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1.
为了从新转染方法与传统转染方法的比较中找出更为高效的转染方法,本研究以绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA为外源基因,分别采用核转染法、电穿孔法和脂质体法转染牛的3种常用核移植供体细胞(胎儿成纤维细胞、胎儿输卵管上皮细胞、卵丘颗粒细胞).针对不同类型的细胞,实验首先对核转染法和电穿孔法的转染参数进行了系统的摸索和优化,然后将优化后的核转染法、电穿孔法与脂质体法在可控实验条件完全一致的情况下进行了转染对比实验,分析比较了转染48 h后的绿色荧光比率和细胞存活率.结果显示,核转染法转染胎儿成纤维细胞、胎儿输卵管上皮细胞和卵丘颗粒细胞的优化程序分别是V013、T023和U023;在电穿孔法中,当电场强度为90 V/mm,脉冲时间为10 ms时,胎儿成纤维细胞和卵丘颗粒细胞的转染效率最高,胎儿输卵管上皮细胞则在电场强度为80 V/mm,脉冲时间为5 ms时获得了最佳转染效率;最后通过转染对比实验得出,核转染法在3种细胞中都获得了最高的转染效率,分别为(98.78±0.30)％、(88.43±2.10)％和(71.31±0.77)％,均显著高于电穿孔法和脂质体法;转染后的存活率则为脂质体法最高,电穿孔法最低.研究结果说明,核转染法可以成为一种结合牛体细胞克隆技术生产转基因牛更有效的转染方法. 相似文献
2.
研究了水牛胎儿成纤维细胞（buffalo fetal fibroblasts,BFF）转染外源基因后的细胞生物学特性。纯化含有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）和新霉素抗性基因的线性化载体,用脂质体法转染体外培养3代的BFF细胞,应用抗生素G418筛选2周后挑取转基因抗性细胞集落扩大培养。结果发现：经过G418筛选后细胞增殖活力下降,胰蛋白酶消化法共分离获得162个转基因水牛阳性细胞集落,转移到24孔板扩大培养后,132个（85．2％）细胞集落可以存活,转移到4孔板中后仅有52个（32．1％）细胞集落能继续生长,最终能在35mm培养皿中大量培养的只有15个（〈9．3％）。抗性细胞由梭形、成簇生长变为多角形、不规则形弥漫生长,立体感减弱,细胞生长速度减慢,活力下降。染色体核型异常率增加,10个抗性细胞集落核型正常率平均为61％,显著低于对照组86．7％（P〈0．01）。研究结果为建立和优化BFF细胞转染外源基因平台奠定了工作基础。 相似文献
3.
本研究旨在获得一种高效转染水牛细胞的方法。本研究首先以水牛胎儿成纤维细胞（BFF）为研究对象,建立、优化核转染法;随后,比较核转染法、脂质体法、电穿孔法转染BFF的效率;最后选用较优的方法,探讨转染水牛原代骨髓间充质干细胞和类胚胎干细胞的可行性。结果发现随电压的增加,核转染BFF的效率升高;核转染电压为225V,脉冲时间为10ms时,细胞EGFP阳性率为（83.1±1.4）%,转染效率显著高于脂质体法（（11.7±1.2）%）和电穿孔法（（35.5±2.0）%）。运用优化的核转染条件可以成功将外源基因导入水牛原代骨髓间充质干细胞和类胚胎干细胞,且不影响其细胞生物学特性。本研究为以多能干细胞介导的水牛转基因克隆胚胎的生产奠定了基础。 相似文献
4.
摘要：为构建重组人红细胞生成素（hEPO）真核表达载体，应用PCR及人工合成方法获得除第一内含子的hEPO基因组基因，并将其插入载体pIRES2-AcGFP1，成功构建hEPO基因和AcGFP1共表达载体phEPO-IRES-AcGFP1，然后用脂质体法使该载体转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO）及山羊成纤维细胞，于转染后48h在荧263光显微镜下观察到绿色荧光。经G418筛选，在荧光显微镜下发现成簇的绿色荧光细胞，说明重组质粒被成功导入细胞并表达AcGFP1，为鉴定hEPO转染成功与否及阳性细胞筛选提供了方便。 相似文献
5.
牛皮肤成纤维细胞的分离培养与人溶菌酶基因的转染研究 总被引：2，自引：0，他引：2
摘要：为得到转染人溶菌酶基因的核供体细胞,采用组织块贴壁法分离培养牛耳成纤维细胞,经传代纯化培养,绘制生长曲线,将纯化好的带有人溶菌酶和绿色荧光标记基因的载体用脂质体法转入第4代成纤维细胞。24 h后荧光显微镜下检测到有绿色荧光蛋白表达,经500mg/ml G418筛选2周后,G418减半继续培养2～3代 ,PCR检测到有目的条带,说明目的基因已成功导入,因此本研究中获得的转基因牛耳成纤维细胞可能作为体细胞核移植的供体细胞进行转基因克隆牛研究。 相似文献
6.
在成功地构建NDV-F基因真核表达载体pCDNA3-NDV-F的基础上,应用脂质体LipofectamineTM2000介导使其转染小鼠肥大细胞瘤细胞株（P815）,以G418加压筛选（600μg/ ml）得到稳定的克隆并扩大培养成系。应用Trizol法提取细胞RNA,经RT-PCR鉴定,转染细胞在1600bp处出现目的条带。收集转染细胞,经Western blot和免疫荧光法检测到目的蛋白的表达。进一步将获得的细胞株在液氮中冻存6个月以检测其稳定性,实验证明该细胞株仍能很好的表达F基因。本实验采用脂质体法已成功建立了能够稳定表达NDV-F基因细胞株,为进一步研究ND核酸疫苗的效果奠定良好的实验基础。 相似文献
7.
利用PCR方法扩增凋亡蛋白融合基因片段，克隆至pMD18-T载体，鉴定和测序正确的凋亡蛋白融合基因亚克隆人带有绿色荧光蛋白的真核表达载体pECFP-C1的多克隆位点EcoRⅠ和SacⅡ之间，成功地构建带有报告基因的凋亡蛋白融合基因真核重组表达载体pECFP-C1-AFG。将带有报告基因的凋亡蛋白融合基因真核表达载体应用脂质体介导使其转染中国仓鼠卵巢细胞株（CHO），于转染48h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的出现，对转染的CHO细胞，应用Trizol法提取RNA，经RT-PCR鉴定，转染细胞在750bp处出现目的条带。收集转染细胞上清，应用间接ELISA及Western blot检测到目的蛋白的表达，说明凋亡蛋白融合基因构建正确。转染凋亡蛋白融合基因重组质粒的细胞，长成单层后传代，经G418（Genetiein）加压筛选（800μg／mL），3周后在荧光显微镜下观察所有细胞均出现绿色荧光，说明已建立了能够稳定表达凋亡蛋白融合基因与报告基因pECFP-C1的细胞株，为进一步研究凋亡蛋白融合蛋白在肿瘤组织中的定位及其诱导肿瘤细胞凋亡打下了基础。 相似文献
8.
STAT3基因转染牛乳腺上皮细胞及生物学特性观察 总被引：1，自引：0，他引：1
应用PCR技术从含有人STAT3基因cDNA的质粒pOTB7中扩增STAT3基因片段。将其克隆入真核表达载体pEGFP-C1中,构建重组表达质粒。利用脂质体介导法将重组表达质粒转染原代牛乳腺上皮细胞(Bovine Mammary Epithelial cells)。G418筛选阳性克隆,RT-PCR检测STAT3基因在牛乳腺上皮细胞中的表达情况,并通过流式细胞术(Flow cytometry)检测转染细胞的增殖能力、周期以及DNA含量。结果表明,转染24h后大约16%的细胞被导入含STAT3基因的重组表达质粒。在mRNA水平证实细胞内有STAT3基因的高表达。导入STAT3基因后,细胞增殖能力增强,染色体倍数发生变化,细胞的增殖寿命较对照细胞延长了13代,表明导入STAT3基因后,能延长体外培养的牛乳腺上皮细胞的寿命。 相似文献
9.
在成功构建新城疫病毒(NDV)-F基因真核表达载体pCDNA3-NDV-F的基础上,应用脂质体LipofectamineTM2000介导法,将其转染小鼠肥大细胞瘤细胞株(P815),经过加入G418(600 靏/mL),筛选得到稳定的细胞克隆株,并进一步扩大培养.应用Trizol法提取细胞RNA,经RT-PCR鉴定,转染细胞提取物在1 600bp处出现目的条带.收集转染细胞,经Westernblot和免疫荧光法检测到表达的目的蛋白.将获得的细胞株在液氮中冻存6个月后检测,该细胞株仍能很好表达NDV-F基因,表明其具有高度稳定性,证明采用脂质体法已成功地建立了能够稳定表达NDV-F基因的细胞株. 相似文献
10.
人IGF-1基因重组杆状病毒表达载体的构建及在sf9细胞中的表达 总被引：2，自引：0，他引：2
以pcDNA3．1／IGF-1为模板，采用PCR方法对IGF-1基因进行扩增，EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ酶切回收含IGF-1基因的DNA片段，与pFastHTA连接，获得重组载体pFast／IGF-1；将其转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH10Bac感受态细胞，经卡那霉素、四环素、庆大霉素及蓝白斑筛选得到重组杆状病毒载体pBacmid-Fa-IGF-1，PCR鉴定得到单-／GF-1条带。将该病毒载体转染sf9细胞，进行病毒重组，Western-blot检测／GF-1表达，并用MTT法检测促内皮细胞生长活性。结果成功获得了重组病毒，Western-blot检测出现1条约13．0kD的带，MTT法检测IGF-1促细胞生长率为24．4％。 相似文献
11.
12.
氟对小鼠生精细胞凋亡的影响及锌的保护作用 总被引：1，自引：0，他引：1
为观察氟对成年雄性小鼠生精细胞凋亡的影响及锌的保护作用,通过腹腔注射氟化钠建立氟中毒动物模型及锌保护实验。采用石蜡切片、苏木精-伊红染色(HE染色)、末端原位标记(TUNEL)及琼脂糖凝胶电泳的方法检测小鼠生精细胞的凋亡情况。结果显示:(1)氟感染组无论是低剂量组(NaF10 mg/kg)或是高剂量组(NaF 20 mg/kg)生精细胞都发生了明显的凋亡。生精细胞凋亡主要发生在精母细胞和精原细胞,凋亡指数与对照组差异极显著(P<0.05)。(2)无论是高剂量锌(ZnSO430 mg/kg)和低剂量锌(ZnSO415 mg/kg)都可以使凋亡指数明显降低,高剂量锌组的凋亡指数与对照组差异不显著(P>0.05)。 相似文献
13.
烘焙对生物质热解产物特性的影响 总被引：1，自引：7，他引：1
烘焙可有效地降低生物质中的水分和氧,对其热解过程有显著的影响。该文主要研究了烘焙温度（200,230,260,290℃）对生物质热解过程及产物特性的影响行为及影响机制;研究发现烘焙能改善热解产物的品质,随着烘焙温度的升高,热解合成气中CO含量由48%逐渐减少到34%,CH4和H2增加,其中H2含量最大增加了77.4%,而液体产物中,乙酸和水分含量逐渐减小,水分含量最大减少了42.8%,而酚类产物的含量明显增加,有利于生物油品质的提高。该研究为烘焙技术的发展和生物质高效热化学转化提供科学参考。 相似文献
14.
荔枝种子从果实中剥离出来后, 即使在室内条件下, 也极易失水干缩, 潮湿环境中又易发霉而腐烂。扫描电镜观察表明: 种皮上布满纹孔, 水分散失面积很大; 种脐部为疏松的海绵组织, 且营养丰富。据此, 生产上应对种子彻底清洗, 并保存于适当湿度的环境中, 以提高其发芽率。 相似文献
15.
三门峡水库库岸坍塌成因分析与防治措施研究 总被引：10，自引：0，他引：10
三门峡水库自1960年9月蓄水运行以来,库岸坍塌现象频繁发生,平均每年塌岸0.5～0.7亿m3.指出了造成库岸坍塌的原因主要是地质环境的影响以及水力条件的变化;不同的地形、地貌、地质结构和岩性特征,表现了不同的塌岸强度,其中黄土塬区为极强塌岸段,黄河Ⅱ级阶地为强烈塌岸段,黄河Ⅰ级阶地为中等强烈塌岸段;分析了引起库岸坍塌的主要水力条件有大气降水、地表水和地下水,并且不同水力条件及其变化特征,对库岸坍塌影响的方式和程度也不同;最后给出了防治库岸坍塌应采用标本兼治的原则,治标是指对塌岸进行必要的加固、支挡、衬砌等;治本就是根据引起塌岸的原因以及不同地质环境条件下的塌岸特征和水力条件,因地制宜,因害设防,从根本上进行综合治理. 相似文献
16.
Max Frenzel Philip James Sara K. Burton Steven J. Rowland Hilary M. Lappin-Scott 《Journal of Soils and Sediments》2009,9(2):129-136
Background, aim and scope Unresolved complex mixtures (UCMs) of aromatic hydrocarbons are widespread, but often overlooked, environmental contaminants.
Since UCMs are generally rather resistant to bacterial degradation, bioremediation of UCM-contaminated sites by bacteria is
a challenging goal. Branched chain alkyltetralins are amongst the individual classes of components of aromatic UCMs which
have been identified in hydrocarbon-contaminated sediments and a number of synthetic alkyltetralins have proved toxic in laboratory
studies. Thus, alkyltetralins should perhaps be amongst the targets for UCM bioremediation strategies. The slow degradation
of several alkyltetralins by a microbial consortium has been reported previously; however, the bacteria involved remain unidentified
and no single strain capable of alkyltetralin biodegradation has been isolated. The present project therefore aimed to enrich
and identify bacterial consortia and single strains of bacteria from a naturally hydrocarbon-contaminated site (Whitley Bay,
UK), which were capable of the degradation of two synthetic alkyltetralins (6-cyclohexyltetralin (CHT) and 1-(3’-methylbutyl)-7-cyclohexyltetralin
(MBCHT)).
Materials and methods Bacteria were enriched from sediment collected from Whitley Bay, UK by culturing with CHT and MBCHT for a period of 4 months.
Biodegradation experiments were then established and degradation of model compounds monitored by gas chromatography–mass spectrometry.
Internal standards allowed the generation of quantitative data. 16S rRNA gene clone libraries were constructed from individual
enrichments to allow assessment of microbial community structure. Selective media containing MBCHT were used to isolate single
bacterial strains. These strains were then tested in liquid culture for their ability to degrade MBCHT.
Results The consortia obtained through enrichment culture were able to degrade 87% of CHT and 76% of MBCHT after only 46 days compared
with abiotic controls. The 16S ribosomal RNA gene clone libraries of these bacteria were dominated by sequences of Rhodococcus spp. Using selective media, a strain of Rhodococcus was then isolated that was also able to biodegrade 63% of MBCHT in only 21 days.
Discussion The present report describes the isolation of a single bacterial strain able to degrade the resistant MBCHT. Although significant
losses of MBCHT were observed, putative metabolites were not detectable. Rhodococcus sp. have been reported previously to be able to biodegrade a range of hydrocarbon compounds.
Recommendations and perspectives Due to their environmental persistence and toxicity, aromatic UCMs require bioremediation. The culturing and identification
of such bacteria capable of rapid degradation of alkyltetralins may be an important step toward the development of bioremediation
strategies for sites contaminated with toxic UCMs. 相似文献
17.
18.
稀释介质种类对豆乳蛋白胶体粒子zeta电位测定效果的影响 总被引：1，自引：1，他引：0
蛋白粒子zeta电位是衡量豆乳体系稳定性的一个重要指标,而在电位分析前常采用稀释介质对豆乳进行预处理。为了确保zeta电位测定的准确性和科学性,必须选择合适的稀释介质。因此,该研究采用去离子水、豆乳超滤液两种稀释介质分别对豆乳进行稀释,并比较了这2种稀释介质对zeta电位、粒径分布、pH值以及电导率的影响。结果表明,若以去离子水为稀释介质,zeta电位的绝对值会随着稀释倍数的升高而显著增加（*P<0.05）,这主要是由于豆乳蛋白胶体粒子发生解聚导致粒径减小,而pH值的升高和电导率的降低则说明豆乳的离子强度显著降低。相比之下,选用豆乳超滤液稀释豆乳时,体系的 zeta 电位、粒径分布、pH值以及电导率都未随稀释倍数的增加而改变（*P>0.05）,说明此法能够较好地维持豆乳蛋白粒子的荷电稳定性。由此可知,豆乳超滤液可做为豆乳zeta电位测定的理想稀释介质。 相似文献
19.
物联网是一个集信息通信、数据交换、传感器技术与软件工程于一体的综合性产业,探讨和分析了物联网的结构体系与发展中遇到的安全问题。 相似文献
20.
大豆连作障碍的研究进展 总被引：17，自引：0，他引：17
从生物学、微生物学和植物营养生理学的角度及诸多障碍因子等方面,综合评述和分析了国内外大豆连作研究的现状,阐述了目前国内外学者提出的各种应对连作问题的策略和技术措施,提出大豆连作障碍研究仍有待解决的问题和研究方向。 相似文献