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1.
重组人血清白蛋白（HSA, Human serum albumin）基因工程水稻是我国自主研发的可规模化生产水稻重组人血清白蛋白（OsrHSA）的转基因品系，具有极高的推广价值和应用前景，但是目前缺乏对其进行精准定量检测的方法。微滴数字PCR（ddPCR, droplet digital PCR）是近年来新兴的前沿PCR技术，不依赖标准物质即可实现对DNA分子的绝对定量，在转基因产品定量领域被广泛应用。本研究基于ddPCR平台建立了适用于重组人血清白蛋白基因工程水稻（114-7-2品系）的二重ddPCR精准定量检测方法。通过对引物探针的特异性进行验证、对引物探针工作浓度和反应退火温度进行优化，获得最佳反应条件。进而对该方法检测限、定量限和结果重复性做了测定。最后通过对不同含量的重组人血清白蛋白转基因水稻样品进行定量检测，分析比较传统实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）和二重ddPCR的优劣，结果表明本研究建立的转基因水稻HSA/PLD二重ddPCR方法稳定性更好、灵敏度高、成本低廉，精准可靠，适用于不依赖标准物质的精准定量HSA转基因水稻转化体含量分析，可取代qRT-PCR方法进行HSA转基因水稻的绝对定量检测，完善了我国转基因水稻成分精确定量检测技术体系。 相似文献
2.
实施转基因产品定量标识制度需要建立准确可靠的定量检测技术和方法。数字PCR（dPCR）不依赖标准
物质，实现对DNA分子的绝对定量，已成功用于转基因含量检测和标准物质定值。为建立可靠的dPCR方法，获得
准确测量结果，本研究以耐除草剂玉米MON87427为材料，探索建立二重微滴数字PCR（ddPCR）的策略。以构建的
聚合MON87427转化体和5个玉米内标基因的重组质粒pUC57-M为质控样品，将5个不同的玉米内标基因分别与
MON87427组合，通过优化退火温度，根据阳性微滴与阴性微滴分辨率、中等信号强度雨滴数量及测量值与理论值
的一致性等，确定了二重ddPCR组合为MON87427/zSSIIb，最适退火温度为58.4℃。MON87427/zSSIIb 二重ddPCR的
动力学范围为10～60 000拷贝。对盲样进行定量检测，二重ddPCR的定量结果与荧光定量PCR有良好的可比性，
表明MON87427/zSSIIb 二重ddPCR可取代qPCR方法进行转基因玉米MON87427的定量检测及标准物质定值。 相似文献
3.
《大豆科学》2020,(2)
转基因大豆MON87701是由孟山都公司研发的商业化抗虫大豆品系,目前已在17个国家广泛应用。为建立适用于MON87701大豆的高效检测方法,本研究基于实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitive PCR, qPCR)和芯片式数字PCR(3D digital PCR, 3D-dPCR)平台,对44种不同转基因材料进行测试,建立双重定量检测方法。研究结果显示:只在转基因大豆MON87701样品中获得了阳性结果,证实该方法中引物和探针组合具有较高的特异性。进一步对2%、0.9%、0.09%和0.02%不同含量的MON87701转基因大豆进行定量测试,建立的qPCR和3D-dPCR两种方法的定量限均达到0.09%,检出限均达到0.02%,两者并无明显差别,但由于3D-dPCR和qPCR相比不需要标准物质制作标准曲线,并且对DNA提取质量要求更低,因此使用起来更加便捷高效,为转基因检测提供了新的方法和思路。 相似文献
4.
转基因抗草丁膦油菜籽中B arnase基因 的实时荧光定量PCR检测 总被引：9，自引：0，他引：9
利用荧光定量PCR技术,对进口抗草丁膦油菜籽中的B arnase基因进行了定量检测,分别建立了抗草丁 膦油菜籽参照样品外源B arnase基因和内标准HMG基因Ct值与模板量之间的标准曲线和线性回归方程,运用所 建立起来的方法对14批油菜籽样品进行了定量分析。 转基因油菜籽; 草丁膦; B arnase基因; HMG基因; 定量PCR 相似文献
5.
为了建立转基因小麦的PCR检测方法标准,以B73、B72、B102三个被转入外源高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)基因的转基因小麦品系为材料,对目前国内外转基因小麦中通用的标记基因bar和uidA、NOS终止子和Ubiquitin启动子进行了定性PCR的筛选检测,在国内外首次找到了小麦中特有的内参照基因麦谷醇溶蛋白基因(GAG56D),设计并合成了麦谷醇溶蛋白基因(GAG56D)和Ubiquitin启动子的引物序列,并对PCR反应条件进行了优化,PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳分析后,可以检测到预期大小的目的片段.同时对PCR产物用实时荧光定量PCR进行了确证实验,并得到预期的结果.定性PCR最低检测灵敏度为0.5%(w/w).建立的转基因小麦定性PCR筛选检测方法具有通用性. 相似文献
6.
采用SYBR Green实时荧光定量PCR技术,建立转基因大豆BPS-CV127-9的定量检测方法.通过设计特异引物,扩增内标准基因lectin和BPS-CV127-9的5’侧翼序列,建立2种基因的拷贝数-CT标准曲线,根据标准曲线方程计算样品中的转基因含量,并且通过熔解曲线分析扩增反应特异性.结果表明,lectin基因和侧翼序列标准曲线线性关系良好,R2值分别为0.999和0.998,变异系数(CV) 1.50％～18.51％、标准偏差(SD)0.02 ～0.07.检测4个已知BPS-CV127-9含量(1％、0.5％、0.1％、0.05％)的转基因混合样品,实测值与实际值接近.该检测方法具有快速、灵敏、准确、特异、高通量等优点,可以作为转基因大豆BPS-CV127-9的定量检测方法. 相似文献
7.
为了对基因组编辑产品进行精准定性和定量检测，以水稻SP1 基因的编辑植株为材料，在编辑位点上下
游设计通用引物，在编辑位点处设计基因编辑位点特异性TaqMan探针，建立了编辑位点特异性PCR方法。利用该
方法可准确鉴定特异基因组编辑产品，检测灵敏度达到5~10拷贝，可在实时荧光PCR（qPCR）和微滴数字PCR
（ddPCR）平台上对基因组编辑产品进行定量检测。由于数字PCR的微反应单元可消除野生型DNA对通用引物的
竞争性消耗，与qPCR的定量结果相比，ddPCR定量结果具有更高的定量准确性。 相似文献
8.
华南农业大学根系生物学研究中心采用拟南芥的紫色酸性磷酸酶基因AtPAP15转化大豆品系粤春03－3（YC03-3）,获得了酸性磷酸酶活性明显提高、可高效利用土壤磷素的转基因大豆新品系AP15-1。以AP15-1为研究对象,应用TAIL－PCR技术,根据载体序列设计特异引物,获得了转化载体左侧插入的旁邻序列。设计事件特异性检测引物,进行PCR扩增,只能在AP15-1的样品中扩增出特异性条带,进一步用实时荧光定量PCR作分析,结果显示,该引物对重复性好,融解曲线显示只有一个特异峰值。本实验应用该引物对建立的检测方法,检测的灵敏度可以达到0.01%,实时荧光定量PCR检测的极限值可以达到9个基因组的拷贝数,能够满足对转基因大豆新品系AP15-1及其衍生品种检测的需要。 相似文献
9.
10.
以若干定性PCR方法部颁标准对含有0.5％的4份不同转基因混合样品进行检测,先以通用元件标准中的CaMV35s启动子、NOS终止子对混合样品进行初步定性PCR筛选。结果表明,4份样品中都含有转基因成分。Bt基因特异性标准检测表明,3#和4#样品含有转基因抗虫水稻成分。构建特异性标准PCR检测表明,2#、3#和4#样品含有转基因GTS-40-3-2大豆成分。以MON810、Bt176、NK603转化体事件标准进行品系特异性PCR检测,结果证实：1#和4#样品中含有Bt176转基因玉米成分;3#样品中含有Mon810转基因玉米成分;4份样品中均不含NK603转基因玉米成分。说明农业部颁布的定性PCR方法标准能满足于对多种转基因混合样品的检测,且检测结果准确,可靠。 相似文献
11.
油料作物内标准基因研究与应用 总被引：2，自引：0，他引：2
内标准基因（Endogenous Reference Gene）是指具有植物物种专一性且拷贝数恒定、不显示等位基因变化的保守DNA序列。可用于对基因组中某一目的基因进行定量分析和验证PCR反应体系中是否存在抑制物质。基于其物种特异性,内标准基因还能用于食品搀假使杂的判定。油料作物涉及我们日常生活的方方面面,油料制品的鉴别和转基因油料作物的检测急需使用内标准基因。目前,油料作物内标准基因的研究与应用取得了长足进展,但是还没有对它们进行综合比较和分析的报道。本文根据国内外有关油料作物内标准基因的研究,阐述了各物种已开发的内标准基因。并对这些基因从引物位置、扩增片段的大小、拷贝数等特征进行比较和分析。本文综述了油料作物内源特异参照基因的研究概貌和存在问题,有助于对油料作物及其他作物内源特异参照基因的进一步开发和深入研究。 相似文献
12.
ZHANG Xiujie JIN Wujun XU Wentao LI Xiaying SHANG Ying LI Sha OUYANG Hongsheng 《水稻科学》2019,26(4):248-256
Endogenous reference genes(ERGs) provide vital information regarding genetically modified organisms(GMOs). The successful detection of ERGs can identity GMOs and the source of genes, verify stability and reliability of the detection system, and calculate the level of genetically modified(GM)ingredients in mixtures. The reported ERGs in rice include sucrose-phosphate synthase(SPS),phospholipase D(PLD), RBE4 and rice root-specific GOS9 genes. Based on the characteristics of ERGs,a new ERG gene, phosphoenolpyruvate carboxylase(PEPC), was selected, and further compared with the four existing genes. A total of 18 rice varieties and 29 non-rice crops were used to verify the interspecies specificity, intraspecies consistency, sensitivity, stability and reliability of these five ERGs using qualitative and quantitative PCR. Qualitative detection indicated that SPS and PEPC displayed sufficient specificity, and the detection sensitivity was 0.05% and 0.005%, respectively. Although the specificity of both RBE4 and GOS9 were adequate, the amplicons were small and easily confused with primer dimers. Non-specific amplification of the PLD gene was present in maize and potato. Real-time quantitative PCR detection indicated that PLD, SPS and PEPC displayed good specificity, with R~2 of the standard curve greater than 0.98, while the amplification efficiency ranged between 90% and 110%. Both the detection sensitivities of PLD and PEPC were five copies and that of SPS was ten copies. RBE4 showed typical amplification in maize, beet and Arabidopsis, while GOS9 was found in maize, tobacco and oats. PEPC exhibited excellent detection sensitivity and species specificity, which made it a potentially useful application in GM-rice supervision and administration. Additionally, SPS and PLD are also suitable for GM-rice detection. This study effectively established a foundation for GMO detection,which not only provides vital technical support for GMO identification, but also is of great significance for enhancing the comparability of detection results, and the standardization of ERG testing in GM-rice. 相似文献
13.
《中国油料作物学报(英文)》2022,7(4):180-188
The main advantage of digital PCR (dPCR) is that it facilitates absolute quantification of the target without reference to the standard/calibration curve. Crystal droplet dPCR has a three-color staining detection function, which enables multiplex PCR reaction. In this study, this technique was used to establish triple dPCR detection for the genetically modified soybean MON87708 × MON89788 with stacked traits. Specific absolute quantitative detection was accomplished for the genomic DNA extracted from the homogenized seeds of GM stack MON87708 × MON89788 soybean. Our results can serve as a reference for the absolute quantitative detection of stacked events of genetically modified crops. 相似文献
14.
《Journal of Cereal Science》2009,49(3):592-597
Genetically modified crops are widely grown in the world today. Labeling is required when genetically modified organisms (GMOs) are placed on the market. There is a need to establish a specific method for the detection of genetically modified foods. MON863 transgenic maize containing a Cry3Bb1 sequence that produces insecticidal protein cry3Bb1 is a major GMO crop. In this paper, we report studies that designed specific PCR primers and TaqMan probes based upon the 5′-transgene integration sequence, and developed qualitative and quantitative PCR conditions using these primers and probes. We determined the 5′-transgene integration sequence using a ligation-mediated polymerase chain reaction (LM PCR) method. In qualitative PCR studies, the limit of detection (LOD) was 0.5% for MON863 in 100 ng genomic DNA. In the quantitative PCR assays, the limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) are 10 and 100 haploid copies, respectively. Maize samples with different contents of genetically modified component were tested using the established TaqMan real-time PCR system. 相似文献
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Genetically modified crops are widely grown in the world today. Labeling is required when genetically modified organisms (GMOs) are placed on the market. There is a need to establish a specific method for the detection of genetically modified foods. MON863 transgenic maize containing a Cry3Bb1 sequence that produces insecticidal protein cry3Bb1 is a major GMO crop. In this paper, we report studies that designed specific PCR primers and TaqMan probes based upon the 5′-transgene integration sequence, and developed qualitative and quantitative PCR conditions using these primers and probes. We determined the 5′-transgene integration sequence using a ligation-mediated polymerase chain reaction (LM PCR) method. In qualitative PCR studies, the limit of detection (LOD) was 0.5% for MON863 in 100 ng genomic DNA. In the quantitative PCR assays, the limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) are 10 and 100 haploid copies, respectively. Maize samples with different contents of genetically modified component were tested using the established TaqMan real-time PCR system. 相似文献
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17.
转基因作物成分检测为农业转基因生物安全管理提供了重要技术支撑.环介导等温扩增(Loop-mediat-ed isothermal amplification,LAMP)技术操作简便、灵敏度高、特异性强,在转基因作物成分检测中得到了广泛应用.本文针对近年来LAMP技术在转基因大豆、玉米和油菜成分检测中的应用情况进行了分析... 相似文献
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农业转基因生物环境安全检测标准是农业转基因生物安全管理必不可少的技术保障.截至2021年1月,农业部/农业农村部共发布了农业转基因生物环境安全检测标准47项.本文对我国农业转基因生物环境安全检测标准体系现状进行初步总结,对国内外农业转基因生物环境安全检测标准的发展现状进行比较,探讨了今后一段时间内农业转基因生物环境安全... 相似文献