雌二醇单克隆抗体制备及间接竞争ELISA检测方法的建立     

白宇  胡景炎  许永鹏  何杰  金俊杰  李培德  刘素贞 《中国畜牧兽医》2017,44(10):3100-3105

为建立敏感、特异、快速的雌二醇（estradiol,E₂）残留免疫检测方法,本研究利用雌二醇人工抗原（E₂-BSA）免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备特异性雌二醇单克隆抗体,利用高效价、高特异性单克隆抗体建立间接竞争ELISA（icELISA）方法。结果显示,试验成功筛选获得一株稳定分泌抗雌二醇抗体的杂交瘤细胞株（3H3）,抗体效价可达1∶320 000,利用3H3腹水抗体优化间接竞争icELISA反应条件,检测抗体的敏感度,IC₅₀为1.636 ng/mL,IC₂₀~IC₈₀线性范围为0.202~13.281 ng/mL。雌二醇腹水抗体与雌三醇、乙炔雌二醇的交叉反应率分别达0.31%和0.25%,而与雌酮、戊酸雌二醇、苯甲酸雌二醇、炔雌醚、己烯雌酚、壬基酚的交叉反应率均<0.1%。结果表明,利用本研究制备的单克隆抗体建立雌二醇间接竞争ELISA检测方法,可满足食品中雌二醇残留高灵敏度的检测要求。  相似文献   

抗头孢氨苄单克隆抗体的制备与初步应用     

张伟  王兴  刘金萍  徐声乐  秦海艳  刘若璇  蔡云虹  汝晓飞  侯珂  王捍东 《中国畜牧兽医》2017,44(4):1159-1167

为制备抗头孢氨苄（cephalexin,CEX）的单克隆抗体并建立鲜奶中CEX残留检测的ELISA方法,本试验采用戊二醛两步法分别将CEX与牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OVA）偶联,用合成的CEX-BSA作为免疫原免疫BALB/c雌鼠;5次免疫后,应用杂交瘤细胞融合技术建立并筛选出两株（2G4、5B3）分泌抗CEX单克隆抗体（monoclonal antibodies,McAb）的杂交瘤细胞株,将2G4细胞株注入BALB/c小鼠腹腔制备腹水,并对腹水进行纯化及鉴定。结果显示,2G4腹水效价大于1∶1.28×10⁵,其抗体亚型为IgG2b（κ）,亲和力常数K=1.51×10⁹ L/mol;交叉试验结果显示,该单克隆抗体除了与头孢拉定有52.55%的交叉反应率外,与头孢噻呋、头孢曲松、头孢噻肟、头孢噻吩、青霉素、链霉素、四环素均无明显交叉反应;建立了测定鲜奶样品中CEX的ELISA方法,线性范围为20~1 000 ng/mL,线性方程y=0.4674x-0.5359（R²=0.9909）,检测下限为19.68 ng/mL,平均回收率为91.31%,平均变异系数低于15%,低于中国及欧盟规定的头孢氨苄最高残留限量,具有一定的应用前景。  相似文献   

沙拉沙星间接竞争化学发光酶联免疫检测方法的建立     

李思  蒋蔚  程婷婷  卢春慧  辛思培  曹敬政  王权  孙卫东 《中国畜牧兽医》2021,48(5):1772-1783

为建立动物源性食品中沙拉沙星（SAR）残留的快速检测方法,本试验通过对盐酸沙拉沙星进行分子改造和偶联蛋白合成完全免疫原,免疫小鼠制备SAR单克隆抗体。通过棋盘法确定最佳包被原浓度及一抗稀释度,优化确定最佳反应条件,从而建立间接竞争化学发光酶联免疫（ic-CLEIA）检测方法,并通过灵敏度、精密度、交叉反应率、添加回收试验对该方法进行评价。紫外扫描结果显示,完全免疫原偶联成功;制备的SAR单克隆抗体效价达1：4×10⁶;包被原浓度为0.25 μg/mL,抗体稀释比为1：750 000,4 ℃包被过夜,5%脱脂乳封闭,竞争孵育1 h,酶标二抗稀释比为1：10 000,孵育1 h为ic-CLEIA最佳反应条件;建立的ic-CLEIA方法标准曲线呈线性,线性范围为0.0625~10 ng/mL,R²=0.995,灵敏度IC₅₀为1.45 ng/mL;其平均批内和批间变异系数均<10%;除与二氟沙星的交叉反应率达到98.08%以外,与其他氟喹诺酮类药物的交叉反应率均<8%,与其他非氟喹诺酮类药物均无交叉反应;SAR标准溶液的最低检测限（LOD）为0.32 ng/mL,SAR在鸡肉样品中的LOD为0.46 μg/kg;添加回收率在88.3%~106.7%范围内,其变异系数≤12.2%。结果表明,本研究建立的ic-CLEIA方法检测速度快、灵敏度高,适用于动物源性食品中SAR残留的大量检测,为SAR残留检测提供了新的方法。  相似文献   

牛奶中孕酮直接竞争ELISA检测方法的建立     

高维明  张洪友  夏成  李徐延  徐闯 《中国兽医杂志》2009,45(8)

采用直接竞争ELISA方法检测牛奶中孕酮含量.采用碳化二亚胺法,应用辣根过氧化物酶(HRP)标记11-α羟基孕酮琥珀酸酯(11α-OH-P4-HS),制备孕酮酶标抗原;酶标抗原与牛奶样品中的孕酮共同竞争结合固相包被的孕酮单克隆抗体,建立直接竞争ELISA反应体系.试验结果表明,最佳抗体包被浓度为1∶2 000,最佳酶标抗原工作浓度为1∶16 000,建立的标准曲线为y=-2.4598x+0.999(R2=0.996),牛奶中孕酮检测范围0.12～40 ng/mL,最低检测量为0.12 ng/mL,批内和批间变异系数分别为1.63%和2.49%.成功建立了可用于牛乳中孕酮快速检测的直接竞争ELISA方法.  相似文献   

鸡肌肉组织中左氧氟沙星兽药残留ELISA检测方法的研究     

蒋兴东 《中国兽药杂志》2008,42(5):5-10

用N-羟基琥珀酰亚胺法把左氧氟沙星（LVL）与牛血清白蛋白（BSA）偶联制备免疫抗原,免疫新西兰大白兔得到LVL的多克隆抗体,建立了LVL间接竞争ELISA方法。结果表明：抗LVL血清效价达1∶212以上,得到标准曲线的线性回归方程为y=-0.289 4x＋0.049 5（R2=0.987 8）,50%抑制浓度（IC50）为64 ng/mL,最低检测限（LOD）为10 ng/mL,标准曲线的线性范围为10～1 000 ng/mL。批内变异系数为3.51%～7.46%,批间变异系数为8.66%～11.89%,鸡肌肉中的LVL添加浓度在10～1 000 ng/ml范围内时,回收率为73.5%～84.36%。本试验建立的ELISA方法能够满足左氧氟沙星兽药残留检测要求。  相似文献   

氯霉素单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立     

范素菊  杨兴东  高润 《中国畜牧兽医》2018,45(9):2566-2574

本研究旨在建立检测动物源性食品中氯霉素（CAP）残留的间接竞争ELISA（ci-ELISA）方法。在CAP羟基（-OH）位点上引入活性基团羧基（-COOH）得到氯霉素半琥珀酸酯（CAP-HS）;采用混合酸酐法将CAP-HS分别与BSA和OVA偶联合成人工免疫原CAP-HS-BSA和包被抗原CAP-HS-OVA,用CAP-HS-BSA免疫BALB/c小鼠,间接ELISA和ci-ELISA筛选细胞融合备用鼠;应用杂交瘤技术制备抗CAP单克隆抗体;以CAP单克隆抗体为基础、CAP-HS-OVA为检测原建立ci-ELISA方法。结果显示,试验成功筛选获得一株稳定分泌抗CAP抗体的杂交瘤细胞株（2C4）,抗体效价为4.8×10^-5,利用2C4腹水优化得到ci-ELISA最佳试验条件：0.4 μg/mL CAP-HS-OVA 37℃包被2 h;5%猪血清37℃封闭1 h;1：6.4×10⁴ CAP单克隆抗体37℃孵育15 min;1：1 000羊抗鼠酶标二抗（GaMIgG-HRP）37℃孵育30 min;室温显色9 min。绘制的CAP残留ci-ELISA标准曲线为典型的S型,与4参数logit拟合曲线相吻合,半数抑制浓度（IC₅₀）为0.53 ng/mL。添加回收试验结果显示,阴性鱼肉、牛奶的回收率分别为93.3%~96.6%和93.7%~96.8%,批内变异系数分别为2.3%~5.0%和2.2%~4.6%,批间变异系数分别为2.7%~4.1%和2.3%~3.6%。HPLC对比试验结果显示,ci-ELISA与HPLC的测定结果无显著差异。本试验成功建立了CAP的ELISA残留检测方法,该方法具有较高的灵敏度、准确度和精密度,可满足动物源性食品中CAP残留检测要求。  相似文献   

进出口动物中新霉素ELISA检测方法的建立     

孙明君  邱芳  张金玲  郑小龙 《中国畜牧兽医》2016,43(12):3163-3169

应用碳二亚胺法合成人工抗原得到卵清蛋白偶联新霉素,通过方阵试验确定最佳抗原包被浓度与抗体稀释倍数,以新霉素质量浓度对数为横坐标、抗体抑制率为纵坐标绘制标准曲线,建立了进出口食用动物中新霉素ELISA快速检测技术,并对建立的方法进行了回收率和特异性试验。结果表明,建立的检测方法包被人工合成抗原的最适稀释度为1：200,抗体的最佳稀释度为1：2 000,半数抑制浓度（IC₅₀）为6.99 ng/mL;该方法的最低检测限达40 ng/mL,与庆大霉素、卡那霉素、链霉素、托普霉素、阿米卡星、双氢链霉素的交叉反应率均小于0.1%,平均加标回收率83.77%。标准曲线在1.5~40 ng/mL范围内是线性的,相关系数为0.987,标准曲线方程为y=-37.66x+94.592;与常规液相检测方法相比操作简单、快速。本研究建立了一种快速、高效、特异的新霉素ELISA检测方法。  相似文献   

二氟沙星残留检测的Ci-ELISA方法建立   总被引：1，自引：0，他引：1  

潘孝成  祁克宗  朱良强  赵瑞宏 《中国畜牧兽医》2007,34(10):127-129

以合成的二氟沙星（DIF）人工抗原为基础，制备出了高效价抗DIF血清（1∶29×104），并建立了DIF间接竞争酶联免疫吸附测定法(Ci-ELISA法)。标准曲线的线性回归方程为y=-0.223x+0.9631(r=0.9929)，中值（I50）=119.21 ng/ml，最低检测限（LOD）=1.14 ng/ml，线性范围为1.14~10000 ng/ml，方法的平均批内变异系数（CV）为4.83%,平均批间CV为10.69%。DIF以浓度15~10000 ng/ml在鸡肉中添加时，回收率为81.24%~90.64%，变异系数为8.18%~11.75%。  相似文献   

莱克多巴胺单克隆抗体间接竞争ELISA检测方法的建立     

高以明  吴艳涛  王寿利  张小荣  薛峰  陆承平 《畜牧与兽医》2010,42(5)

用混合酸酐法将莱克多巴胺(Rac)与匙孔蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)偶联,经紫外光谱扫描确定偶联成功,测得偶联物Rac-KLH浓度为3.6 mg/mL,Rac-BSA浓度为6.2 mg/mL。以偶联物Rac-KLH作为免疫原,免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/O-Ag-14进行融合。以Rac-BSA作为包被抗原,经间接ELISA筛选出阳性细胞株,再用有限稀释法进行多次亚克隆,获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D9、1F3、2C11、5C3、3A10、4A8、6B7、6D5、7C11、7D3。其中单克隆抗体5C3和3A10间接ELISA效价1∶500 000,对莱克多巴胺的半数阻断浓度(IC50)均为3.98 ng/mL,对盐酸克伦特罗和沙丁醇胺的IC50均大于2 000 ng/mL;对盐酸克伦特罗和沙丁醇胺的交叉反应率均小于0.2%。间接竞争ELISA检测莱克多巴胺在0.5～100 ng/mL范围内为线性分布,确定的最低检测限为0.5 ng/mL。  相似文献   

吖啶酯偶联单克隆抗体建立化学发光法检测黄曲霉毒素B1     

裘雪梅  朱立鑫  杨妮  刘云祎  刘仁荣 《畜牧与饲料科学》2020,41(6):78-83

[目的] 建立快速检测黄曲霉毒素B₁（aflatoxin B₁,AFB₁）的方法。[方法] 将吖啶酯（acridinium ester,AE）与AFB₁单克隆抗体进行体外化学合成,分别合成了吖啶酯∶AFB₁单克隆抗体摩尔比为5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1的吖啶酯标记AFB₁单克隆抗体（AFB₁-AE）,分析了不同摩尔比的检测效果,选择吖啶酯∶AFB₁单克隆抗体为25∶1的AFB₁-AE偶联物建立化学发光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay,CLIA）。[结果] 获得对应的标准曲线回归方程为：y=-0.245Ln（x）+ 1.578 1,R²=0.985 7,IC₅₀=81.48 pg/mL;对样品进行加标回收实验,加标回收率88.4%~106.0%,变异系数0.92%~2.10%。[结论] 将吖啶酯与AFB₁单克隆抗体体外交联,可建立新的化学发光免疫分析方法。  相似文献   

Preparation of Monoclonal Antibody Against Lasalocid and Deveopment of Indirect Competitive ELISA Detection Method     

YANG Xiao-kang  ZHANG Hui-yan  GU Jian-hong  YUAN Yan  BIAN Jian-chun  LIU Zong-ping  LIU Xue-zhong 《中国畜牧兽医》2017,44(10):3049-3056

To prepare monoclonal antibodies (MAb) against lasalocid (LAS) and establish an indirect competitive ELISA (Ci-ELISA) detection method,conjuaction of LAS-BSA and LAS-OVA were synthetized as the immunogen and coating antigen by using active ester method in this experiment. After 6 times of immunization,the spleen cells of mice and myeloma cells were fused. Finally,a hybridoma cell line that could stably secrete specific MAb against LAS was screened.The immunological subtype of the MAb was identified as IgG1,and its light chain was κ type.The titer of the ascites was 1:16 000, which showed no cross activity with monensin sodium, salinomycin sodium,maduramycin,cefalotin sodium and streptomycin sulfate. Ci-ELISA method was established based on the MAb against LAS with the linear equation was y=0.376x-0.2374(R²=0.9914), and the linear range was 5 to 1 000 ng/mL and the IC₅₀ was 90.22 ng/mL. The method was used to detect LAS in spiked samples and the recovery rate was 81.76% to 102.41% within the detection range,indicating that the method was successfully established with good accuracy and high sensitivity. The preparation of MAb against LAS and the establishment of Ci-ELISA method laid the foundation for the development of LAS detection kit.  相似文献   

恩诺沙星在鸡肉组织中残留的ELISA检测方法研究   总被引：2，自引：0，他引：2  

JIANG Xing-dong  陈玉飞  TU Jian  彭开松  WANG Juan  祁克宗  ZHU Liang-qiang 《畜牧与兽医》2008,40(8)

分别用N-羟基琥珀酰亚胺法和氯甲酸异丁酯法把恩诺沙星(ENR)与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)偶联制备免疫抗原和包被抗原,免疫新西兰大白兔得到ENR的多克隆抗体,建立了ENR间接竞争ELISA方法。结果表明:抗ENR血清效价达达1∶212以上,得到标准曲线的线性回归方程为Y=-0.2341X+0.1193(R2=0.9878),中值(IC50)为36 ng/mL,最低检测限(LOD)为10 ng/mL,标准曲线的线性范围为10~1000 ng/mL。批内变异系数为3.18%~7.64%,批间变异系数为9.69%~11.94%,鸡组织中的ENR的回收率为76.5%~89.42%。本试验建立的ELISA方法能够满足恩诺沙星兽药残留检测要求。  相似文献   

恩诺沙星酶联免疫吸附检测方法(ELISA)的建立及其与HPLC方法的比较研究     

刘春娥  林洪  曹立民  吕朋  刘峰 《中国动物检疫》2009,26(9):44-46

建立了恩诺沙星残留检测的酶联免疫吸附检测方法(ELISA),并对方法的准确度和灵敏度等指标进行了评价,确定方法的最低检出限(LOD)为1ng/mL,线性范围为1ng/mL-1000ng/mL。以虾肉为样本进行的加标实验表明,在5ng/mL-200ng/mL的加标浓度下,孔间变异系数为9.8%-17.4%,批间变异系数为11.9%-23.4%,添加回收率为60.07%-120.8%。对ELISA和高效液相色谱(HPLC)的检测性能进行了比较,并通过水产品、畜禽等市售食品的同步检测进行了验证,结果表明在实验范围内,二种方法之间呈现较好的相关性,R2=0.9896,这表明建立的ELISA检测方法有较高的可信度是比较高的,可以有效地反映药物的残留情况。  相似文献   

Preparation and Preliminary Application of Anti-cephalexin Monoclonal Antibody     

ZHANG Wei  WANG Xing  LIU Jin-ping  XU Sheng-le  QIN Hai-yan  LIU Ruo-xuan  CAI Yun-hong  RU Xiao-fei  HOU Ke  WANG Han-dong 《中国畜牧兽医》2017,44(4):1159-1167

The aim of the study was to prepare a monoclonal antibody (McAb) against cephalexin(CEX),and preliminarily establish an ELISA method to detect residues of CEX in milk. The CEX was conjugated to carrier bovine serum albumin (BSA) and ovalbumin (OVA) by two-step glutaraldehyde method. BALB/c mice were immunized with the prepared CEX-BSA conjugate. After five times immunization, we built and screened two strains of hybridoma cells (2G4 and 5B3) which secreted McAb against CEX by hybridoma technology.The 2G4 cell lines were injected into BALB/c mouse's abdominal cavity to produce ascites. Finally the ascites were purified and identified. The results showed that antibody titer of the McAb 2G4 was above 1∶1.28×10⁵,its antibody subtype was IgG2b(κ) and affinity constant K was 1.51×10⁹ L/mol. The cross experiment result evidenced that the cross reaction rate of cefradine was 52.55%, ceftiofur, ceftriaxone, cefotaxime, cephalothin, penicillin, streptomycin and tetracycline had no cross reaction. We established an ELISA method to detect CEX residues in milk and its linear range was 20 to 1 000 ng/mL, linear equation y=0.4674x-0.5359(R²=0.9909), its limit of detection (LOD) was 19.68 ng/mL and the average recovery rate was 91.31%, the average coefficient of variation was below 15%. The detection limit was lower than the maximum residue limit of cefalexin in China and European Union. So this detection method might have good application foreground.  相似文献   

检测牛乳中三聚氰胺的间接竞争ELISA方法的建立   总被引：1，自引：0，他引：1  

李锋  王莉  柴春彦  刘晓芳  刘国艳 《中国动物检疫》2009,26(9):47-48,53

利用戊二醛法合成的三聚氰胺—钥孔匙锥蓝蛋白(KLH)为免疫原制得三聚氰胺的多克隆抗体,并在此基础上以重氮法制备的三聚氰胺—牛血清白蛋白为包被抗原建立了检测三聚氰胺的间接竞争ELISA(ciELISA)检测方法。结果表明,理想的包被抗原质量浓度为0.8mg/L,抗三聚氰胺抗血清的稀释倍数为1:400,最适检测范围为0.03-10mg/L,最小检测量为0.01mg/L,批内与批间变异系数分别为1.952%和6.673%,回归方程为y=-0.4239-0.0933。本实验建立的三聚氰胺含量的间接竞争酶联免疫吸附试验(ci-ELISA)方法可用于牛乳样品中三聚氰胺残留的检测。  相似文献   

Establishment of ELISA Detection Method for Neomycin in Import and Export Animal     

SUN Ming-jun  QIU Fang  ZHANG Jin-ling  ZHENG Xiao-long 《中国畜牧兽医》2016,43(12):3163-3169

This experiment used carbodiimide get egg albumin synthesis of artificial antigens coupling neomycin,through square test to determine the best antigen packaged concentration and antibody dilution ratio,mass concentration logarithm of neomycin as abscissa,inhibition rate of antibody as the ordinate drawing standard curve,established ELISA fast detection techniques of neomycin in edible animal for import and export.Methods of recovery and specific test had been done in further research.Results showed that the test dilution ratio of optimum synthetic antigen was 1:200,the best dilution multiple of antibodies was 1:2 000, half inhibitory concentration(IC₅₀) was 6.99 ng/mL;The minimum detection limit of the method was 40 ng/mL,and cross reaction rate of gentamicin, kanamycin, streptomycin,tobramycin,amikacin and dihydrostreptomycin were less than 0.1%,the average of recovery rate was 83.77%.The range of standarding curve in 1.5~40 ng/mL was linear,the correlation coefficient was 0.987,the equation of standarding curve was y=-37.66x+94.592;Compared with HPLC method,the operation was simple and fast.The test results showed that the enzyme-linked immunosorbent method of detecting neomycin was rapid,efficient and specific.  相似文献   

液相色谱-串联质谱法检测猪血浆中除虫脲的方法学研究     

徐玉珍  刘希望  秦哲  李世宏  白莉霞  范丽萍  魏彦明  李剑勇  杨亚军 《中国畜牧兽医》2022,49(7):2746-2756

【目的】考察口服灭蝇蛆药除虫脲（diflubenzuron，DFB）预混剂灌服给药后，在猪体内的药代动力学特征，建立猪血浆中除虫脲浓度的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测方法。【方法】以除虫脲-¹³C₆（DFB-¹³C₆）为内标，血浆样品经甲醇沉淀蛋白，离心后取上清液减压浓缩至干，甲醇-水（1∶1）复溶后进行分析。色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18柱；流动相为甲醇-0.1%甲酸水（含5 mmol/L甲酸铵），进行梯度洗脱；流速为0.4 mL/min；柱温为35 ℃；进样量为10 μL。电喷雾离子源，正离子模式，多离子反应监测模式检测，DFB及内标的定量离子对分别为m/z 311.1→158.1和m/z 317.1→158.1。对色谱和质谱条件优化后，考察该方法的专属性、定量下限、基质效应、线性范围、准确度、精密度和样品稳定性等。【结果】所建立的方法灵敏度高，检测限为0.5 ng/mL，定量限为1 ng/mL；基质效应对样品的检测影响较小；标准溶液在1~1 000 ng/mL的浓度范围内，线性关系良好（R²≥0.998）；在定量下限1 ng/mL及低（2 ng/mL）、中（100 ng/mL）、高浓度（800 ng/mL）的添加水平下，平均准确度在97.78%~115.06%之间，批内、批间变异系数均<10%，符合方法学要求。在考察的条件下，标准溶液、空白血浆加标样品及处理后的样品，稳定性良好；但应避免样品的反复冻融。【结论】建立的LC-MS/MS检测方法简便、专属性强、灵敏度高、准确可靠，可用于猪血浆中除虫脲浓度的检测，进而应用于除虫脲预混剂在猪体内的药代动力学研究。  相似文献