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用设计的特异性引物，采用RT-PCR技术特异性地扩增到胡须鸡β-防御素基因Gallinacin-1（简称Gal-1）～Gallinacin-13（简称Gal-13）共13个基因编码区全长片段。通过克隆、测序获得13个基因的cDNA核苷酸序列，并提交到GenBank中获得胡须鸡β-防御素Gal-1、1（a）～Gal-13基因的注册号为：DQ858311~ DQ858323。比较分析胡须鸡13种β-防御素Gal-1、1（a）～Gal-13基因分别与GenBank中注册的防御素基因氨基酸序列的同源性，其氨基酸的同源性均在96.5～100％之间。利用Clustalx软件对所获得的13种胡须鸡β-防御素基因进行系统发育树分析，结果Gal-1与Gal-1（a）、3在同一分支上，Gal-4、5、8在同一分支上，Gal-2、12、13在同一分支上，Gal-6、7在同一分支，Gal-9、10在同一分支，Gal-11独在一分支上。同样用RT-PCR方法分析了胡须鸡β-防御素Gal-1～Gal-13基因在不同组织中的分布，结果发现:Gal-1/2/4/5/6/7/10的表达分布非常广泛，Gal-3/8/9/11/12/13的分布少。 相似文献
2.
用设计的特异性引物，采用RT-PCR技术扩增到胡须鸡β-防御素基因Gallinacin-1（Ga1-1）-Gallinacin-13（Ga1-13）共13个基因编码区全长片段。通过克隆、测序获得13个基因的cDNA核苷酸序列，GenBank登陆号为：DQ858311-DQ858323。比较分析胡须鸡13种β-防御素Ga1-1（a）-Ga1-13，Ga1-1基因与GenBank中注册的防御素基因氨基酸序列的同源性，均在96．5％-100％之间。利用Clustax软件对所获得的13种胡须鸡β-防御素基因进行系统发育树分析，结果显示Ga1-1、Ga1-1（a）、Ga1-2、Ga1-3、Ga1-4、Ga1-5、Ga1-6、Ga1-7、Ga1-8、Ga1-12和Ga1-13在同一大的分支上；Ga1-9和Ga1-10在同一分支；Ga1-11独在一分支上。用RT-PCR方法分析胡须鸡β-防御素Ga1-1－Ga1-13基因在不同组织中的分布，结果发现：Ga1-1、Ga1-2、Ga1-4、Ga1-5、Ga1-6、Ga1-7和Ga1-10的表达分布非常广泛，Ga1-3、Ga1-8、Ga1-9、Ga1-11、Ga1-12和Ga1-13的分布少。 相似文献
3.
鸡β-防御素基因的克隆与结构分析 总被引：5，自引：1，他引：5
通过RT-PCR扩增出鸡β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因的部分cDNA序列，大小分别为198、195和297bp。利用PCR技术扩增出鸡β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因组DNA部分序列，大小分别为1176、1053和2454bp。经分析发现，2个内含子将鸡-β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因的编码区分成3个外显子部分。第1个外显子编码绝大部分信号肽序列；第2个外显子编码信号肽羧基端极小部分序列、原片段序列与大部分成熟肽序列；第3个外显子编码小部分成熟肽序列。扩增到的鸡β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因的两个内含子长度，分别为482和496bp，183和675bp，980和1280bp。鸡β-防御素基因编码区结构的这种组成与哺乳动物的β-防御素基因的不同，在哺乳动物中为1个内含子将β-防御素基因编码区分成2个外显子部分。Blast比较发现，鸡β-防御素Ga1-1和Ga1-2基因位于鸡的3号染色体连续克隆群Contig42．182上，并且这2个基因转录方向相反。Ga1-3基因位于鸡的3号染色体连续克隆群Contig42．181和Contig42．182上，转录方向与Ga1-1基因相同。 相似文献
4.
以防御素为研究对象探讨其药用开发价值已是国内外生物医学研究领域的热点之一,鸡β-防御素-1（Gallinacin-1,Gal-1）对许多致病菌都具有杀菌作用,具有很好的研究开发价值。本研究以含有Gal-1成熟肽全长cDNA的重组质粒pMD19-T-Gal-1为模板,通过PCR在Gal-1成熟肽基因C末端引入6×His-tag,并将其克隆到pcDNA3.1（＋）载体中,构建真核表达质粒pcDNA3.1（＋）-Gal-1-His;经脂质体介导转染Flp-In-293细胞,48h后间接免疫荧光分析,结果重组质粒pcDNA3.1（＋）-Gal-1-His转染的Flp-In-293细胞中有绿色荧光,而阴性对照中无荧光,表明Gal-1-His在Flp-In-293细胞中得到了表达。本研究结果将为进一步研究Gal-1的功能奠定基础。 相似文献
5.
人β-防御素-3与植物甜蛋白Brazzein嵌合基因的合成及其在大肠杆菌中的表达 总被引：2，自引：2，他引：2
根据人β-防御素-3(hBD3)和植物甜蛋白Brazzein(Bra)的成熟区氨基酸序列，按照细菌密码子的偏爱人工合成了7对末端具粘合位点的核苷酸序列。经连接和PCR扩增，使人β-防御素-3与植物甜蛋白Brazzein的编码序列通过一段序列（含凝血酶切割位点涟接成为嵌合DNA。将其插入到pET30a的T7启动子之下，构建成了防御素和甜蛋白双价基因的表达载体pET30a-hBDs-Bra，在大肠杆菌(Eschenchia coli)BL21中诱导表达后，得到了与预计分子量相同的蛋白，约占总蛋白的30．5％，产量约为1．4～2．8mg/mL。 相似文献
6.
SUPERMAN 类基因是植物生长发育中的重要转录因子。为了揭示苹果 SUPERMAN 类蛋白家族的生理基因功能,本研究以富士苹果(Malus domestica Borkh.cv. Fuji)为试材,利用 RT-PCR 方法和锚定PCR 方法克隆了 MdLIFa(GenBank 登录号 HM370493)和启动子序列,利用特异引物 PCR 方法克隆了苹果基因组中其余 11 个 SUPERMAN 类基因。12 个基因命名为 MdLIFa/MdLIFb (GenBank 登录号:HQ260429)、MdSUP1a (HQ418477)/MdSUP1b (HQ418478)、MdSUP4 (HQ418475)/MdSUP12 (HQ418476)、MdSUP5a (HQ418469)/MdSUP13b (HQ418470)、MdSUP9a (HQ418473)/MdSUP9b (HQ418474) 和 MdSUP5b(HQ418471)/MdSUP13a(HQ418472),分别位于 11/3、1/1、4/12、5/13、9/ 未知和 5/13 号染色体,每对基因间的同源性均在86%以上。通过基因枪法轰击洋葱(Allium cepa)表皮细胞,基因瞬时表达证明 MdLIFa 定位于细胞核内。MdLIFa 基因启动子序列中含有多个参与花粉发育、根特异性表达、与光诱导和 Dof 单锌指基因家族作用的调控元件等。系统进化分析表明,MdLIFa/b、MdSUP9a/9b 和 MdSUP5a/13b、以及MdSUP1a/b、MdSUP5b/MdSUP13a和 MdSUP4/12 分别聚类为一组,参与植株的形态建成和花器官发育。苹果 12 个 SUPERMAN 类基因成对高度同源,具有生物学功能的多样性,为深入的基因鉴定和遗传转化提供有用信息。 相似文献
7.
通过Overlap-PCR方法克隆了秦川牛(Bos tarus)的增食欲素受体1(HCRTR1)基因编码区全长,获得1 278 bp编码区全长序列(GenBank登录号:DQ874350),将其克隆至pMD-18T载体上,经测序表明获得的cDNA序列与GenBank公布的序列同源性均为98%.阳性质粒经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后,将目的片段定向克隆到pET32a( )表达载体上,转化B121(DE3)感受态大肠杆菌(Escherichia coli),经鉴定正确后,用IPTG诱导目的蛋白的表达.SDS-PAGE表明,秦川牛HCRTR1基因在大肠杆菌中没有表达,进一步生物信息学分析表明,HCRTR1基因的表达产物为具有7个跨膜螺旋的G蛋白偶联受体,复杂的蛋白质结构使得其不能在原核表达系统中获得表达. 相似文献
8.
为研究40S核糖体蛋白S15a(ribosomal protein S15a,RPS15a)在小麦多子房性状形成过程中的功能作用,以小麦(Triticum aestivum)多子房近等基因系构建的多子房性状SSH-cDNA文库中与RPS15a基因同源的EST序列为信息探针,采用RT-PCR技术从小麦多子房株系幼穗中克隆获得了RPS15a基因的cDNA与DNA序列,分析了该基因在近等基因系间的表达差异及其在多子房株系中不同时期幼穗和同一发育时期不同组织中的表达模式.结果表明,小麦RPS15a基因的cDNA序列(GenBank登录号:HM055513)长为413 bp,编码131个氨基酸;DNA序列(GenBank登录号:HM063421)长为642 bp,含有3个外显子和2个内含子.半定量RT-PCR分析显示,该基因在多子房株系2～4mm幼穗中的表达量高于单子房株系幼穗;在多子房株系不同时期幼穗中的表达量随着幼穗的发育呈现上升趋势,8～9 mm时表达量达到最高;该基因广泛存在于幼根、茎顶端、幼叶和幼穗组织中,在茎顶端表达量高于其他组织.研究推测RPS15a基因的表达上调,可能与小麦多子房性状的发生有关. 相似文献
9.
β-葡萄糖苷酶是纤维素酶系三大成员之一,被认为是纤维素糖化的限速酶。本研究克隆黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因(bgl1),并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中进行表达分析。以GenBank上黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因(bgl1)序列为模板,设计特异性引物,从黑曲霉(Asperjillus niger)基因组DNA中扩增目的片段,通过SOE-PCR的方法将猪腮腺分泌蛋白信号肽序列sp和bgl1相连,成功构建分泌型真核表达载体pc6-sp-bgl1,利用脂质体介导法瞬时转染哺乳动物CHO细胞,通过RT-PCR和Western blot检测,最后通过DNS(dinitrosalicylic acid)法测定表达产物酶学活性。PCR扩增得到的目的序列与文献报道序列的相似性为91%,预测的蛋白氨基酸序列相似性为99%。RT-PCR和Western blot检测证明,外源基因bgl1在CHO细胞中得到表达;分泌到细胞培养上清中的重组蛋白对水杨素的水解活性为1.74U/mL,说明重组蛋白具有β-葡萄糖苷酶活性。本研究克隆得到黑曲霉bgl1基因并在哺乳动物CHO细胞中进行表达,为β-葡萄糖苷酶在单胃动物中的利用提供了基础研究资料。 相似文献
10.
不结球白菜β-1,3-葡聚糖酶基因cDNA全长的克隆与表达分析 总被引：1，自引：0，他引：1
以不结球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis)抗病自交系雪克青为实验材料,通过RACE技术,获得了不结球白菜β-1,3-葡聚糖酶基因的cDNA全长序列。序列分析发现,该基因全长1275bp,编码363个氨基酸,分子量40.66kD,等电点(pI)9.27。推导的氨基酸序列与芜菁bg1基因具有96%的同源性,与拟南芥bg2基因具有61%的同源性,与其它植物β-1,3-葡聚糖酶基因的同源性为49%￣57%。将该序列提交GenBank,登录号为AY836001。Southern杂交显示该基因在不结球白菜基因组中的拷贝数多于1个。半定量RT-PCR分析表明,该基因有低水平的组成型表达,在霜霉病菌(Peronosporaparasitica)诱导后24h其表达量达到高峰。 相似文献
11.
枯草杆菌β-甘露聚糖酶基因的克隆及表达 总被引：1，自引：0，他引：1
以能水解魔芋葡甘聚糖的野生筛选菌种枯草杆菌A33为材料，通过PCR技术从A33基因组中扩增出β-甘露聚糖酶基因编码序列。经过克隆、测序及BLAST比对分析，证实该基因编码β-甘露聚糖酶，属于β-甘露聚糖酶家族中的一员。该基因已注册GenBank（GenBank注册号：DQ269473）。将该基因构建到大肠杆菌表达载体pET-32a并转入大肠杆菌表达系统BL21（DE3），经过诱导获得了此酶的高效表达. 相似文献
12.
在前期已克隆得到的早酥梨(Pyrus bretschneideri cv.Zaosu)抗病基因同源类似物Pb-Zs3(GenBank登录号:EU939783)的基础上,通过RT-PCR获得Pb-Zs3的cDNA序列,并利用RACE技术获得该基因的全长cDNA序列,命名为早酥梨抗黑星病相关基因(Vnp1),提交至GenBank(GenBank登录号:FJ763188).生物信息学分析表明,早酥梨Vnp1基因的全长cDNA序列为1200 bp,包含一个完整的921 bp的开放读码框架(ORF),编码306个氨基酸残基,预测其分子质量为34.6 kD.同时,该基因含有与抗病相关的功能结构域核酸结合位点(NB-ARC),同源性比对显示其与苹果黑星病菌(Venturia inaequails)诱导后的苹果EST序列ABEA004598(GenBank登录号:EB150292)同源性达71%.对早酥梨Vnp1基因进行半定量RT-PCR研究的结果表明,该基因在梨黑星病菌(Venturia nashicola)诱导后216 h内的叶片中的表达水平呈明显上升趋势. 相似文献
13.
鹅脂联素基因的克隆、序列分析及组织表达 总被引：5，自引：1，他引：4
根据GenBank发表的鸡和鸭等物种的脂联素基因序列的同源保守区域,设计了3对特异性引物,以鹅(Anser domeatica)血液基因组DNA为模板,经扩增、测序及拼接得到了部分DNA序列,全长1062bp,包含2个外显子和1个内含子(GenBank Accession No.EU370686)。该基因编码区长738bp,编码245个氨基酸,编码区核苷酸序列及所编码氨基酸序列与鸭的同源性最高,分别为94.85%和95.51%,与鸡的同源性次之,而与哺乳类的同源性较低。蛋白预测的分子量和等电点分别为26603.3D和5.19,与鸡、鸭、人及小鼠的脂联素蛋白相似。半定量PCR结果显示鹅脂联素基因在骨骼肌、脂肪、心脏和肌胃中高度表达,在小肠、腺胃、肾和肺中中度表达,而在肝脏、脾、卵巢和间脑中低度表达。 相似文献
14.
本研究旨在克隆鸡(Gallus gallus)脂滴包被蛋白基因(Perilipin1)的cDNA序列,并检测其在鸡前脂肪细胞分化过程中的亚细胞定位.本研究以7周龄肉鸡腹部脂肪组织为材料,采用RT-PCR和RACE的方法扩增并克隆了鸡Perilipin1基因的5'UTR、CDS和3'UTR片段,分析了该基因的结构;以鸡原代前脂肪细胞为材料,利用免疫荧光及激光共聚焦技术,在诱导分化的不同时间点(12～120 h),检测了鸡Perilipin1在前脂肪细胞中的表达位置.结果表明,本研究获得的鸡Perilipin11基因5'UTR、CDS和YUTR序列总长度为2 379 bp,该基因由9个外最子、8个内含子组成(ATG位于第二外显子上);在鸡原代前脂肪细胞诱导分化过程中,Perilipin1始终包被在脂滴周围.综上,本研究成功克隆了鸡Perilipinl基因的完整cDNA序列并确定了Perilipin1在鸡前脂肪细胞分化过程中与脂滴的空间位置关系,该结果为深入开展鸡Perilipinl基因的功能研究,揭示鸡脂肪代谢的分子遗传机理提供了重要的理论依据. 相似文献
15.
桃脂氧合酶基因(LOX)家族cDNA全长克隆与序列分析 总被引：2，自引：0，他引：2
根据脂氧合酶保守序列设计的简并引物,从瑞蟠5号桃(Prunus persica cv ‘Rui pan 5')果肉总RNA中扩增出795 bp的脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)基因的保守序列,并结合GenBank中公开的LOX基因的EST序列经Blast比对分析、序列组装之后设计基因特异引物(GSP).利用RACE技术共获得3条不同的桃LOX基因cDNA全长序列,分别命名为PpLox1～3(GenBank登录号:EU883638、FJ029110和FJ032015).序列分析结果表明,这3个桃LOX基因家族成员与其它植物的LOX基因尽管在核酸水平上的差异比较大.但在蛋白水平上却有较高的同源性.通过对桃LOX基因蛋白序列和其它植物LOX进行系统进化树分析,发现PpLox1属于13-LOX,PpLox2-3属于9-LOX. 相似文献
16.
β-1,4内切葡聚糖酶是植物寄生线虫食道腺分泌的一类细胞壁降解酶,在植物线虫的侵染过程中具有重要的作用.以马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)为材料,用RT-PCR和RACE方法,获得了β-1,4-内切葡聚糖酶基因的cDNA全长,并将该基因命名为Dd-eng-1b(GenBank登录号为FJ430142).此cDNA全长序列为1 640 bp,包括1个1 443 bp的完整ORF,编码1含481个氨基酸的蛋白,其理论分子量为50.89 kD,等电点pI为6.94.序列比对分析表明,含有糖基水解酶的保守结构域,属于纤维素酶第五家族成员,N端具有19个氨基酸残基组成的信号肽,C端含有细菌式样的纤维素结合域(CBD Ⅱ).cDNA与基因组DNA重叠分析表明,此基因包含4个内含子,长度分别为36、76、187和344bp,切割点符合5'-GT……AG-3'的规律.系统进化树分析表明,该基因与细菌Bacillus subtilis和Erwina carotovora分泌的纤维素酶属于同一支,推测该基因可能来源于细菌的水平基因转移. 相似文献
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用猫白介素18(interleukin,IL-18)基因特异性引物对刀豆蛋白(ConA)刺激后猫外周血单核细胞(PBMCf)总RNA进行了RT-PCR扩增,并将扩增产物纯化后克隆入pMD18-T中进行核苷酸序列测定。结果该基因全长579bp,编码192个氨基酸(GenBank登录号:DQ100372)。在推导的猫IL-18氨基酸序列中,无信号肽序列和潜在的N-联糖基化位点,但存在4个Cys残基。与不同物种IL-18相比,猫IL-18与犬、羊、牛和猪IL-18核苷酸序列有较高的同源性,分别为89.8%、88.6%、88.4%和88.1%,但与小鼠和鸡IL-18有明显的种属差异。将目的基因片段进一步亚克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET28a中构建了重组质粒pETIL-18,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG诱导。结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到分子量为27.5kD的重组目的蛋白。经凝胶薄层扫描,目的蛋白表达量可占菌体蛋白的13.6%。 相似文献
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棕色棉具有典型的自然棕色纤维,在纺织及加工过程中无需漂染,是真正的“生态”、“环保”棉.克隆并了解棉花纤维棕色素合成相关基因对于揭示棉花纤维色素发育的分子机理具有重要的意义.本研究选取亚洲棉(Gossypium arboreum)棕色纤维慈溪紫棉和白棉余姚中棉纤维发育不同阶段RNA,采用Gene Fishing技术,获得1条仅在亚洲棉棕色棉纤维中特异表达的约500bp的PCR扩增产物,根据测序结果和生物信息学分析发现,该基因在核苷酸序列上与拟南芥(Arab idopsis thaliana)种皮棕色素合成TT12基因存在76％的序列同源性.随后利用RT-PCR的方法克隆了该基因,命名为GaTT12a(GenBank登录号:JX013908),该基因编码490个氨基酸残基,分子量约52.7 kD,属于MATE超基因家族中的一个成员.利用荧光定量PCR分析了GaTT12a基因在发育不同阶段纤维、种皮的表达特征,结果表明,GaTT12a基因在棕色纤维、白色棉种皮和棕色棉种皮中均优势表达,在白色棉纤维中几乎不表达,说明该基因参与纤维棕色素的形成,结果暗示棉花种皮棕色素和纤维棕色素可能分享相似的合成代谢途径.研究结果为进一步了解GaTT12a基因参与棕色棉纤维色素形成、棕色棉纤维色素与种皮棕色素合成之间的关系提供了基础研究资料. 相似文献
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屠宰猪肝脏中戊型肝炎病毒（HEV）的检测及组织病理学观察 总被引：7，自引：0，他引：7
从北京、河北和河南三地的屠宰场共采集了581头屠宰猪的肝脏.用抗-人戊型肝炎病毒(HEV)抗体做肝脏中HEV抗原的免疫组织化学染色,用针对HEVORF2区设计的通用引物进行巢式RT-PCR,结果发现,6个地区581头屠宰猪的肝脏HEV免疫组织化学阳性率都在90%以上.从114份肝脏样品中扩增到2条产物,与预期片段348bp大小基本一致,位于HEVORF2区,序列分析、比较显示,扩增出的2个片段(GenBank登录号为:EU326142和EU375565)同源性为99.2%,与HEV基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型的同源性分别为74.9%～78.7%,73.9%～74.1%,74.6%～77%和81.2%～93.7%.用扩增的核苷酸片段绘制的基因进化树显示,2个分离株与HEV基因Ⅳ型AJ344171、AJ344172和AJ344183位于同一分支,属于HEV基因Ⅳ型. 相似文献
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用RT-PCR法克隆了鸡(Gallus gallus)caveolin-3cDNA。测序结果显示，克隆的鸡caveolin-3 cDNA与GenBank已发表的序列一致。序列相似性比较表明，鸡与大鼠、小鼠和人的caveolin-3cDNA有78％左右的相似性，而氨基酸序列相似性约为80％。对鸡caveolin-3的组织特异性和体内不同发育阶段的Northern blot分析结果表明，鸡的caveolin-3为横纹肌特异性表达．同时在1～10周的不同发育阶段中没有表现出明显的变化。 相似文献