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1.
为获得副猪嗜血杆菌荚膜多糖及其抗血清,本试验采用热酚法提取副猪嗜血杆菌SC096株荚膜多糖,并进行SDS-PAGE及银染检测,然后用荚膜多糖制备的油乳疫苗免疫家兔制备抗血清,并进行琼脂扩散试验及间接血凝试验检测.试验结果显示,热酚法可制备高浓度的荚膜多糖;SDS-PAGE电泳及银染结果显示条带呈弥散性分布,荚膜多糖分子质量55 ku左右;琼脂扩散试验结果呈阳性;间接血凝试验中红细胞发生高达10孔滴度的凝集现象.副猪嗜血杆菌SC096株荚膜多糖的提取及其抗血清的制备,为其他含荚膜的细菌抗血清的制备提供了方法和理论依据, 也为细菌荚膜多糖抗原性及其疫苗研究奠定了基础. 相似文献
2.
为建立检测副猪嗜血杆菌(H.parasuis)抗体方法,本研究以H.parasuis外膜蛋白Omp16为包被抗原建立了检测H.parasuis的间接ELISA方法。反应条件经优化为:抗原包被浓度为1μg/m L,血清稀释度为1:80;血清与抗原最佳作用时间为40 min,二抗稀释10 000倍,与一抗孵育30 min;TMB作用时间为30 min。利用该ELISA方法检测H.parasuis、胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌和猪链球菌2型等血清,除H.parasuis为阳性外其余均为阴性,表明其特异性强。该ELISA方法可检测到最高稀释度为1∶512的阳性血清,敏感性高。重复性试验显示,其批内和批间的重复试验变异系数(CV)分别在3.62%~8.97%和4.3%~9.50%。该ELISA检测方法与进口ELISA试剂盒的阳性符合率、阴性符合率和总体符合率分别为87.8%,90.7%和88.6%。本研究建立的间接ELISA方法,为H.parasuis血清流行病学调查及疫苗免疫评价等提供了重要手段。 相似文献
3.
rfaD基因编码ADP-L-甘油-D-甘露庚糖-6-异构体酶,缺失该基因会导致LOS糖链缩短和疏水性增强,从而影响细菌的致病性。为进一步探索副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)ADP-L-甘油-D-甘露庚糖-6-异构体酶的功能,本研究对Hps SC096 株rfaD基因进行克隆及原核表达。根据GenBank上登录的NC_011852序列,设计引物扩增rfaD基因,获得927 bp目的片段,将其克隆至pMD19-T载体。经送样测序鉴定正确后,连接到pET-32a(+)上进行原核表达,并用IPTG诱导,将诱导产物进行SDS-PAGE和Western blotting分析。SDS-PAGE结果显示,H.parasuis rfaD基因能在E.coli BL21(DE3)中表达,重组蛋白分子质量约为50 ku,与预期分子质量大小一致。Western blotting分析结果表明,该蛋白质能与H.parasuis血清4型阳性高免血清产生特异性结合反应,具较好的反应原性。 相似文献
4.
《中国预防兽医学报》2020,(9)
为研究载副猪嗜血杆菌(H. parasuis)外膜蛋白Omp16 PLGA微球的生物学特性,本研究以H. parasuis外膜蛋白Omp16为芯材,聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)为壁材,通过复乳溶剂挥发法制备PLGA微球疫苗。通过扫描电镜测定微球的形态、激光粒径仪测定微球的粒径分布。结果显示,PLGA微球呈球性,表面圆整,粒径分布较窄,平均粒径为5.2μm;采用BCA法测定微球的包封率和载药率,结果显示,微球的包封率为70.5%,载药率为5.78%;以透析释药法测定微球的体外释放特性,结果显示,微球体外释放42 d累计释放抗原95.3%。用该微球0.2 mg/次,免疫小鼠二次(间隔14 d)后,采用ELISA法测定小鼠抗H. parasuis IgG水平,结果显示,微球佐剂组小鼠H. parasuis IgG抗体水平显著高于灭活疫苗组(p0.01);腹腔注射H. parasuis LY02株(血清5型)进行攻毒保护试验,结果显示,微球佐剂组小鼠攻毒保护率(81.8%)显著高于灭活疫苗组(63.6%)(p0.05)。以上试验结果表明,制备的PLGA微球具有良好的缓释性能,能增强小鼠体液免疫应答,提高H. parasuis攻毒保护率。本研究为H. parasuis亚单位微球疫苗的制备奠定基础。 相似文献
5.
为筛选具有临床诊断价值的副猪嗜血杆菌(H.parasuis)单克隆抗体(MAb),本研究采用H.parasuis 5型强毒株(HPS-5)免疫BALB/c小鼠,利用常规细胞融合技术制备了一株稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株。Western blot结果表明该MAb能够特异性识别所有H.parasuis标准菌株;免疫共沉淀技术与蛋白质谱分析显示该MAb所识别的蛋白为ATP结合盒转运蛋白(ABCT)家族的寡肽透过酶(OppA);利用MAb对噬菌体12肽库进行淘选,8个阳性噬菌体克隆展示有"KTPAE-R"保守序列,对应于H.parasuis SH29755株和SH0165株的469位~475位的氨基酸残基。对OppA氨基酸序列比对结果表明H.parasuis与其它10种猪常见细菌病病原序列一致性为9.1%~74.5%,本研究结果为进一步研究H.parasuis感染的病原学诊断建立了良好的基础。 相似文献
6.
副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)RfaF基因编码脂多糖庚糖基转移酶Ⅱ,参与了细菌的黏附入侵和抗血清中补体杀菌作用.为了进一步研究庚糖基转移酶Ⅱ的功能,用原核表达系统表达H.parasuis RfaF基因.用特异性引物扩增H.parasuis SC096株血清4型RfaF基因,得到一条1 053 bp的片段,将其连接到pET-32a(+)载体上,构建重组表达质粒,并将其转化至DH5α感受态细胞中,经酶切、PCR和测序进行鉴定.测序正确后,提取重组质粒,转化至E.coli BL21 (DE3)感受态细胞中,并用IPTG进行诱导.将诱导产物进行SDS-PAGE和Western blot分析.结果显示,H.parasuis RfaF基因可以在E.coli中表达,重组蛋白分子质量约为55 ku,与预期分子质量大小一致.Western blot分析表明,RfaF蛋白可以与H.parasuis血清4.型阳性高免血清产生特异性结合反应,具有良好的抗原性.本研究结果为深入探讨RafF基因的功能奠定了基础. 相似文献
7.
探索奶牛乳腺炎粪肠球菌cyl A基因对体外培养的单核巨噬细胞完全吞噬功能的影响。通过体外培养牛外周血单核巨噬细胞（BMC-7）,利用牛乳腺炎粪肠球菌野生型菌株（BME1708）和cyl A基因敲除突变株（BME1708?cyl A）按照不同时间梯度侵染BMC-7,利用台酚蓝染色显微镜观察法,统计不同时间BMC-7对BME1708和BME1708?cyl A的吞噬率和吞噬指数的差异。结果表明随着时间的延续,吞噬率和吞噬指数存在动态变化,至48 h时BMC-7对BME1708的吞噬率和吞噬指数分别为25%和2.3,而对BME1708?cyl A的吞噬率和吞噬指数分别为50%和5.5。随着时间的进一步延续,巨噬细胞开始死亡。说明溶血素cyl A基因阳性的粪肠球菌菌株对巨噬细胞的吞噬作用具有一定的负调控作用,并且在巨噬细胞内的存活率相对高,在单核巨噬细胞内存在一定的“内生”现象,这一现象可能是由该致病菌引起的牛乳腺炎常反复、难治愈的分子机制之一。 相似文献
8.
巨噬细胞是机体重要的免疫细胞,分布在机体各个组织中,具有吞噬、抗原加工与递呈、分泌及免疫调节等生理功能。猪感染蓝耳病病毒后,主要影响肺泡巨噬细胞的功能,表现为肺泡巨噬细胞数量减少,吞噬、杀菌活性下降,分泌功能受到抑制,抗原加工、递呈能力减弱等,直接造成感染细胞凋亡和附近大量非感染细胞凋亡,从而形成严重的免疫抑制。蓝耳病导致免疫抑制后,机体对其它病毒性疾病和细菌性疾病易感性明显增加。普清（替米考星）能直接进入到肺泡巨噬细胞内并保持较高的药物浓度,修复受损的肺泡巨噬细胞,恢复肺泡巨噬细胞的数量与吞噬能力等,解除免疫抑制状态,间接起到抗蓝耳病和继发感染的作用。 相似文献
9.
巨噬细胞是机体抗吞噬能力最强的细胞,但布鲁氏菌不但不能被巨噬细胞杀死,反而能在胞内大量繁殖,因此,本研究建立其感染模型,为下一步继续研究布鲁氏菌与其宿主细胞表面相关膜蛋白之间的作用和胞内寄生机制奠定基础。用羊布鲁氏菌强毒株16M感染巨噬细胞系264.7（细胞和细菌比例为1∶500）,感染时间为4 h,建立布鲁氏菌感染巨噬细胞模型,做间接免疫荧光试验和透射电镜试验。间接免疫荧光试验中一抗与二抗最佳稀释度分别为1∶80和1∶80,电镜下观察到细菌侵入细胞时膜凹陷,形态发生变化,形成内吞小体。本试验减少感染过程所涉及的环境因素,优化了间接免疫荧光试验所需的一抗和二抗浓度比,成功建立感染模型。 相似文献
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副猪嗜血杆菌寄生于健康猪的上呼吸道,但是具有致病性的菌株可以引起以纤维性浆膜炎为特征的全身性感染,即通常所说的格拉泽氏病。由于还不清楚副猪嗜血杆菌的致病机制,因此不能完全清楚了解所观察到的副猪嗜血杆菌菌株之间的毒力变异。在感染的过程中,副猪嗜血杆菌必须比肺的防御细胞（包括肺泡巨噬细胞）存活的时间长才能导致发病。通过对来自不同临床背景的菌株进行分析,笔者发现不同菌株对吞噬作用的敏感性不同。从健康动物鼻中分离得到的菌株能被猪肺泡巨噬细胞有效吞噬,而从具有全身症状的动物中分离得到的菌株对此作用具有抵抗性。对敏感性菌株的吞噬作用是通过不依赖特殊受体的机制产生的,这些特殊的受体包括肌动蛋白丝和微管。在本研究中所有被检测的分离自具有全身症状的猪的菌株中,在与PAM的相互作用后可观察到有明显的荚膜,这表明在抗吞噬作用中表面结构发挥了一定的作用。然而,尽管发现在分离自具有全身症状的猪的菌株之间的微管抑制作用有不同的效应,抗吞噬作用的其它机制还有待研究。 相似文献
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《中国兽医杂志》2019,(5)
为了在对四川部分猪场3种呼吸道病原菌即支气管败血波氏杆菌(Brodetella bronchiseptica,B.bronchiseptica)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,H.parasuis)及胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,A.pleuropneumoniae)分离鉴定的基础上,分析这3种病原菌单一和混合感染的情况,并通过药敏试验筛选敏感药物,为临床药物治疗提供参考。从16头病死猪肺脏样品中分离鉴定出B.bronchieseptica、H.parasuis各6株,分离率为37.5%(6/16),A.Pleuropneumoniae 5株,分离率为31.25%(5/16);B.bronchiseptica与H.parasuis、B.bronchiseptica与A.pleuropneumoniae、H.parasuis与A.pleuropneumoniae二重感染率分别为6.25%(1/16),B.bronchieseptica、H.parasuis与A.pleuropneumoniae三重感染率为6.25%(1/16)。药敏试验结果显示,分离的3种菌共17株菌皆对头孢噻肟敏感;对阿莫西林、青霉素、红霉素、罗红霉素、环丙沙星、氟哌酸、头孢拉定、链霉素、卡那霉素、氟苯尼考、庆大霉素、氨苄西林、四环素等13种抗生素均存在一定的耐药性。本试验丰富了四川地区猪呼吸道多种病原菌感染的数据,并为部分猪场合理用药提供了依据。 相似文献
14.
《畜牧与兽医》2016,(4):116-118
从闽北地区16个规模化猪场分离到5株病原菌,经过分离纯化、形态学观察、细菌生化鉴定、PCR鉴定以及测序分析,分离菌株与已知的副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)菌株16S rRNA序列同源性均在96%以上,确定5株病原菌均为副猪嗜血杆菌。通过致病性试验表明:分离菌株均有一定的致病性,其中Hps-jo株分离菌致死率达83.3%。细菌药敏试验表明:分离菌株对头孢噻呋、头孢氨苄、氟苯尼考敏感;对万古霉素、强力霉素、四环素、多黏菌素中度敏感;对环丙沙星、阿莫西林、恩诺沙星低、链霉素、TMP、新霉素耐药率达100%。试验结果为闽西地区副猪嗜血杆菌病的防治提供了参考。 相似文献
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《畜牧兽医学报》2018,(11)
旨在筛选具有高自然转化效率的副猪嗜血杆菌(HPS)菌株,为自然转化机制及基因功能研究提供生物材料;对所得菌株进行全基因组测序,通过比较基因组分析,挖掘HPS自然转化发生的分子背景。本研究采用自然转化方法对75株HPS田间分离株及15株标准株进行自然感受态菌株的筛选,并测定各自然感受态菌株的转化效率。采用PacBio三代测序技术对具有高自然转化效率的HPS菌株SC1401进行全基因组测序,对测序数据进行组装、基因预测、功能注释及共线性分析。将SC1401株测序结果与NCBI发布的SH0165(CP001321)、SH03(CP009158)、KL0318(CP009237)和ZJ0906(CP005384)进行全基因组比对。结果如下:1)共筛选出11株HPS自然感受态菌株,均为野生型,其中SC1401菌株自然转化效率最高;2)全基因组测序结果显示SC1401菌株整个基因组大小为2 277 540bp,GC含量为40.03%,共编码2 220个基因,占整个基因组序列的87.75%(序列已上传至GenBank数据库,登录号为CP015099);3)基因组共线性分析表明SC1401与其他四株全基因组测序菌株的共线性良好;4)比较基因组分析表明,SC1401菌株含特有基因385个,远多于其他4株菌株所含有的特有基因;5株HPS含有一系列相同的与自然转化相关的基因,且除tfox基因外,各基因氨基酸序列一致性均达90%以上。本研究首次报道了一株强自然转化能力的副猪嗜血杆菌SC1401的全基因组序列,并分析了其基因组基本特征,为后续HPS自然转化机制的研究提供一定理论基础。 相似文献
16.
抗猪附红细胞体单克隆抗体的制备 总被引：1，自引：0，他引：1
以纯化的猪附红细胞体免疫BALB/c小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,并用间接ELISA方法进行筛选,经过间接ELISA方法、免疫印迹和间接免疫荧光试验进行鉴定,共获得5株分泌抗猪附红细胞体单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为1H1、1H2、3A5、5B1和7E11,其单抗亚类鉴定分别属于IgG2b、IgG1、IgG2b、IgG2b和IgG2b。这5株McAb均能与猪附红细胞体全菌蛋白发生特异性反应,而不与猪肺炎支原体、猪链球菌、大肠杆菌和猪繁殖与呼吸综合征病毒发生反应,并且1H1、3A5和5B1能识别同一抗原位点,1H2和7E11识别另一抗原位点。 相似文献
17.
本研究旨在探讨非洲猪瘟病毒（ASFV）对猪红细胞（RBCs）的作用以及对猪外周血单核细胞（PBMs）吞噬能力的影响。试验采用流式细胞术检测ASFV侵染猪原代肺泡巨噬细胞（PAMs）和猪红细胞（RBCs）的能力,并检测ASFV诱导RBCs发生凋亡的百分比;同时采用激光共聚焦试验（Confocal）观察ASFV诱导RBCs发生凋亡是否影响PBMs的吞噬能力。结果显示,ASFV不能入侵RBCs,但以时间和剂量依赖性方式诱导RBCs发生凋亡。0.1 MOI ASFV接种RBCs后1、3、5和7 d可分别诱导1.27%、3.23%、7.39%和8.56%的RBCs发生凋亡;1 MOI ASFV接种RBCs后1、3、5和7 d可分别诱导1.54%、3.73%、8.46%和10.74%的RBCs发生凋亡;3 MOI ASFV接种RBCs后1、3、5和7 d可分别诱导2.65%、5.01%、12.44%和18.61%的RBCs发生凋亡。同时,凋亡的RBCs可以增加PBMs对黄绿色荧光微球的吞噬数量,ASFV诱导RBCs凋亡的百分比越高,PBMs吞噬黄绿色荧光微球的数量越多。综上所述,ASFV不能侵染猪RBCs,但可以以时间和剂量依赖性方式诱导RBCs发生凋亡并增强PBMs的吞噬功能。 相似文献
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为探讨粪肠球菌在体外共培养条件下其生物膜形成、黏附能力和抗吞噬作用等生物学特性的变化,本研究以猪源粪肠球菌N41菌株为受试菌株,将其分别与大肠杆菌O157∶H7、沙门氏菌肠炎亚种ATCC 14028以及金黄色葡萄球菌ATCC 25923等参考菌株共培养,通过结晶紫染色法测定其生物被膜生成量,通过菌落计数对猪肠上皮细胞黏附情况和小鼠腹腔巨噬细胞的抗吞噬能力进行定量。结果显示,大肠杆菌O157∶H7对粪肠球菌N41菌株生物膜生成量、黏附作用和抗吞噬作用的变化均不明显(p0.05);沙门氏菌ATCC 14028对粪肠球菌N41菌株的黏附作用明显增强(0.01p0.05),而对其生物膜量和抗吞噬作用变化不明显(p0.05);而金黄色葡萄球菌ATCC 25923则对粪肠球菌N41菌株的生物膜量增加和黏附作用明显增强(p0.01),抗吞噬作用也所有增强(0.01p0.05)。上述研究结果表明,不同细菌与粪肠球菌共培养后对粪肠球菌影响不同,大肠杆菌和沙门氏菌对粪肠球菌毒力影响较小,金黄色葡萄球菌则明显促进粪肠球菌的致病特性。本研究阐明了粪肠球菌在与其它致病菌共培养时,其毒力表现有增强的风险。 相似文献
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为探究肌醇代谢调控因子IolR对嗜水气单胞菌NJ-35的生存及环境应激的调控作用，检测了野生株、iolR缺失株(ΔiolR)及其互补株(CΔiolR)对不同碳源的代谢能力、耐酸、耐药、耐氧化、耐高渗以及抗小鼠单核/巨噬细胞RAW264.7吞噬能力，同时检测其对巨噬细胞的毒性作用。结果显示，ΔiolR缺失株对葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖等4种碳源的代谢能力均显著降低，菌株的耐酸、耐氧化能力显著减弱，而耐高渗能力略有增强；巨噬细胞对ΔiolR的吞噬率升高63.33%。另外，药敏试验结果显示，ΔiolR缺失株对庆大霉素、妥布霉素、头孢曲松、头孢噻肟等4种抗生素的敏感性显著增强。研究表明，肌醇代谢调控因子IolR在嗜水气单胞菌的生存以及对不同胁迫环境的适应性方面发挥重要的调控作用。 相似文献
20.
为建立利用单克隆抗体检测猪附红细胞体病的间接免疫荧光(IFA)方法,用抗猪附红细胞体的单克隆抗体,对48份疑似猪附红细胞体感染的病猪猪血进行免疫荧光检测,并与血涂片镜检及PCR检测方法进行比较,结果显示IFA检测的阳性率为68.75%,与PCR检测阳性率为77.08%符合率较高,比血涂片的瑞氏和姬姆萨染色镜检阳性率高出近30个百分点;而用猪肺炎支原体、猪链球菌和猪巴氏杆菌作对照,结果均呈阴性。建立的用抗猪附红细胞体的单克隆抗体检测猪附红细胞体病的IFA特异性强,敏感性高;检测临床样品的结果准确可靠。 相似文献