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1.
为了分析草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus,SVBV）ORF Ⅵ基因的功能,采用原核表达技术获得该基因表达的重组蛋白并制备其抗血清。利用PCR技术扩增得到SVBV中国分离物的ORF Ⅵ基因,将此基因克隆到原核表达载体pET-SUMO上,获得重组质粒pET-SUMO-ORF Ⅵ。转化大肠杆菌BL21（DE3）后,经IPTG诱导与Ni2+-NTA亲和柱纯化,获得分子质量约为90 kD的重组蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔制备抗血清,采用间接ELISA和Western blot方法测定抗血清的效价、反应灵敏度以及ORF Ⅵ基因在本氏烟中的瞬时表达。结果显示,间接ELISA法测定抗血清对重组蛋白的效价达1：256 000,Western blot法能够检测到稀释64 000倍的重组蛋白。利用稀释2 000倍的抗血清,仍能够检测出SVBV中国分离物和美国分离物ORF Ⅵ基因在本氏烟中瞬时表达的蛋白。 相似文献
2.
［目的］ 对香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)海口分离物起始蛋白(replication initiation proteins, Rep)基因进行克隆、原核表达、抗血清制备,为BBTV有效的检测及分子流行病学等研究奠定基础。［方法］ 以海口地区染病香蕉幼嫩假茎和叶片的总DNA为模板,通过PCR技术克隆BBTV海口分离物的起始蛋白基因,连接到表达载体并进行大肠杆菌原核表达,制备高效价特异性抗血清。［结果］ 应用PCR方法从染毒香蕉幼嫩假茎和叶片总DNA中扩增复制rep基因,回收目的片段后经酶切,获得了含BBTV Rep基因的重组质粒pET32b Rep。将重组质粒转化E.coli BL21(DE3),经不同的时间、温度及IPTG浓度优化,12% SDS PAGE电泳分析,在20 ℃、0.1 mmol/L IPTG条件诱导4h,最终获得大量的可溶性融合蛋白。将可溶性蛋白上清液经Ni2+ NTA亲和层析柱纯化,得到高纯度的融合蛋白。用纯化后的融合蛋白免疫家兔,获得了BBTV Rep蛋白抗血清。以融合蛋白做抗原,间接ELISA法测定抗血清效价大于125 000。以田间样品做抗原时,结果表明抗血清最佳工作浓度为1∶1 000。Western blot鉴定结果表明抗血清能与融合蛋白特异性结合。［结论］ 利用Rep基因制备的特异性抗血清在BBTV病毒粒体的组装机制研究及病毒病诊断上具有重要的应用价值。 相似文献
3.
用RT-PCR方法从长春感染芜菁花叶病毒( Turnip mosaic virus,TuMV)的十字花科蔬菜中扩增获得该病毒的p3基因,并对其序列进行了比较分析。结果表明,本研究所获得的10个TuMV分离物p3基因含1 065个核苷酸,其序列一致率为98.8%~99.6%,与GenBank中其他15个TuMV分离物核苷酸一致率为80.9%~99.4%。根据p3基因核苷酸序列构建的系统进化树显示:25个TuMV分离物可分为4个组,本研究得到的10个TuMV分离物均属于basal-BR组。将TuMV JCR06分离物p3基因N端663 bp片段克隆至原核表达载体pET-28a(+),并在大肠杆菌BL21(DE3) pLysS中表达出分子量约为28 kDa的融合蛋白。以纯化的融合蛋白为抗原免疫家兔,制备了P3蛋白的特异性抗血清。以TuMV侵染的萝卜为抗原,间接ELISA测定抗血清的效价为1∶2 048。Western blotting分析表明,制备的抗血清能与诱导表达的融合蛋白发生特异性反应。 相似文献
4.
甘蔗花叶病毒HC-Pro基因原核表达及表达产物抗血清制备 总被引：3，自引：2，他引：3
采用RT-PCR方法自甘蔗花叶病毒北京玉米分离物（SCMV-BJ）的基因组中分离出其HC-Pro基因，通过T4DNA聚合酶连接到原核表达载体pET-22b（＋）上，获得的重组子pETHC转化大肠杆菌B121（DE3），用IPTG在37℃进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明，HC-Pro基因在大肠杆菌中获得了高效表达，产生分子量约为52kDa的融合蛋白。将融合蛋白纯化后免疫兔子，获得了特异性的抗血清并提取了抗体IgG。ACP-ELISA测定抗血清的效价为1／8192。结果表明，该血清可用于SCMV-BJ的检测，并为进一步分析HC-Pro的功能奠定基础。 相似文献
5.
根据已报道的甘薯潜隐病毒莲藕分离物sweet potato latent virus-lotus(SPLV-lotus)核苷酸序列设计引物,采用RT-PCR从感病莲藕样品中扩增获得SPLV-lotus辅助成分-蛋白酶基因(HC-Pro),大小为1 375 bp。通过序列测定和分析后,将其克隆到原核表达载体pGEX4T-1,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导并纯化获得大小为74 kD的融合蛋白pGEX4T-1-HC-ProSPLV-lotus。SDS-PAGE结果显示,融合蛋白获得过量表达。以纯化蛋白为抗原免疫新西兰大白兔制备抗血清,采用ELISA和Western blot对抗血清效价和特异性进行检测,当HC-Pro抗血清稀释比为1∶256 000时,ELISA显色后OD450读数仍高于0.6,表明所制备抗血清合格;Western blot结果显示,在感染SPLV-lotus植株样品中仍能检测到单一目的条带。这些结果表明,制备的抗血清效价合格且可用于SPLV-lotus的特异性检测。 相似文献
6.
为实现对玉米黄花叶病毒（maize yellow mosaic virus,MaYMV）的血清学检测,丰富该病毒的检测方法,将编码MaYMV运动蛋白（movement protein,MP）的基因连接到原核表达载体pDBHis-MBP上,将构建成功的原核表达质粒转化到大肠杆菌Escherichia coli中诱导表达融合蛋白,将纯化后的融合蛋白对新西兰大白兔Oryctolagus cuniculus进行免疫并制备MaYMV MP多克隆抗血清,并采用Western blot对抗血清的效价、灵敏度和特异性进行检测。结果显示,利用成功构建的原核表达载体经诱导表达获得分子量大小约为62 kD的融合蛋白,纯化后对新西兰大白兔进行免疫获得MaYMV MP抗血清,该抗血清的效价为1∶128 000,灵敏度为1∶32,且该抗血清能够特异性地检测到本氏烟Nicotiana benthamiana中瞬时表达的MaYMV MP,而不与马铃薯卷叶病毒属Polerovirus及黄症病毒属Luteovirus的其他病毒发生血清学交叉反应,证明该抗血清具有良好的特异性。表明本研究制备的MaYMV MP抗血清能特异性... 相似文献
7.
采用RT-PCR方法克隆了黄瓜绿斑驳花叶病毒辽宁分离物(Cucumber green mottle mosaic virus Liaoning isolate, CGMMV-LN)的cp基因并连接到原核表达载体pGEX-4T-3和pET-22b (+)上, 将获得的重组子pGEX-4T-3-CGMMV CP和pET-22b (+)-CGMMV CP转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE和W estern blot分析表明, cp基因在大肠杆菌中获得了高效表达, 融合蛋白分子量分别为43.8 kDa和17.3 kDa。将17.3 kDa融合蛋白纯化后免疫家兔, 制备了CGMMV特异性抗血清, 抗原包被间接ELISA法(ACP-ELISA)测定抗血清的效价为1/20 000。 相似文献
8.
小麦蓝矮病是西北冬麦区一种重要的植原体病害,造成严重的产量损失。为进一步探究小麦蓝矮植原体的致病机理,通过原核表达获得其致病因子SWP1的重组蛋白并制备抗血清。将PCR扩增到的SWP1基因片段插入到原核表达载体pET-30a(+)上,导入E.coli BL21 (DE3)中,表达出约12 kDa含His标签的融合蛋白。用纯化的融合蛋白注射大白兔皮层,获得了特异性较强的SWP1抗血清,其效价为1∶4 000,并成功应用于SWP1在本氏烟中的检测。制备的抗血清在SWP1蛋白结构、功能及其与寄主的互作研究中具有重要意义。 相似文献
9.
甘薯脉花叶病毒外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达及其抗血清的制备 总被引：1，自引：1，他引：0
根据已报道的甘薯脉花叶病毒(Sweet potato vein mosaic virus,SPVMV)外壳蛋白（CP）基因的核苷酸序列合成引物,利用RT-PCR方法克隆了SPVMV河南分离物（SPVMV-HN）基因组3′端1.8 kb的基因片段,包括部分NIb 基因序列和完整的CP基因及3′端非编码区序列(3′UTR)。序列分析表明,SPVMV-HN的CP基因由996个核苷酸组成（GenBank登录号为FJ687211）,编码332个氨基酸残基。与已发表的SPVMV其他分离物相比,其推导的氨基酸序列一致性为95.2%～98.5%,与 SPVMV广东分离物的氨基酸序列一致性为97.9%。将CP基因克隆到原核表达载体pET-28a（+）上,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,CP基因在大肠杆菌BL21(DE3) pLysS中得到了高效表达。以表达的蛋白为抗原,免疫家兔,制备了SPVMV外壳蛋白的特异性抗血清。ACP-ELISA检测结果表明,制备的抗血清可用于田间甘薯样品的检测。利用SPVMV的抗血清,对采自全国14个省（市）的田间甘薯样品以及嫁接的巴西牵牛样品进行了检测,结果表明,SPVMV在我国甘薯上普遍存在。 相似文献
10.
利用草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus, SVBV)全长克隆pSVBV-E3构建SVBV侵染性克隆。pSVBV-E3经限制性内切酶酶切分别获得0.5-mer SVBV和1.0-mer SVBV,依次正向插入植物表达载体pBINPLUS,成功构建侵染性克隆重组质粒pBIN-1.5SVBV。pBIN-1.5SVBV转化农杆菌,分别接种森林草莓(Fragaria vesca)和4种烟草属植物(Nico-tiana spp.)验证其侵染性。结果表明,SVBV侵染性克隆接种森林草莓8周后发病,表现出典型的叶脉镶边黄化症状,PCR法可以从显症森林草莓中检测出SVBV cp基因,Southern blot法可以检测出SVBV基因组。而接种4种烟草属植物8周后未观察到发病症状,PCR法也未检测出SVBV cp基因。构建的SVBV侵染性克隆经接种验证能够侵染森林草莓,为进一步研究SVBV侵染森林草莓的致病机制奠定了基础。 相似文献
11.
通过PCR的方法,从番茄黄化曲叶病毒江苏分离物DNA中扩增到V2基因,并克隆到pMD18-T载体,序列测定结果显示其与报道的XH2分离物序列完全一致,核苷酸序列全长351 bp,编码115个氨基酸,推测分子量约13 kD。将该V2基因亚克隆到原核表达载体PET32a中获得重组表达载体PET32a-V2,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG可诱导1个分子量约为32 kDa的融合蛋白（含His标签）表达,经Ni+ NTA亲和柱纯化,获得纯化的重组蛋白,免疫家兔制备TYLCV-V2蛋白的多克隆抗体Anti-V2,间接ELISA测定Anti-V2的效价达1∶655 360,Western blot及DIBA分析结果表明Anti-V2可与V2蛋白发生特异血清反应,可为进一步研究V2蛋白的功能提供参考。 相似文献
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辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV)属于烟草花叶病毒属,是辣椒的重要病毒种类之一。将PMMoV的外壳蛋白(cp)基因克隆至原核表达载体pET32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,重组PMMoV CP蛋白以可溶形式表达,纯化后获得分子量约35 kDa的融合CP蛋白。以该重组蛋白为抗原免疫新西兰兔制备了PMMoV CP特异性抗血清。Western blot检测结果表明该抗血清与重组CP蛋白发生强烈的免疫反应,间接酶联免疫吸附测定(ID-ELISA)结果显示该抗血清针对重组CP蛋白的效价达1∶25 600,针对PMMoV病汁液的效价达1∶4 000,检测灵敏度为1∶3 200,且该抗血清不与PMMoV同属或不同属的其它6种病毒汁液发生免疫反应,具有较好的特异性。利用该抗血清对42份田间辣椒病样进行检测,阳性率达38%,与进口商品化试剂盒检测结果一致,说明该抗血清可用于PMMoV的ELISA诊断。 相似文献
13.
为实现草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)的简单和快速检测,应用生物信息学方法分析了SVBV外壳蛋白的线性抗原表位及其理化性质,以大肠杆菌的优势密码子对所预测的优势抗表原位进行设计并合成,同时进行了最佳异源表达条件优化。结果表明,第218~238位的氨基酸残基序列为SVBV外壳蛋白的优势抗原表位,其编码片段为5-AE。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测结果表明,重组融合蛋白的分子量约为24.8 kD,与其理论分子量20.5 kD基本一致。异源表达优化的结果表明,当IPTG浓度为0.5 mmol/L、温度为40℃、诱导时间为4 h时,重组融合蛋白的表达量最高,为23.6 mg/L。Western blot结果表明重组融合蛋白能与His多克隆抗体起特异性反应。串联质谱结果表明,5-AE肽段氨基酸残基序列正确。 相似文献
14.
PCR扩增烟草丛顶病毒(Tobacco bushy top virus,TBTV)的ORF1序列并克隆到原核表达载体pEHISTEV中,转化大肠杆菌Rosetta菌株经IPTG诱导表达TBTV ORF1蛋白。利用切胶纯化的ORF1蛋白免疫新西兰大耳白兔制备并获得抗血清,间接ELISA检测效价为1:24 3000。经抗原亲和纯化从抗血清中得到特异性和灵敏度俱佳的ORF1多克隆抗体。Western blot分析显示,TBTV ORF1多克隆抗体既可以检测田间发病的烟草丛顶病样品中ORF1蛋白,也可检测在体内和体外翻译体系中的TBTV ORF1蛋白的表达。另外发现ORF2蛋白以ORF1延长蛋白的形式存在,根据ORF1和ORF2的重叠情况及潜在的七核苷酸滑动序列和下游的稳定二级结构,推测此ORF1延长蛋白是移码翻译产物。 相似文献
15.
本试验成功构建了香蕉苞片花叶病毒(Banana bract mosaic virus,BBrMV)外壳蛋白(coat pro-tein,CP)基因的原核表达载体,并诱导表达了34 kDa的融合蛋白His.CP。对该原核表达蛋白的可溶性分析表明,该融合蛋白以包涵体形式存在。利用组氨酸标签纯化试剂盒对目的蛋白进行了纯化,获得了高纯度的融合蛋白。以纯化的蛋白为抗原免疫健康家兔,成功制备了抗BBrMV CP基因编码蛋白的兔抗血清。Western-blotting结果表明这种抗血清有很强的特异性。血清效价测定的效价在51 200倍以上,对植物材料的合适检测浓度为1:800～1:3 200。 相似文献
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葡萄卷叶伴随病毒-3外壳蛋白的原核表达及其特异性抗血清的制备 总被引：2，自引：0，他引：2
利用RT-PCR技术扩增得到了葡萄卷叶伴随病毒-3(Grapevine leafroll associated virus-3,GLRaV-3)中国分离物的外壳蛋白(coat protein,cp)基因。序列分析结果表明,cp基因的长度为942bp,与已报道的其它GLRaV-3分离物的cp核苷酸相似性为91%～99%,编码的氨基酸相似性为95%～100%。将此基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS后用终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blotting分析表明,cp在大肠杆菌中可表达出分子量约为35kDa的蛋白。纯化表达产物后免疫家兔制备抗血清。A蛋白酶联免疫吸附测定(PAS-ELISA)及斑点免疫结合测定(DBIA)结果显示,制备的特异抗血清可用于检测田间感病葡萄样品中的GLRaV-3。 相似文献
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甘蔗花叶病毒VPg蛋白的原核表达及其在玉米中的免疫定位 总被引：1，自引：0，他引：1
利用RT-PCR方法从感染甘蔗花叶病毒北京分离株(SCMV-BJ)的玉米叶片中扩增得到VPg基因,将VPg基因连接到原核表达载体pET-28a上。获得的重组子转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析表明,VPg在大肠杆菌中获得了高效表达,产生的融合蛋白分子量为30 kD。将融合蛋白纯化后免疫兔子获得了特异性较高的抗血清。ACP-ELISA测定抗血清的效价为1/4096。利用该抗血清对健康玉米和病毒侵染的玉米茎、叶脉和叶片进行免疫金标记,结果表明在茎和叶脉的韧皮部筛管的细胞壁处有金颗粒。 相似文献
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樱桃病毒A北京分离物外壳蛋白的原核表达及抗血清制备 总被引：3，自引：0，他引：3
根据前期研究获得的樱桃病毒A北京分离物(Cherry virus Aisolate Beijing,CVA-BJ)外壳蛋白基因序列设计引物,将此基因克隆到原核表达载体pET-28a后转化大肠杆菌BL21(DE3),以终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导表达。Ni珠吸附法纯化表达产物后免疫家兔制备抗血清。间接ELISA测得抗血清效价为1∶2048。以纯化后的蛋白和樱桃叶片总蛋白为检测材料,Western blot分析表明抗血清具有高度特异性。间接ELISA方法检测樱桃病叶,结果呈阳性,与RT-PCR检测结果一致。表明制备的抗血清可用于感病樱桃样品中CVA的检测。 相似文献
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为明确我国油桃茎痘相关病毒(nectarine stem-pitting-associated virus,NSPaV)基因组的分子特征,利用RT-PCR和RACE技术对NSPaV中国分离物NSPaV-T04基因组进行克隆,采用最大似然法对得到的NSPaV基因组序列和GenBank中的5条NSPaV基因组序列构建系统发育树,应用RDP软件对NSPaV基因组序列进行重组分析。结果表明:中国分离物NSPaV-T04基因组序列全长为4 991 nt,包括4个开放阅读框(open reading frame,ORF),其中ORF1与ORF2共同编码1个RdRp P1-P2融合蛋白,ORF3编码1个CP,ORF5与ORF3共同编码CP通读蛋白。系统发育树和序列比较分析结果显示,中国分离物NSPaV-T04(MN095353)与美国分离物NSPaV/12P42(KT273410)的亲缘关系最近,核苷酸序列同源性最高,为96.4%;NSPaV-T04的RdRp P1变异较大,与GenBank中5条NSPaV基因组核苷酸序列的同源性为90.5%~96.1%,CP较为保守,核苷酸序列的同源性为96.6%~98.7%。重组分析结果显示,中国分离物NSPaV-T04为鉴定的一个重组体(韩国分离物SK)的亲本序列,表明中国分离物NSPaV-T04可能是一个实际的重组体。 相似文献
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本研究通过RT-PCR技术获得了包含李属坏死环斑病毒怀柔分离物CP蛋白基因的DNA片段,构建了针对pET29a载体的两种表达质粒;〖JP2〗转化大肠杆菌BL21(DE3),并经IPTG诱导表达了带不同融合肽段的PNRSV1（25 ku）〖JP〗和PNRSV2（29 ku）融合蛋白。经过Ni NTA亲和柱与SDS PAGE分离纯化,获得大量表达融合蛋白,并免疫家兔制备了融合表达蛋白的特异性抗体。间接ELISA测定其效价分别为8×103和3.2×104。 相似文献