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【目的】开展异种克隆,为濒危动物的保护、细胞核重编程与核质互作研究提供新途径。【方法】以马耳成纤维细胞为供体,牛卵母细胞为受体,采用无透明带手工克隆方法构建异种胚胎,比较不同的激活液、培养液、体细胞同期方式、核移植方法对马-牛异种克隆胚胎体外发育的影响。【结果】（1）A23187 + 6-DMAP联合激活获得的克隆胚胎发育较好,囊胚率2.60%;（2）克隆胚胎于mCR1aa中的卵裂率和桑葚率显著高于CR1aa和SOF（83.65%vs 77.49%,74.87%;22.36%vs19.37%,18.98%,P＜0.05）,且发育到囊胚（2.72%）,CR1aa与SOF间无显著差异;（3）供体细胞经血清饥饿或接触抑制处理后,获得的异种克隆胚的融合率、卵裂率、桑葚率和囊胚率无显著差异;（4）无透明带手工克隆法的融合率显著高于显微注射法（90.33% vs 72.94%）,卵裂率、桑葚率和囊胚率无显著差异;（5）马-牛异种克隆胚与牛同种克隆胚比较,融合率和卵裂率无差别,桑葚率和囊胚率有显著差异（21.78%vs63.52%;2.71%vs37.48%）。【结论】牛卵母细胞能支持马体细胞去分化,进行核重编程。但由于二者的物种距离较远,异种克隆胚胎的发育能力远低于同种克隆胚胎。 相似文献
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【目的】研究线粒体损伤对核移植胚早期发育的影响。【方法】用经光敏化染料罗丹明-123损伤的山羊胎儿成纤维细胞和绵羊卵母细胞,构建山羊-绵羊异种体细胞核移植胚,于38.5℃、相对湿度100%、体积分数5%CO2条件下培养,统计其2-细胞期、8-细胞期和囊胚期的发育率。【结果】山羊核供体线粒体损伤并不影响囊胚期前核移植胚的发育率(P0.05);绵羊卵母细胞线粒体损伤,使核移植胚2-细胞期的发育率下降(P0.05),但不影响8-细胞期和囊胚期的发育率(P0.05);核供体和卵母细胞线粒体都损伤的核移植胚发育率的变化规律与卵胞质受体线粒体损伤的核移植胚一致。【结论】在异种核移植胚的早期发育中,核供体线粒体损伤不影响核移植胚的发育,但卵母细胞受体线粒体损伤明显影响核移植胚的发育率。 相似文献
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本试验以延边黄牛耳部皮肤成纤维细胞作为核移植供体细胞,研究不同的供体处理方式对体细胞核移植胚胎发育的影响。使用血清饥饿和汇合处理供体细胞,并进行了体细胞的冷冻保存,研究冷冻后的核移植效果。结果显示:(1)使用血清饥饿处理和汇合处理后,均能提高重组胚的卵裂率及囊胚发育率。(2)未冷冻组重组胚卵裂率及囊胚发育率显著高于冷冻组(P<0.05)。 相似文献
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转K2.9基因绒山羊体细胞核移植技术体系的优化研究 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】利用体细胞核移植技术制备转毛角蛋白Ⅱ型中间丝K2.9基因的高绒质绒山羊胚胎,为绒山羊优良品种的培育提供一种全新的技术材料。【方法】以含有Neor 基因标记的K2.9 毛囊特异表达载体pcDNA3.1-K转染绒山羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选获得转K2.9基因细胞,将获得的转基因阳性细胞与体外成熟的绒山羊卵母细胞进行核移植,并对生产的重构胚进行了体外培养。本文分别进行了激活方法、供体细胞和卵母细胞来源的筛选,且对获得的囊胚进行了PCR鉴定。【结果】（1）Iono+6-D对成年羊卵母细胞的孤雌激活效果好于A23187+6-D,显著提高了胚胎的卵裂率。（2）羔羊孤雌胚的卵裂率显著低于成年羊,但囊胚率差异不显著。（3）来自2只绒山羊胎儿的转基因成纤维细胞对核移植胚的发育没有显著影响,但2号羊的转基因细胞显著提高了融合率。（4）以羔羊卵进行核移植,显著降低了核移植胚的发育率。（5）对获得的囊胚进行PCR鉴定,成功扩增到目的基因。【结论】将K2.9 毛囊特异表达载体pcDNA3.1-K转染的绒山羊胎儿成纤维细胞作为供体细胞,核移植到成年羊卵母细胞中,以Iono+6-D进行激活,首次成功、高效地获得携带K2.9基因的绒山羊囊胚。 相似文献
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【目的】以绵羊卵母细胞为受体,构建绵羊-绵羊和山羊-绵羊体细胞克隆胚,比较其体外发育能力,探讨绵羊卵母细胞对异种体细胞核的再程序化能力。【方法】以体外成熟的绵羊卵母细胞为核受体,分别以绵羊及山羊胎儿成纤维细胞为核供体,经卵母细胞去核、注核、重构胚电融合、激活等一系列操作,构建同种绵羊-绵羊及异种山羊-绵羊体细胞的克隆胚,比较其体外发育能力。【结果】同种间克隆胚的囊胚发育率(16.0%)高于异种间克隆胚(7.4%)。异种间克隆胚在8-细胞到16-细胞及16-细胞到桑椹胚期间的发育能力显著低于同种间克隆胚。2种克隆胚在2-细胞到8-细胞期间的发育速度基本相同,但异种间克隆胚在8-细胞到囊胚期间的发育速度明显低于同种间克隆胚,两者相差12~24 h。【结论】绵羊卵母细胞对异种体细胞核具有再程序化能力,但这种再程序化能力明显低于其对同种体细胞核的再程序化能力。 相似文献
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[目的]探讨Roscovitine同期化供核细胞对食蟹猴—猪异种体细胞核移植胚胎体外发育的影响,为提高灵长类的核移植效率奠定基础.[方法]活体采集4岁雄性食蟹猴的耳组织,经组织块培养获得纯化的食蟹猴耳成纤维细胞,细胞经固定、染色后用流式细胞仪分析细胞周期分布.以不同同期化方法处理的食蟹猴耳纤维细胞为供体细胞,以体外成熟、去核的猪卵母细胞为受体细胞,利用电融合法构建食蟹猴—猪异种核移植胚胎,观察异种核移植重构胚胎的体外发育情况.[结果]以15 μmol/L Roscovitine处理食蟹猴耳成纤维细胞24、48、72 h获得的G0/G1期细胞比率分别为76.51％、89.69％和90.49％,其中处理48和72h的G0/G1期细胞比率显著高于对照组（P＜0.05）.血清饥饿、接触抑制72 h同期化获得的G0/G1期细胞比率分别为91.12％和90.46％.Roscovitine同期化处理食蟹猴耳成纤维细胞48 h可有效提高食蟹猴—猪异种核移植重构胚胎的囊胚形成率（15.05％）,显著高于血清饥饿同期化处理和接触抑制同期化处理的效果（P＜0.05）.[结论]Roscovitine可有效同期化食蟹猴耳成纤维细胞在G0/G1期,最终提高食蟹猴—猪异种核移植重构胚胎的囊胚形成率. 相似文献
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为了了解牛卵母细胞经短时间(30 min)热应激和采用不同供体细胞对核移植后重构胚发育的影响,对成熟前牛卵母细胞进行了不同温度(38.5(CK),39.5,40.5,41.5和42.5℃)热应激处理,以牛胎儿成纤维细胞为供体细胞,比较了重构胚的卵裂率和囊胚率;将成熟前牛卵母细胞于41.5℃热应激30 min,以未进行热应激处理的牛卵母细胞为对照,比较了3种不同供体细胞(牛胎儿成纤维细胞、牛卵巢上皮细胞、牛颗粒细胞)核移植后的重构胚囊胚细胞数。结果表明,成熟前牛卵母细胞经41.5℃热应激处理30 min,其卵裂率(72.5%)和囊胚率(18.3%)与对照组(57.6%和13.6%)相比均有显著提高(P<0.05);当温度升高至42.5℃后,虽然卵裂率有所提高,但囊胚率与对照组相比显著降低(P<0.05);其他温度处理的卵裂率和囊胚率与对照无显著差异(P>0.05)。牛卵母细胞经41.5℃热应激处理30 min,3种供体细胞形成的重构胚囊胚细胞数差异不显著(P>0.05),而且与其各自对照的囊胚细胞数差异也不显著(P>0.05)。说明41.5℃可以作为牛卵母细胞热应激处理的最佳温度,成熟前牛卵母细胞经41.5℃热应激处理30 min,能有效提高核移植效率。 相似文献
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为研究不同组织来源的供核细胞对猪体细胞核移植胚胎发育能力的影响,分别采用颗粒细胞、耳成纤维细胞和尾成纤维细胞作为供核细胞,移入体外成熟的猪去核卵母细胞中形成重构胚,培养后对比其卵裂率和囊胚率。结果表明：以耳成纤维细胞作为供核细胞的重构胚的囊胚率最高,为17．8％,显著高于颗粒细胞（11．4％）（P〈0．05）。在卵裂率方面,两者无显著差别,分别为65．6％和61．9Voo（P〉o．05）。猪尾尖成纤维细胞的发育能力最差,卵裂率仅为20．2％且未获得囊胚,与其它两组差异显著（P〈O．05）。因此,耳组织来源的成纤维细胞作为供核细胞组织来源丰富且细胞易于传代和保存,以此为供核细胞的重构胚发育能力强,适合作为供核细胞。 相似文献