素严重影响生产,给养殖户带来巨大的困扰。2010年PEDV高致病变异毒株在中国暴发流行,导致PED的发病率和死亡率大幅升高,严重影响中国养猪生产。此次PED的暴发流行引起了养猪行业的密切关注,相关研究领域的学者对PEDV致病机制和PED新型疫苗进行了更加深入的研究,亚单位疫苗、病毒活载体疫苗、细菌活载体疫苗、转基因植物疫苗和核酸疫苗5种PED新型疫苗相继被开发,并取得全新的突破和进展。与传统的PED灭活苗和PED弱毒疫苗相比,PED新型基因工程疫苗具有安全性好、制备简单、免疫效果好等优点。文章着重对PEDV发病机理和5种PED新型疫苗的研究进展展开综述,从而加深对PEDV和PED新型疫苗的了解,以期为PEDV感染的预防和控制措施提供参考。 相似文献
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Porcine epidemic diarrhea (PED) is one of the important diseases that endanger the healthy development of the pig industry.It has acute and highly infectious characteristics,causing severe economic losses to the pig industry.Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) infection could destroy the animal's digestive system,cause the appetite of sick pigs to decline,vomit,and severe diarrhea.And the piglets cured by drugs will also have a serious impact on production due to factors such as poor growth and development,which will bring huge problems to the farmers.The outbreak of PEDV highly pathogenic mutant strains in China in 2010 led to a significant increase in the incidence and mortality of PED,which severely affected pig production in China.The outbreak of PED has drawn close attention from the pig industry.Scholars in related research fields have conducted more in-depth research on the pathogenic mechanism of PEDV and the new PED vaccine.Five new types of PED vaccines,including subunit vaccine,virus live vector vaccine,bacterial live vector vaccine,transgenic plant vaccine and nucleic acid vaccine,have been developed successively,and new breakthroughs and progress have been made.Compared with the traditional PED inactivated vaccine and PED attenuated vaccine,the new PED genetically engineered vaccine has the advantages of good safety,simple preparation,and good immune effect.This article focuses on the pathogenesis of PEDV and the research progress of five new PED vaccines,so as to deepen our understanding of new PEDV and PED vaccines,in order to provide references for prevention and control measures of PEDV infection. 相似文献
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猪流行性腹泻病毒检测方法研究进展 总被引：1，自引：0，他引：1
介绍了猪流行性腹泻病毒实验室检测方法的研究进展,在细胞生物学方面,主依靠病毒分离培养、病毒电镜形态检查、病毒特异性抗原及其抗体的检查等检测方法;在分子生物学方面,主依靠核酸杂交技术、RT—PCR法和实时荧光定量RT—PCR法等检测方法。介绍和比较了各种方法的优缺点和实用性,为临床兽医科技工作者提供参考。 相似文献
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WANG Zhiping ZHANG Yunjing SUN Yujie XU Xin WANG Zhiyan HUANG Baicheng TIAN Kegong 《中国畜牧兽医》2020,47(7):2248-2255
For the rapid and accurate evaluation of the IgA antibody level of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) in pig serum and milk,a specific PEDV IgG monoclonal antibody (MAb) 8A3 was screened from four strains of PEDV MAb,which could capture all virus particles (inactivated virus cell culture medium) of PEDV efficiently.In this method,the coating concentration of 6.0 μg/mL showed the optimal performance of MAb 8A3,the cut-off value (D450 nm) was settled as 0.34,it had no cross-reactivity with the positive serums of common porcine viruses.Compared with immune-peroxidase monolayer assay (IPMA),the concordance rates of established ELISA for positive and negative serum detection were 98.7% (152/154) and 98.0% (145/148),respectively.For positive and negative samples of colostrum and milk,the concordance rates of the established ELISA compared with IPMA were 100% (60/60) and 95.8% (23/24),respectively.IgA levels in colostrum and milk samples during lactation detected by established ELISA were highly correlated with trends in neutralizing titers (kappa=0.835).Collectively,the indirect ELISA in this study had high sensitivity and specificity,it was a rapid and objective method suitable for large-scale detection of PEDV IgA in clinical samples. 相似文献