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1.
红松SSR-PCR反应体系的建立与优化 总被引：3，自引：2，他引：1
为了建立红松SSR-PCR最佳反应体系,以CTAB法提取的红松针叶DNA为模板,应用单因子试验及L16(45)正交试验系统分析了DNA模板浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq酶浓度等对SSR-PCR扩增结果的影响,并对延伸时间、热循环参数进行了探讨,建立了稳定的、可重复的红松SSR-PCR最佳反应体系及PCR扩增参数。结果表明,PCR的最佳反应体系为:10μL体系中,1×PCRbuffer1μL、DNA模板50～120ng,Mg2+3mmol/L,dNTP0.4mmol/L,引物0.5μmol/L,Taq酶0.75U。利用该体系筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SSR引物13对。在此反应体系下,所扩增谱带清晰、稳定、多态性高。 相似文献
2.
以火炬松(Pinus teada)幼嫩针叶为材料,采用单因素试验设计分析各组分对SSR-PCR扩增结果的影响,并进一步应用正交试验设计,从DNA模板、引物、d NTPs、Mg2+和Taq酶5个因素3个水平对SSR扩增效果进行研究,确定火炬松SSR-PCR的最佳反应体系。结果表明:各因素不同水平浓度对SSR-PCR反应结果均有影响,火炬松SSR-PCR优化后的反应体系为:DNA模板80 ng、引物0.3μmol/L、dNTPs 0.20 mmol/L、Mg~(2+)2.0 mmol/L、Taq酶1.00 U、1×PCR Buffer,总体积25μL。运用该体系从60对引物中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SSR引物8对,并用不同火炬松家系进行了检验,证明该体系稳定可靠。 相似文献
3.
为建立稳定可靠的野杏SSR-PCR反应体系,以3个野杏无性系170号、240号、263号和1个西伯利亚杏无性系508号为试验材料,采用L16(45)正交试验设计对影响野杏SSR-PCR反应的5个因素在4个水平上进行优化。结果表明:各因素对反应体系的影响由大到小依次为DNA模板浓度、引物、dNTP、Mg2+、Taq聚合酶。野杏SSR-PCR最佳反应体系(总体积20μL):dNTPs 0.45 mmol/L、Mg2+2 mmol/L、Taq酶1.125 U、引物0.125μmol/L、DNA模板20 ng。选用引物X128和60个野杏样木对该体系进行稳定性验证,扩增产物集中在100～200 bp,稳定度高,多态性良好,该体系可应用于野杏分子标记辅助育种等方面的研究中。 相似文献
4.
以南方红豆杉DNA为模板,采用正交试验设计对影响南方红豆杉ISSR-PCR扩增的参数进行了优化。结果表明较佳的南方红豆杉ISSR-PCR的反应体系(20μL)为模板DNA 60 ng,10×PCR buffer 2.0μL,25 mmol/L的MgCl21.0μL,2.5 mmol/L的dNTPs 1.0μL,10μmol/L的引物1.0μL和反应酶0.2 U。适宜的扩增条件为94℃预变性4 min,41个PCR循环(94℃变性30 s,54.5℃退火45 s),72℃延伸80 s,72℃延伸5 min,4℃保存。 相似文献
5.
杉木SSR-PCR体系优化 总被引：1，自引：0，他引：1
SSR-PCR反应体系优化是杉木SSR标记研究的基础.利用正交L16 (45)设计实验对杉木SSR-PCR反应体系的Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和DNA浓度5个因素的4个水平进行优化试验.并在正交直观分析和方差分析的基础上,分别对Mg2+、dNTPs进行单因素确定.获得的最佳反应体系为:在20 μL反应体系中,Mg2浓度为1.0mmol/L,引物浓度为0.25 μμmol/L,dNTPs浓度为0.15 mmol/L,Taq酶为0.05 U/μL,DNA为30 ng,10×PCR Buffer 2μL,不足部分用双蒸水补齐至20μL.在最佳反应体系的基础上,采用单因素实验确定了引物的最佳退火范围为63～53℃.利用此反应体系对10个F1代杉木材料及其亲本,进行4对SSR标记进行PCR扩增并电泳检测,其结果清晰、稳定.说明此体系适合进一步的杉木SSR研究工作. 相似文献
6.
以川山茶品种"茶睡莲"为试验材料,以改良CTAB法提取高质量DNA,采用正交设计L16(45),探讨了Mg~(2+)、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶和模板DNA浓度对川山茶ISSR-PCR和SSR-PCR反应体系的影响。建立了相关优化体系:20μL的ISSR-PCR扩增体系中含20 ng模板DNA,2μL10×Buffer,2 mmol/L Mg~(2+),0.15 mmol/L dNTPs,0.6μmol/L引物和1 U TaqDNA聚合酶,扩增退火温度为55℃,35个循环;20μL的SSR-PCR扩增体系中含50 ng模板DNA,2.5 mmol/L Mg~(2+),0.05 mmol/L dNTPs,0.2μmol/L引物和0.5 U TaqDNA聚合酶,最佳退火温度为52℃,最佳循环数为38。应用该优化体系,分别用27个川山茶品种DNA进行了ISSR-PCR扩增和SSR-PCR扩增,结果显示,建立的优化体系具有较高稳定性。 相似文献
7.
以马尾松胚乳为试验材料,用CTAB-SDS法提取单粒胚乳DNA,对其浓度和纯度进行检测。结果表明:运用CTAB-SDS法提取的马尾松胚乳DNA浓度高、纯度好,琼脂糖凝胶电泳条带清晰,点样孔干净。此外,还对影响PCR结果的Mg2+、dNTP、模板DNA、引物浓度、TaqDNA聚合酶5个因素进行了正交设计试验,建立了适合马尾松SSR-PCR的反应体系:即在10μL反应体系中,Mg2+浓度为2.80 mmol/L,dNTP浓度为0.35 mmol/L,引物浓度为0.075μmol/L,模板DNA浓度为20 ng/10μL,TaqDNA聚合酶浓度为0.50 U/10μL。 相似文献
8.
《中南林业科技大学学报(自然科学版)》2015,(10)
在单因素试验基础上,采用正交试验优化影响观光木SSR-PCR扩增的5种主要影响因素,获得最佳反应体系(10μL)为:Mg2+1.0 mmol,d NTP 0.20 mmol,引物0.25μmol,Taq DNA聚合酶0.75 U,模板DNA 60ng。利用优化SSR-PCR扩增体系,从12对引物中筛选出5对多态性高、重复性好的引物。这为进一步开展观光木种群遗传多样性研究奠定了前期实验基础。 相似文献
9.
《中南林业科技大学学报(自然科学版)》2019,(8)
以云南金花茶为试验材料,利用试剂盒法、SDS法及CTAB法3种方法提取其DNA,并对3种方法的提取结果进行比较;经初筛合成云南金花茶EST-SSR引物,并对影响SSR-PCR体系的Mg~(2+)、Taq DNA聚合酶、dNTP、引物及模板DNA这5个因素进行L_(16)(45~)正交实验,以期建立较为稳定的云南金花茶SSR-PCR体系。试验结果表明:试剂盒法提取得到的云南金花茶DNA质量最好且符合SSR分子标记试验。各因素对PCR扩增效果的影响程度为:Mg2+引物 Taq DNA聚合酶 dNTP模板DNA。试验最终确定的金花茶SSR-PCR最佳反应体系(20μL)为:2.0μL Taq Buffer、1.5μL Mg2+(25 mmol/L)、0.3μL dNTP(10 mmol/L)、0.2μL Taq DNA聚合酶(5 U/μL)、前后引物各0.4μL(10μmol/L)、0.5μL模板DNA(50 ng/μL)、14.7μL ddH_2O。建立和优化云南金花茶SSR反应体系,可为云南金花茶不同种群的遗传变异研究提供基础。 相似文献
10.
采用L16(4^5)正交试验设计,对影响兴安落叶松SSR-PCR反应体系的主要因素(模板DNA、d NTPs、Mg^2+、Taq聚合酶浓度及引物浓度)进行了试验分析,其结果表明:兴安落叶松SSR-PCR体积为20μL的最佳反应体系是模板DNA用量50 ng、正反向引物浓度均为5μmol·L^-1、d NTPs浓度为2.5 mmol·L^-1、Mg^2+的浓度为2.5 mmol·L^-1、Taq聚合酶用量为1.0 U、最佳退火温度为60℃。试验所建立的反应体系可进一步用于兴安落叶松SSR遗传图谱构建、多样性分析、良种选育等方面的研究中。 相似文献