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1.
为研究结核分枝杆菌（M.tb）rv0199基因在该病原致病性中可能发挥的作用,本研究克隆了rv0199基因,在耻垢分枝杆菌（Ms）中异源表达,并对其表达进行检测。将大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV261进行改造,向载体中引入常用的6His和Strep Ⅱ重组蛋白标签,命名为pMV262。使用Ms/pMV262表达系统对rv0199基因进行超表达,用抗6His标签抗体和抗Strep Ⅱ标签抗体均能特异的检测到重组蛋白。本试验改造的pMV262穿梭表达载体可很方便的检测M.tb的基因在Ms中的异源表达,不用制备针对蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体。构建的重组菌Ms/262-99为进一步研究rv0199基因的功能提供了材料,奠定了基础。 相似文献
2.
为制备结核分枝杆菌(Mtb) rv3036c基因的多克隆抗体,本研究以Mtb强毒株H37Rv基因组DNA为模板,扩增rv3036c基因,克隆至表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-rv3036c,并转化大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L IPTG诱导表达组氨酸标签融合蛋白Rv3036c,采用Ni-NTA His-Bind Resin纯化目的蛋白,经western blot验证纯化蛋白.将Rv3036c蛋白纯化产物免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体.SDS-PAGE和western blot分析结果表明,Rv3036c以可溶形式表达,蛋白分子量大小为28 ku,并且具有良好的免疫原性.以上结果为进一步研究rv3036c基因在Mtb的致病性作用奠定了基础. 相似文献
3.
《畜牧与兽医》2014,(10):1-5
为了构建结核分枝杆菌rv3802c基因双顺反子真核表达质粒,本研究利用重叠延伸PCR技术扩增出rv3802c-HisFlag基因片段,将其克隆到真核表达载体pCDNA3.1(+)上,测序验证后,将基因合成的内部核糖体进入位点和增强型红色荧光蛋白基因片段(IRES-DsRed2)定向插入到这个重组质粒上,经酶切鉴定获得双顺反子表达质粒pC3.1-3LHF-Red。将质粒pC3.1-3LHF-Red转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,通过荧光显微镜观察到增强型红色荧光蛋白成功表达;经Western blot分析表明Rv3802c-HisFlag融合蛋白在CHO细胞中获得了表达。结果表明,本研究成功构建了共表达增强型红色荧光蛋白和Rv3802c-HisFlag融合蛋白的双顺反子表达质粒pC3.1-3LHF-Red,为进一步研究结核分枝杆菌Rv3802c蛋白在分枝杆菌感染细胞过程中的作用奠定基础。 相似文献
4.
试验旨在构建牛分枝杆菌eis基因的穿梭表达载体,鉴定其在重组耻垢分枝杆菌中的生物学活性。采用PCR技术扩增并克隆牛分枝杆菌eis基因,构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV261-Mbeis,经双酶切和测序鉴定其正确性,利用电穿孔法将重组质粒转化至耻垢分枝杆菌mc2155中,采用SDS-PAGE和Western blotting技术检测牛分枝杆菌eis基因在耻垢分枝杆菌中的表达,质谱鉴定目的蛋白氨基酸序列。研究结果表明,成功构建了牛分枝杆菌eis基因穿梭表达载体pMV261-Mbeis;生长曲线表明负载重组质粒不会影响耻垢分枝杆菌的体外生长;SDS-PAGE和Western blotting检测证实了牛分枝杆菌eis基因在耻垢分枝杆菌中可表达出分子质量约44 ku的eis蛋白;质谱检测证明了该蛋白即为牛分枝杆菌eis蛋白。本研究构建的牛分枝杆菌eis基因穿梭表达质粒pMV261-Mbeis在耻垢分枝杆菌中具有生物学活性,为下一步研究表达产物eis蛋白的功能奠定了基础。 相似文献
5.
为探究与人受体相互作用蛋白激酶1 (RIPK1)存在互作的牛分枝杆菌(M. bovis) Mb0869c蛋白对细胞凋亡的作用机制，本研究通过PCR从M. bovis DNA中扩增Mb0869c基因片段后构建重组质粒p MN437-Mb0869c并经PCR和测序鉴定正确后，利用电转化法将重组质粒电转入耻垢分枝杆菌(MS)中，并经western blot鉴定Mb0869c蛋白的表达情况。结果显示，重组菌株中出现约55 ku的特异性条带，表明获得了表达Mb0869c的重组菌MS＿Mb0869c。将MS＿Mb0869c株和对照菌株MS＿Vec分别感染人单核巨噬细胞(THP-1)，通过PI和AnnexinⅤ/FITC染色，经流式细胞仪检测细胞的凋亡情况，结果显示，MS＿Mb0869c感染细胞的凋亡率显著低于MS＿Vec感染组，这表明Mb0869c可以抑制MS诱导的细胞凋亡。将上述获得的Mb0869c基因片段克隆于p LVX-IRES-Puro-3×Flag中，构建的重组质粒经测序鉴定正确后，转染HEK293T细胞中，利用嘌呤霉素筛选表达Mb0869c的细胞并经western blot鉴定。结果显... 相似文献
6.
为研究牛分枝杆菌抑制肿瘤坏死因子介导的细胞凋亡来逃避宿主免疫反应的机制,本试验采用酵母双杂交系统在牛分枝杆菌中筛选可与肿瘤坏死因子受体1相关死亡域蛋白（TRADD）相互作用的蛋白。通过限制性内切酶Sau3AⅠ部分消化牛分枝杆菌基因组,回收片段随机插入pGADT7载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建牛分枝杆菌基因组文库。PCR扩增人tradd基因,将扩增产物克隆于pGBKT7载体上,构建重组诱饵质粒pGBKT7-tradd,转化酵母菌Y2HGold。用诱饵质粒pGBKT7-tradd对牛分枝杆菌基因组文库进行筛选,以获得与TRADD互作的阳性候选克隆;提取阳性候选克隆中的质粒,经测序和同源性比对分析,获得与TRADD互作的牛分枝杆菌蛋白的生物学信息。结果显示,构建的文库滴度为2×106 CFU,平均插入片段在1.5 kb左右,文库重组率>95%。经Western blotting验证,诱饵质粒pGBKT7-tradd可在酵母菌中表达诱饵蛋白TRADD,且TRADD的表达对酵母菌无毒性,不会在酵母菌中自激活。应用酵母双杂交系统初步筛选出20个与TRADD互作的阳性克隆,经复筛、测序和BLAST对比,最终发现7个基因序列。本研究应用酵母双杂交技术成功筛选到7个与TRADD互作的牛分枝杆菌蛋白,为进一步研究牛分枝杆菌对细胞凋亡的抑制机制提供线索。 相似文献
7.
《中国兽医杂志》2015,(9)
为了研究分枝杆菌噬菌体裂解酶lys A的生物学特性及对宿主菌的作用,对分枝杆菌肌尾噬菌体CJAUS5的lys A基因进行PCR扩增、克隆和原核表达,并利用生物信息软件对其序列进行分析。结果显示,CJAUS5-lys A基因与Gen Bank中分枝杆菌肌尾噬菌体的lys A基因具有高度同源性;克隆基因在大肠杆菌BL21中获得了成功表达,重组蛋白以包涵体的形式存在,蛋白分子量约为52 k Da;lys A蛋白保守区域分析结果显示,lys A包含具有酰胺酶活性的肽聚糖识别蛋白(PGRP)超家族,表明Lys A可能具有裂解肽聚糖的能力。本研究克隆表达出分枝杆菌噬菌体CJAUS5裂解酶Lys A,为进一步研究其相关功能奠定了基础。 相似文献
8.
结核分枝杆菌三种分泌蛋白在原核表达载体中的克隆、表达与鉴定 总被引：6，自引：1，他引：5
对结核分枝杆菌的三种分泌蛋白Ag85B,ESAT-6和MPT－64基因进行克隆、鉴定与表达，为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下基础。以结核杆菌H37RV株基因组DNA为模板，用PCR法对基因Ag85B、ESAT－6、MPT－64进行扩增，产物与载体质粒pET22b和pGEX-4T-1构建表达Ag85B、ESAT－6、MPT－64的重组质粒，将此重组质粒先转化到大肠杆菌DH5a内抽提质粒，酶切检验，再转化入表达宿主大肠杆菌BL21（DE3）PLysS菌株内，对转化菌株以IPTG进行诱导后，破菌，离心，上清进行SDS－PAGE电泳，电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白，所表达的蛋白质相对分子质量为30000、6000、50000。结果表明：目的基因克隆到菌株内，重组结核杆菌分泌蛋白Ag85B、ESAT－6、MPT－64的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及上述三种抗原、抗体的大规模制备打下基础。 相似文献
9.
利用DNAStar对牛结核分枝杆菌的3个主要抗原mpb70、mpb83、esat-6进行预测分析,将预测的抗原指数高的抗原表位经全基因合成后,克隆到表达载体pET28a(+)中,构建重组质粒pET28a-mpb-70-83-esat-6,转化入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定,结果检测到相对分子质量约为21 000的重组蛋白。经NI-NTA纯化重组蛋白后进行Western-blot鉴定,结果显示该重组蛋白可被牛结核分枝杆菌的多克隆抗体识别,表明该蛋白具有良好的反应原性。 相似文献
10.
《中国畜牧兽医》2018,(11)
为研究牛分枝杆菌抑制肿瘤坏死因子介导的细胞凋亡来逃避宿主免疫反应的机制,本试验采用酵母双杂交系统在牛分枝杆菌中筛选可与肿瘤坏死因子受体1相关死亡域蛋白(TRADD)相互作用的蛋白。通过限制性内切酶Sau3AⅠ部分消化牛分枝杆菌基因组,回收片段随机插入pGADT7载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建牛分枝杆菌基因组文库。PCR扩增人tradd基因,将扩增产物克隆于pGBKT7载体上,构建重组诱饵质粒pGBKT7-tradd,转化酵母菌Y2HGold。用诱饵质粒pGBKT7-tradd对牛分枝杆菌基因组文库进行筛选,以获得与TRADD互作的阳性候选克隆;提取阳性候选克隆中的质粒,经测序和同源性比对分析,获得与TRADD互作的牛分枝杆菌蛋白的生物学信息。结果显示,构建的文库滴度为2×10~6 CFU,平均插入片段在1.5kb左右,文库重组率95%。经Western blotting验证,诱饵质粒pGBKT7-tradd可在酵母菌中表达诱饵蛋白TRADD,且TRADD的表达对酵母菌无毒性,不会在酵母菌中自激活。应用酵母双杂交系统初步筛选出20个与TRADD互作的阳性克隆,经复筛、测序和BLAST对比,最终发现7个基因序列。本研究应用酵母双杂交技术成功筛选到7个与TRADD互作的牛分枝杆菌蛋白,为进一步研究牛分枝杆菌对细胞凋亡的抑制机制提供线索。 相似文献
11.
本研究以胞内分枝杆菌ATCC13950株基因组DNA为模板,应用巢氏PCR方法扩增热休克蛋白65(HSP65)基因,PCR产物经纯化后与PMD18-T载体连接构建克隆质粒PMD18-T-HSP65,并转化大肠杆菌感受态细胞DH5,筛选阳性克隆并测序,NdeⅠ和BamHⅠ双酶切PMD18-T-HSP65和表达载体PET15b,用T4连接酶4℃过夜连接,转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)pLysS中,筛选和构建了原核重组表达质粒PET15b-HSP65,双酶切鉴定正确后,以终浓度为1mmol/LIPTG诱导并进行SDS-PAGE分析。结果表明,获得约65KD大小的蛋白,与预期结果相符,为胞内分枝杆菌及HSP65基因功能的研究打下基础。 相似文献
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结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6、CFP10基因的克隆、鉴定及其原核表达 总被引：3，自引：0，他引：3
以人型结核分枝杆菌 H37RV株基因组 DNA为模板 ,应用 PCR法对 ESAT- 6和 CFP10基因进行扩增 ,产物经纯化后与载体 PMD18- T连接、转化及酶切鉴定 ,亚克隆到原核表达载体 PGEX- 6 P- 1,构建原核重组表达质粒 ,转化入大肠杆菌 BL2 1中 ,以 1mmol/L IPTG诱导 ,进行 SDS- PAGE电泳。结果表明 ,ESAT- 6和 CFP10基因表达的融合蛋白相对分子质量分别为 32 0 0 0和 36 0 0 0 ,与实测相符。重组结核杆菌分泌蛋白 ESAT- 6和 CFP10的成功表达为结核病诊断及重组疫苗的构建打下了基础 相似文献
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为验证牛分枝杆菌外膜蛋白A是否具有免疫活性,以牛分枝杆菌Vallee Ⅲ株基因组DNA为模板扩增牛分枝杆菌外膜蛋白基因ompA,采用DNA重组技术将此基因片段连于表达载体pGEX6p-1,构建重组质粒pGEX6p-1-ompA,并将其转化到大肠杆菌中BL21(DE3)中,IPTG诱导(终浓度为0.1mmol/L),表达产物进行SDS-PAGE分析.用glutathione sepharose 4B纯化蛋白和Western blot分析该蛋白的免疫学活性.结果表明:pGEX6p-1-ompA以可溶形式表达,蛋白分子量大小为60 kDa,与预计大小相符,纯化的蛋白具有良好的免疫学活性. 相似文献
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为研究牛分枝杆菌(M.bovis)溶血磷脂酶基因在致病机理中的作用,本研究构建了表达M.bovis的溶血酶(LIP)基因的重组质粒pET30a-LIP,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,SDS-PAGE分析表明,重组蛋白表达量占菌体总蛋白的20%;该蛋白经电洗脱纯化后,纯度达95%以上;免疫印迹实验表明,原核表达的蛋白可与兔抗牛分枝杆菌多克隆抗体结合,具特异的免疫反应性。 相似文献
15.
为构建表达牛分枝杆菌(M.bovis)PE_PGRS62蛋白的重组耻垢分枝杆菌,本研究以M.bovis基因组DNA为模板PCR扩增PE_PGRS62基因,获得大小约为1 515 bp的目的片段,并克隆到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV261中,将重组pMV-PE_PGRS62穿梭表达载体电转化到耻垢分枝杆菌内,42℃热诱导重组耻垢分枝杆菌,通过SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并鉴定其生物学活性。经SDS-PAGE分析,表达的PE_PGRS62蛋白分子量约为60 ku,免疫印迹结果表明,表达的PE_PGRS62蛋白与兔抗M.bovis阳性血清反应形成一条特异性蛋白条带。本实验为进一步研究M.bovis致病机理奠定了基础。 相似文献
16.
本研究旨在检测重组结核分枝杆菌10 ku培养滤液蛋白（culture filtrate protein 10,CFP10）对肺泡Ⅱ型上皮细胞系A549细胞Toll样受体（TLRs）信号途径及其介导的炎症反应的影响。PCR扩增cfp10目的基因片段,构建重组质粒载体pCzn1-CFP10。将重组质粒pCzn1-CFP10转入BL21（DE3）大肠杆菌感受态细胞,IPTG诱导表达重组蛋白CFP10（rCFP10）并鉴定,纯化rCFP10,去除内毒素及脱盐备用。设置对照组,利用MTT检测rCFP10对A549细胞的存活率的影响;通过qRT-PCR、Western blot及ELISA等技术,分别在转录和翻译水平检测rCFP10对A549细胞TLRs信号途径关键分子及其下游炎症因子表达的影响。结果显示,成功构建重组表达载体pCzn1-CFP10并表达纯化出高纯度的rCFP10。MTT结果显示,随着rCFP10浓度增加和处理时间延长,A549细胞存活率显著降低。与空白对照组相比,rCFP10分别从转录和翻译水平显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）上调A549细胞中TLRs途径关键分子TLR2、TLR4、MyD88、TRAF6和NF-κB p65及下游炎症因子IL-6、TNF-α的表达水平。rCFP10蛋白可以通过激活A549细胞TLRs受体信号途径促进细胞炎症因子的分泌,这将为进一步加深理解结核病发病机制提供理论依据。 相似文献
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《中国兽医学报》2020,(9)
为探索牛分枝杆菌通过RIPK1来调节细胞凋亡的作用机制,本试验利用分子克隆技术构建诱饵质粒pGBKT7-RIPK1,并通过PEG/LiAc转化法将该质粒转入酵母菌中,经Western blot验证RIPK1在酵母菌中的表达情况后,使用该重组酵母菌筛选牛分枝杆菌基因组文库;筛选所得阳性克隆经互补验证、测序分析以及免疫共沉淀法,最终确定可与RIPK1互相作用的牛分枝杆菌蛋白。结果表明,成功构建诱饵质粒pGBKT7-RIPK1,该诱饵质粒可在酵母菌中表达RIPK1蛋白;用该酵母菌筛选牛分枝杆菌基因组文库共获得16个阳性克隆;这些阳性克隆经互补验证、测序和BLAST对比后共发现翻译正确的7个牛分枝杆菌蛋白;分别构建RIPK1和牛分枝杆菌候选蛋白的真核表达载体,经免疫共沉淀验证后发现可与RIPK1互作的3个牛分枝杆菌蛋白,分别为Mb0869c、Mb0383c和Mb2314,本研究为进一步研究牛分枝杆菌通过RIPK1调节细胞凋亡的作用机制提供数据支持。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2020,(7)
为了验证rv3229c是否为结核分枝杆菌(MTB)的转录调控蛋白Rv3295的调控靶点,并研究哪些小分子对rv3229c与Rv3295蛋白的结合有影响,本研究通过PCR扩增MTB rv3295基因后构建了重组表达载体p ET-22b-rv3295,经诱导后得到重组蛋白Rv3295。凝胶迁移试验(EMSA)和染色质免疫沉淀(Ch IP)试验结果显示,Rv3295与rv3229c(des A3)启动子在体外与体内均能够结合。DNA大沟小沟结合试验表明,Rv3295与rv3229c DNA的大沟结合。通过EMSA小分子筛选,结果显示,小分子(V_(B1)、V_(B3)、V_(B6)、V_C)和金属离子(Fe~(3+)和Zn~(2+))在体外均可降低Rv3295与rv3229c启动子区域的结合,而氨基酸及其它小分子对该结合无影响。分子对接试验表明Rv3295的Glu 67和Glu 105氨基酸残基在该蛋白质与小分子及金属离子的相互作用中起重要作用。以上试验结果表明rv3229c为Tet R家族蛋白Rv3295新的调控靶点。本研究首次揭示了MTB中的Rv3295调控蛋白可直接调控rv3229c(des A3)的表达,进而参与油酸合成的调控。 相似文献
19.
以吉林农业大学经济动物疾病实验室分离并保存的鹿结核分枝杆菌流行株为模板,利用重叠延伸剪接技术(Splicing by overlap extension,SOE)设计引物,克隆Rv3874-Rv3875融合基因,构建重组表达质粒p GEX-4T-1-Rv3874-75,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,并对目的蛋白进行纯化,表达产物通过SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果表明:测序后融合基因Rv3874-Rv3875的序列与Gen Bank中序列的符合率为100%,重组表达质粒p GEX-4T-1-Rv3874-75在大肠杆菌中成功诱导表达,获得可溶性表达的融合蛋白,经SDS-PAGE分析该蛋白的相对分子质量约49 ku,经Western blot鉴定纯化好的融合蛋白能与鹿结核病的阳性血清发生反应,具有良好的反应原性。 相似文献
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以牛分枝杆菌Vallee株基因组为模板，利用PCR方法扩增该菌株的环丙烷一分枝茵酸合酶pcaA基因，并克隆到原核表达载体pET-32a（＋）中，通过大肠杆菌BL21（DE3）表达重组融合蛋白，并利用Ni-亲和层析的方法纯化出重组蛋白。通过鉴定其免疫活性。试验结果表明，成功扩增出了牛分枝杆菌中pcaA基因并纯化出了重组的融合蛋白，通过免疫印记发现，重组蛋白可与牛结核阳性血清发生特异性反应，为进一步研究牛分枝杆菌的致病机理奠定基础。 相似文献