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1.
《中国家禽》2019,(11)
利用CRISPR/Cas9技术构建RIG-I基因敲除MDCK细胞株,并验证其生物学功能。试验设计并构建了2个靶向RIG-I基因的导向RNA(sgRNA)表达载体,与pCAG-Cas9-EGFP表达载体共转染MDCK细胞,采用PAGE胶基因型检测、定点测序和Western blot筛选细胞株;通过荧光定量PCR检测H9N2亚型禽流感病毒(AIV)感染后MAVS、IRF3、IFN-β、IL-6、Mx1 mRNA表达水平和病毒基因拷贝数,测定TCID_(50)。结果表明:获得两株稳定敲除RIG-I基因的MDCK细胞(MDCK-RIG-I~(-/-)),Western blot检测RIG-I蛋白不表达;荧光定量PCR结果显示病毒感染后MDCK-RIG-I~(-/-)的MAVS、IRF3、IFN-β、IL-6、Mx1 mRNA表达水平显著降低,表明RIG-I基因敲除后RIG-I-Ⅰ型干扰素信号通路受阻;病毒基因拷贝数、TCID_(50)测定结果显示,差异最高可分别达到野生型MDCK的2.16倍、3.19倍,表明RIG-I基因敲除后流感病毒复制增加。该研究利用CRISPR/Cas9技术建立了敲除RIG-I基因流感病毒MDCK细胞株,为研究RIG-I天然免疫应答机制奠定基础;该技术方法和策略也为流感疫苗生产及产业更新换代提供候选细胞株。 相似文献
2.
《畜牧兽医学报》2020,(7)
在实验室前期利用猪肾细胞(PK-15)CRISPR/Cas9全基因组敲除文库(PK-15-GeCKO)筛选到猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)复制相关的宿主因子磷酸十二烷基磷酸酯-葡萄糖基转移酶(ALG5)的前提下,深入研究ALG5与SIV复制的关系。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了包含ALG5基因向导RNA(gRNA)的质粒LentiGuide-puro-ALG5,并通过慢病毒包装感染稳定表达Cas9蛋白的新生猪气管上皮(NPTr)细胞系,采用有限稀释法筛选ALG5基因敲除的单克隆细胞株,通过靶基因组测序及Western blot验证了ALG5基因在NPTr细胞上的敲除水平,通过CCK-8试验验证基因敲除细胞和野生型细胞的细胞活性。结合TCID_(50)和Western blot试验检测了ALG5敲除和过表达对SIV复制的影响。同时,检测了SIV感染NPTr细胞后内源性ALG5蛋白表达量的变化。最后检测了ALG5敲除对猪流感毒株F26复制的影响。结果显示:获得了ALG5敲除的NPTr单克隆细胞系(ΔALG5),ALG5基因敲除细胞与野生型细胞的细胞活性无显著差异。ALG5基因敲除显著抑制SIV的增殖,过表达促进SIV的增殖。在病毒感染条件下,随着病毒的增殖,ALG5的蛋白表达量上调。ALG5基因敲除后,也可以抑制猪流感毒株F26的复制,无毒株特异性。本研究表明,ALG5是影响猪流感病毒复制过程的一个重要宿主因子,为研究猪流感病毒的复制和致病机制奠定了基础。 相似文献
3.
本试验旨在研究干扰素刺激基因15（interferon-stimulated gene 15,ISG15）敲除对猪伪狂犬病病毒（PRV）复制的影响。通过CRISPR/Cas9技术构建猪ISG15基因敲除猪肾上皮（PK-15）细胞系,利用CCK-8试剂盒检测PK-15敲除ISG15基因对细胞活力的影响,采用间接免疫荧光技术检测PK-15以及PK15-ISG15-/-细胞感染PRV的增殖差异,通过RT-qPCR检测PRV-EP0、PRV-gE、PRV-VP16和IFN-β的转录水平,Western blot检测PRV-gE和ISG15的蛋白表达水平,以及通过病毒噬斑检测对子代病毒感染力的影响。结果表明,sgRNA1和sgRNA2均成功敲除ISG15基因;CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明,敲除ISG15基因对PK-15细胞活力无影响;间接免疫荧光检测结果表明,PRV感染后,PK15-ISG15-/-细胞中的荧光强度明显高于PK-15细胞;RT-qPCR和Western blot结果表明,敲除ISG15可以促进PRV的转录和蛋白表达;病毒噬斑试验进一步显示,敲除ISG15可以促进PRV的复制。另外,RT-qPCR结果显示,敲除ISG15可以抑制PRV感染引起的IFN-β转录上调。本研究成功构建了PK15-ISG15-/-细胞系,并通过PRV感染试验证实ISG15基因可以抑制PRV在PK-15细胞中的增殖,并推测这种抑制作用可能与IFN通路有关。 相似文献
4.
在实验室前期利用猪肾细胞（PK-15）CRISPR/Cas9全基因组敲除文库（PK-15-GeCKO）筛选到猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）复制相关的宿主因子磷酸十二烷基磷酸酯-葡萄糖基转移酶（ALG5）的前提下,深入研究ALG5与SIV复制的关系。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了包含ALG5基因向导RNA（gRNA）的质粒LentiGuide-puro-ALG5,并通过慢病毒包装感染稳定表达Cas9蛋白的新生猪气管上皮（NPTr）细胞系,采用有限稀释法筛选ALG5基因敲除的单克隆细胞株,通过靶基因组测序及Western blot验证了ALG5基因在NPTr细胞上的敲除水平,通过CCK-8试验验证基因敲除细胞和野生型细胞的细胞活性。结合TCID50和Western blot试验检测了ALG5敲除和过表达对SIV复制的影响。同时,检测了SIV感染NPTr细胞后内源性ALG5蛋白表达量的变化。最后检测了ALG5敲除对猪流感毒株F26复制的影响。结果显示：获得了ALG5敲除的NPTr单克隆细胞系（ΔALG5）,ALG5基因敲除细胞与野生型细胞的细胞活性无显著差异。ALG5基因敲除显著抑制SIV的增殖,过表达促进SIV的增殖。在病毒感染条件下,随着病毒的增殖,ALG5的蛋白表达量上调。ALG5基因敲除后,也可以抑制猪流感毒株F26的复制,无毒株特异性。本研究表明,ALG5是影响猪流感病毒复制过程的一个重要宿主因子,为研究猪流感病毒的复制和致病机制奠定了基础。 相似文献
5.
旨在构建TPL2（MAP3K8/COT）基因敲除PK-15细胞系PK-15-TPL2-/-,评估该基因敲除前后对口蹄疫病毒（FMDV）和塞内卡病毒（SVA）复制的影响及产生影响的原因,为研究TPL2在病毒感染过程中的作用机制提供良好的生物材料,也为疫苗生产过程中进一步提升FMDV和SVA产量指明方向。筛选2条针对TPL2基因的单向导RNA（sg RNA）,合成sg RNA并将其插入到含有GFP标签的慢病毒表达载体,构建sg RNA/Cas9慢病毒表达质粒,包装慢病毒并感染PK-15细胞,通过流式细胞仪分选出已被转入sg RNA的单细胞。通过测序确认细胞系中TPL2的DNA序列,通过蛋白质印迹（Western blot）方法检测细胞系中TPL2表达情况。使用FMDV和SVA感染构建好的细胞系,利用IFA、RT-qPCR、Western blot和TCID50评估FMDV和SVA在PK-15-TPL2-/-细胞中的复制水平,在此基础上通过测定干扰素（IFN）和IFN刺激基因（ISG）的mRNA表达水平,研究了FMDV或SVA感染的PK-15-TPL2-/-细胞中干扰素途径的激活状态。TPL2基因敲除PK-15细胞系中TPL2基因发生了碱基插入突变和碱基缺失突变,构建的细胞系中均未检测到TPL2蛋白质表达。测定并比较了FMDV和SVA感染的PK-15和PK-15-TPL2-/-细胞中病毒含量,表明TPL2基因敲除显著促进了FMDV和SVA的复制。同时,RT-qPCR进一步表明与FMDV和SVA感染期间的PK-15细胞相比,PK-15-TPL2-/-细胞中IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56的mRNA表达明显降低。综上所述,本研究成功构建了TPL2基因敲除的PK-15细胞系,与对照细胞相比,TPL2基因的敲除更利于FMDV和SVA的复制,这可能与IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56表达的抑制有关。本研究提示CRISPR/Cas9基因编辑技术可以作为在动物和疫苗开发过程中编辑细胞系以提高病毒产量的有效工具,本结果为进一步提升FMDV和SVA产量指明了方向,也为研究TPL2在病毒感染过程中的作用机制提供了良好的生物材料。 相似文献
6.
《畜牧兽医学报》2020,(5)
旨在构建TPL2(MAP3K8/COT)基因敲除PK-15细胞系PK-15-TPL2~(-/-),评估该基因敲除前后对口蹄疫病毒(FMDV)和塞内卡病毒(SVA)复制的影响及产生影响的原因,为研究TPL2在病毒感染过程中的作用机制提供良好的生物材料,也为疫苗生产过程中进一步提升FMDV和SVA产量指明方向。筛选2条针对TPL2基因的单向导RNA(sg RNA),合成sg RNA并将其插入到含有GFP标签的慢病毒表达载体,构建sg RNA/Cas9慢病毒表达质粒,包装慢病毒并感染PK-15细胞,通过流式细胞仪分选出已被转入sg RNA的单细胞。通过测序确认细胞系中TPL2的DNA序列,通过蛋白质印迹(Western blot)方法检测细胞系中TPL2表达情况。使用FMDV和SVA感染构建好的细胞系,利用IFA、RT-qPCR、Western blot和TCID_(50)评估FMDV和SVA在PK-15-TPL2~(-/-)细胞中的复制水平,在此基础上通过测定干扰素(IFN)和IFN刺激基因(ISG)的mRNA表达水平,研究了FMDV或SVA感染的PK-15-TPL2~(-/-)细胞中干扰素途径的激活状态。TPL2基因敲除PK-15细胞系中TPL2基因发生了碱基插入突变和碱基缺失突变,构建的细胞系中均未检测到TPL2蛋白质表达。测定并比较了FMDV和SVA感染的PK-15和PK-15-TPL2~(-/-)细胞中病毒含量,表明TPL2基因敲除显著促进了FMDV和SVA的复制。同时,RT-qPCR进一步表明与FMDV和SVA感染期间的PK-15细胞相比,PK-15-TPL2~(-/-)细胞中IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56的mRNA表达明显降低。综上所述,本研究成功构建了TPL2基因敲除的PK-15细胞系,与对照细胞相比,TPL2基因的敲除更利于FMDV和SVA的复制,这可能与IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ISG15、ISG54和ISG56表达的抑制有关。本研究提示CRISPR/Cas9基因编辑技术可以作为在动物和疫苗开发过程中编辑细胞系以提高病毒产量的有效工具,本结果为进一步提升FMDV和SVA产量指明了方向,也为研究TPL2在病毒感染过程中的作用机制提供了良好的生物材料。 相似文献
7.
【目的】 研究白细胞介素-10（IL-10）对猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）复制的影响,筛选PCV2高感染性细胞系和提高PCV2病毒滴度,为后续疫苗的研发及IL-10在PCV2感染中的作用研究提供参考。【方法】 利用PCR技术扩增猪IL-10基因,将目的基因与慢病毒表达载体（pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro）进行连接,获得重组质粒pCDH-CMV-IL-10,将其与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞进行慢病毒包装。用收集的慢病毒液感染PK-15细胞,经嘌呤霉素筛选后得到细胞株PK-15-IL-10,对照组细胞分别命名为PK-15-pCDH和PK-15。PCV2感染PK-15-IL-10、PK-15-pCDH和PK-15细胞株后,在24、48和72 h分别收集细胞液,利用CCK-8检测细胞活力。利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测IL-10基因的表达水平和PCV2的复制情况;利用间接免疫荧光试验（IFA）观察PCV2在细胞中的复制情况及测定PCV2的病毒滴度（TCID50）。【结果】 试验成功构建了重组质粒pCDH-CMV-IL-10,将其与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞后,48 h时细胞状态最好,荧光最强。分别收集共转染48和72 h的慢病毒液上清感染PK-15细胞,pCDH-CMV-IL-10组的荧光最强,将其在嘌呤霉素浓度为2.5 μg/mL的完全培养基中继续培养,获得仍有绿色荧光的稳转细胞株。实时荧光定量PCR和Western blotting检测发现,IL-10基因在pCDH-IL-10细胞株中的表达量明显高于对照组PK-15-pCDH和PK-15,PCV2的拷贝数增加了4倍,复制能力增强,且将病毒稀释连续传3代后,PK-15-IL-10细胞中的PCV2极显著高于PK-15细胞（P<0.01）。细胞增殖试验表明,猪IL-10基因在细胞中过表达对细胞活力无明显影响;IFA结果表明,PK-15-IL-10细胞中的荧光比PK-15细胞更强,PCV2在PK-15-IL-10细胞中的TCID50在感染后48 h极显著高于PK-15细胞（P<0.01）。【结论】 本研究成功构建了pCDH-CMV-IL-10的慢病毒表达载体,并利用其感染PK-15细胞,继续培养后筛选出过表达IL-10的PK-15-IL-10细胞株,用PCV2感染该细胞株能促进PCV2在PK-15细胞中的复制。本试验结果为后期疫苗研究提供了参考,为进一步研究IL-10对PCV2在PK-15细胞中复制的影响奠定了基础。 相似文献
8.
【目的】 构建混合谱系激酶结构域样(mixed lineage kinase domain-like，MLKL)基因敲除的PK-15细胞株(PK-15 MLKL-KO)，研究敲除MLKL基因对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)复制的影响。【方法】 根据MLKL序列设计特异性编辑位点，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MLKL-sgRNA编辑载体，转染至PK-15细胞，经嘌呤霉素药物筛选获得多克隆细胞系，通过有限稀释法获得PK-15 MLKL-KO单克隆细胞株。通过靶基因组PCR、测序和Western blotting验证MLKL基因在PK-15细胞上的敲除水平;采用Reed-Muench法检测病毒增殖水平;采用PI染色和荧光显微镜观察细胞坏死情况。【结果】 试验成功构建MLKL-sgRNA载体，筛选出1株MLKL基因缺失647 bp的PK-15细胞株，Western blotting未检测到MLKL蛋白的表达。与PK-15细胞相比，PK-15 MLKL-KO细胞极显著或显著提高了PRV GD-WH(感染后36 h除外)和PRV Bartha-K61的病毒滴度(P<0.01;P<0.05)。PRV GD-WH和PRV Bartha-K61感染PK-15 MLKL-KO细胞后，坏死细胞明显减少。【结论】 本研究构建了MLKL基因敲除的PK-15细胞株，与PK-15细胞相比，PK-15 MLKL-KO细胞显著提高了PRV GD-WH和PRV Bartha-K61的复制和存活能力，为PRV Bartha-K61疫苗生产过程中提高病毒产量提供了一种可行性策略。 相似文献
9.
凋亡相关斑点样蛋白敲除PK-15细胞系的建立及对PRV感染的影响 总被引：1，自引：1，他引：0
本试验旨在研究凋亡相关斑点样蛋白（ASC）的基因敲除对猪伪狂犬病病毒（PRV）感染PK-15细胞的影响。以慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建猪肾上皮细胞（PK-15）ASC基因稳定敲除细胞系,通过T7核酸酶检测靶基因的敲除效率;CCK-8试剂盒检测PK-15敲除ASC基因对细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测PK-15以及PK15-ASC-/-细胞感染PRV-GFP病毒的增殖差异;RT-PCR检测PRV-gB及IFN-β、ISG15、IL-1β mRNA表达水平;Western blot检测PRV gE蛋白的表达;TCID50检测子代病毒感染力的滴定。结果表明：两对特异性sgRNA均能对ASC进行基因编辑,但经过T7核酸酶酶切检测进行基因编辑效率分析,结果表明,sgRNA2的基因编辑效率最高;CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明,PK-15以及PK15-ASC-/-细胞活力无影响;流式细胞仪检测结果表明PRV-GFP在PK15-ASC-/-细胞中的增殖显著低于PK-15细胞;定量RT-PCR结果表明,PRV-gB基因在PK15-ASC-/-细胞中的转录水平显著低于PK-15细胞,而IFN-β、ISG15基因在PK15-ASC-/-细胞中的转录水平显著高于PK-15细胞;Western blot结果表明,PRV的gE蛋白在PK15-ASC-/-细胞中的表达显著低于PK-15细胞;滴度测定结果表明敲除ASC基因能够显著抑制子代病毒的增殖能力。本研究成功构建了PK15-ASC-/-细胞系,并通过PRV感染试验证实敲除ASC基因可以抑制PRV在PK-15细胞中的增殖。 相似文献
10.
为探索猪血小板反应蛋白3(thrombospondin 3,THBS3)在PRV复制中的功能，利用CRISPR/Cas9系统构建THBS3基因缺失的PK-15稳定细胞株。首先，根据THBS3基因序列和CRISPR/Cas9靶点设计原则设计并合成2对sgRNA序列，退火后连接到Lenti-CRISPRv2慢病毒表达载体；与慢病毒包装质粒共转染人胚肾细胞(HEK293T)获得重组慢病毒，收集细胞上清并离心去细胞碎片后转导PK-15细胞，进行嘌呤霉素筛选获得THBS3敲除的PK-15细胞株；将重组病毒rPRV-GFP接种至野生型和缺失型细胞评价病毒复制差异。结果显示，表达sgRNA的重组质粒构建成功；将收获的慢病毒转导细胞后通过筛选获得1株无THBS3蛋白表达细胞株(PK-THBS3-KO),通过测序发现外显子3有1个碱基的插入；感染试验显示，THBS3基因缺失后抑制了PRV复制。结果表明，通过CRISPR/Cas9系统成功构建了PK-15的THBS3基因敲除的稳定细胞株，PRV感染试验显示基因缺失后抑制了病毒复制。 相似文献
11.
为研究与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)结合的猪氨基肽酶N (pAPN)受体核心区对TGEV复制以及细胞功能的影响，本研究检索并分析p APN与TGEV的结合位点，结果显示，敲除p APN aa668～aa963对其酶活性无影响。因此，利用CRISPR/Cas9技术构建p APN与TGEV结合位点敲除细胞系，经PCR和western blot鉴定结果显示，正确构建一株敲除p APN aa668～aa963的ST细胞系，即敲除p APN 15-21外显子，命名为KO-ST-15。采用CCK-8和细胞划痕方法检测KO-ST-15细胞的增殖和细胞迁移活性，结果显示，敲除p APN 15-21外显子对ST细胞增殖和迁移活性均无显著影响。利用RT-q PCR和IFA检测KO-ST-15感染TGEV后病毒复制拷贝数和N蛋白的表达，结果显示，敲除p APN 15-21外显子可极显著抑制TGEV在ST细胞系中的复制(P<0.001)。利用RT-q PCR检测KO-ST-15感染TGEV后炎症相关基因转录水平变化，结果显示，TGEV感染后KO-ST-15中的IL-6、IL-8和NLRP3 (NOD-... 相似文献
12.
《中国兽医学报》2020,(1):66-71
利用CRISPR/Cas9技术构建稳定敲除TRIF基因的RAW264.7细胞株。首先,制备Cas9表达慢病毒,感染RAW264.7细胞,通过Puromycin抗性进行初步筛选,PCR法进行鉴定。其次,设计3条特异性识别TRIF基因的sgRNA(sgTi1、sgTi2、sgTi3),将其转入稳定表达Cas9蛋白的RAW264.7细胞株,荧光显微镜观察转入效果,PCR和Western blot法验证基因敲除情况。最后,挑选基因敲除效果最佳细胞株,经TRIF激活剂诱导后,提取细胞总RNA,荧光定量PCR检测IFN-β表达水平。结果显示:感染后的RAW264.7-Cas9细胞Cas9基因扩增产物升高,说明成功获得稳定表达Cas9基因的RAW264.7细胞。含目的基因的慢病毒感染RAW264.7-Cas9细胞后,荧光显微镜下可明显观察到目的基因已成功导入;PCR结果显示,与对照组比较,分别导入sgTi1、sgTi2、sgTi3的3组RAW264.7细胞TRIF表达均受到抑制,Western blot进一步验证3组RAW264.7细胞TRIF蛋白表达均下降且sgTi1组下降最显著,说明TRIF基因敲除成功。经TRIF激活剂诱导,与RAW264.7-Cas9-NC细胞比较,敲除TRIF基因后RAW264.7细胞IFN-βmRNA水平受到明显抑制。结果表明:利用CRISPR/Cas9技术成功构建了稳定敲除TRIF基因的RAW264.7细胞株。 相似文献
13.
TANK结合激酶1(TBK1)是病毒感染时IRF3、IRF7磷酸化及Ⅰ型干扰素表达的关键酶,在抗病毒天然免疫应答和获得性免疫应答中发挥重要作用。为研究TBK1基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响,首先利用CRISPR/Cas9技术构建猪TBK1基因稳定敲除PK-15细胞系,并利用CCK-8检测敲除TBK1对PK-15细胞活力的影响。然后利用流式细胞术检测PRV-GFP荧光强度,用RT-qPCR检测PRV-gB、PRV-gE、PRV-TK、IL-1β、IFN-β和ISG15的转录水平,用Westernblot检测PRV-gB和PRV-gE蛋白表达水平,以及通过滴度测定检测子代病毒的感染力,综合评价TBK1基因稳定敲除PK-15细胞对PRV病毒复制的影响。结果显示:T7E1检测结果显示TBK1基因外显子2区的3个sgRNA靶位点均切出了目的条带,选取编辑效率最高的TBK1-sgRNA1细胞系进行单克隆化培养,获取6株稳定敲除TBK1基因的单克隆细胞,随机选取4号细胞株进行CCK-8检测,结果显示敲除TBK1对PK-15细胞活力无影响。流式检测结果显示PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15细胞的56.89%,PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15-TBK1-/-细胞的77.95%,表明PK-15-TBK1-/-细胞可以促进PRV-GFP复制。RT-qPCR及WB检测显示该细胞系可以促进PRVmRNA转录和蛋白表达。滴度测定结果显示,PRV-QXX在PK-15细胞复制后TCID50为10^6.8TCID50·0.1mL^-1,而在PK-15-TBK1-/-细胞中复制后TCID50为10^8.5TCID50·0.1mL^-1。另外,RT-qPCR结果显示该细胞系可以抑制PRV感染引起的IL-1β、IFN-β和ISG15转录上调。以上结果表明TBK1基因敲除PK-15细胞系促进PRV复制,可能与IL-1β、IFN-β和ISG15转录水平抑制有关。 相似文献
14.
旨在分离感染PCV2的PK-15细胞分泌的外泌体,探讨其在PCV2感染淋巴细胞中的作用。提取PCV2感染PK-15细胞上清液中的外泌体,利用透射电镜观察外泌体形态、纳米颗粒跟踪分析测定外泌体粒径、Western blot检测外泌体标记蛋白分子（CD81、TSG101）;PKH67标记外泌体后检测细胞对外泌体的摄取;提取PCV2-外泌体基因组,检测PCV2 Rep和Cap基因;利用间接免疫荧光试验检测PCV2-外泌体感染PK-15细胞后PCV2病毒定位;通过绝对定量PCR检测PCV2-外泌体对淋巴细胞的感染率;利用CCK-8法检测淋巴细胞增殖;利用Annexin V-FITC/PI检测淋巴细胞凋亡率。透射电镜和外泌体粒径分析结果显示,PK-15细胞分泌的外泌体为双层膜的囊泡,直径30~200 nm;Western blot结果显示PK-15细胞分泌的外泌体存在特异性标记蛋白CD81和TSG101;外泌体摄取试验结果显示PCV2-外泌体能够被细胞摄取;PCR结果表明PCV2-外泌体基因组中含有PCV2 Rep和Cap基因;间接免疫荧光结果显示,与PCV2直接感染相比,PCV2-外泌体感染的淋巴细胞中,PCV2病毒拷贝显著升高,差异明显（P<0.01）,外泌体裂解后感染淋巴细胞能力与PCV2病毒无显著差异;PCV2-外泌体可显著抑制淋巴细胞增殖（P<0.01或P<0.05）;PCV2-外泌体显著提高淋巴细胞凋亡率。PCV2感染PK-15细胞的外泌体中携带病毒基因,感染淋巴细胞后使细胞增殖降低和细胞凋亡增加。 相似文献
15.
《畜牧兽医学报》2020,(7)
旨在分离感染PCV2的PK-15细胞分泌的外泌体,探讨其在PCV2感染淋巴细胞中的作用。提取PCV2感染PK-15细胞上清液中的外泌体,利用透射电镜观察外泌体形态、纳米颗粒跟踪分析测定外泌体粒径、Western blot检测外泌体标记蛋白分子(CD81、TSG101);PKH67标记外泌体后检测细胞对外泌体的摄取;提取PCV2-外泌体基因组,检测PCV2 Rep和Cap基因;利用间接免疫荧光试验检测PCV2-外泌体感染PK-15细胞后PCV2病毒定位;通过绝对定量PCR检测PCV2-外泌体对淋巴细胞的感染率;利用CCK-8法检测淋巴细胞增殖;利用Annexin V-FITC/PI检测淋巴细胞凋亡率。透射电镜和外泌体粒径分析结果显示,PK-15细胞分泌的外泌体为双层膜的囊泡,直径30～200 nm;Western blot结果显示PK-15细胞分泌的外泌体存在特异性标记蛋白CD81和TSG101;外泌体摄取试验结果显示PCV2-外泌体能够被细胞摄取;PCR结果表明PCV2-外泌体基因组中含有PCV2 Rep和Cap基因;间接免疫荧光结果显示,与PCV2直接感染相比,PCV2-外泌体感染的淋巴细胞中,PCV2病毒拷贝显著升高,差异明显(P0.01),外泌体裂解后感染淋巴细胞能力与PCV2病毒无显著差异;PCV2-外泌体可显著抑制淋巴细胞增殖(P0.01或P0.05);PCV2-外泌体显著提高淋巴细胞凋亡率。PCV2感染PK-15细胞的外泌体中携带病毒基因,感染淋巴细胞后使细胞增殖降低和细胞凋亡增加。 相似文献
16.
《动物医学进展》2021,42(10)
为研究血红素结合蛋白1(HEBP1)对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)复制的影响,应用CRISPR/Cas9技术建立HEBP1基因敲除的MDBK细胞系;用BVDV TC株感染HEBP1基因敲除的MDBK细胞,用免疫荧光染色检测BVDV双链RNA(dsRNA)水平,观察BVDV致细胞病变效应(CPE)情况,实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测BVDV 5′UTR mRNA水平,Reed-Muench测定病毒滴度变化。结果表明,成功构建HEBP1基因敲除的MDBK稳定细胞系,敲除效率为72.41%;敲除HEBP1基因显著性抑制BVDV 5′UTR mRNA和dsRNA积累,减弱BVDV感染靶细胞的CPE,降低BVDV滴度。说明敲除HEBP1基因显著性抑制BVDV的复制,为抗BVDV研究提供新的思路和药物靶点。 相似文献
17.
《畜牧兽医学报》2019,(11)
研究干扰素基因刺激因子(STING)基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响。用CRISPR/Cas9技术敲除猪肺巨噬细胞系(3D4/21)的STING基因,用T7核酸酶检测靶基因敲除效率,用细胞计数试剂盒检测基因敲除细胞的活力,用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组病毒PRV-GFP感染基因敲除细胞,用流式细胞术检测感染细胞的荧光强度,用定量RT-PCR检测PRV的gB、TK基因表达及其感染细胞的IL-1β、IFN-β、ISG15基因转录,用Western blot检测PRV gE蛋白表达水平,用病毒滴定法测定子代病毒滴度。结果显示:设计的3个STING基因外显子2特异sgRNA均能切割3D4/21细胞的靶序列,其中sgRNA3的基因编辑效率最高;对sgRNA1介导STING基因敲除系进行克隆化,获得基因敲除细胞系3株,基因敲除对细胞活力无影响;亲本细胞培养的PRV-GFP感染阳性细胞占80.77%,STING基因敲除细胞培养的PRV-GFP感染阳性细胞占95.55%;STING基因敲除对PRV基因表达具有促进作用,亲本3D4/21细胞的病毒滴度为10~(6.2) TCID_(50)·0.1 mL~(-1),STING基因敲除细胞的病毒滴度为10~(8.3)TCID_(50)·0.1 mL~(-1),病毒感染细胞的IL-1β、IFN-β和ISG15转录下调明显。STING基因敲除能促进PRV在3D4/21细胞中复制,可能与感染细胞的IL-β、IFN-β和ISG15表达抑制有关。 相似文献
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试验旨在研究伪狂犬病病毒(PRV)在NF-κB家族p65基因敲除细胞系中的复制规律。利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因定点修饰技术构建猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)p65基因稳定敲除细胞系。通过构建p65-sgRNA重组质粒,转染至HEK293T/17细胞,收取慢病毒,感染3D4/21细胞后利用嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7核酸酶检测敲除效率,再通过有限稀释法获得3D4/21-p65^-/-的稳定细胞系。CCK-8试剂盒检测3D4/21细胞中敲除p65基因后对细胞增殖的影响;流式细胞术检测PRV-GFP感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后病毒增殖的差异;实时定量PCR检测PRV感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、TK基因mRNA表达水平及PRV感染细胞诱导的IL-1β和IL-6基因mRNA水平表达的变化;Western blotting检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后子代病毒滴度。结果表明,sgRNA2和sgRNA3的基因编辑效率较高,对其进行克隆化培养进而获得敲除p65基因的稳定表达细胞系;CCK-8试剂盒检测细胞活力表明,p65基因敲除对细胞活力无影响;流式细胞仪检测表明,同一时间点PRV-GFP在3D4/21-p65^-/-中的增殖显著高于对照细胞;实时荧光定量PCR表明在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、TK基因的mRNA表达水平,而抑制了IL-1β、IL-6基因的mRNA表达;Western blotting结果表明,在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定结果表明,同一时间点PRV-QXX在3D4/21-p65^-/-细胞中子代病毒的复制显著高于对照细胞。以上结果均表明,p65基因敲除可促进PRV在3D4/21细胞中复制。 相似文献
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为了探究三方基序蛋白25(TRIM25)对脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)增殖的影响，在HEK-293T细胞上使用簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR/Cas9)基因编辑技术敲除TRIM25基因，并通过PCR测序和Western blot确认敲除效果，然后观察敲除细胞形态并利用试剂盒测定TRIM25缺失后细胞增殖速度的变化，确认敲除细胞与野生细胞无明显差异，用EMCV感染敲除细胞后，采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、病毒滴定测定和Western blot等方法测定病毒基因转录水平、蛋白表达情况。结果显示：感染EMCV后，敲除细胞与野生细胞相比，显著促进了病毒的转录水平、病毒蛋白的翻译水平和子代病毒的毒力(P<0.05)。综上，在HEK-293T细胞上，成功构建TRIM25缺失细胞系，且试验表明TRIM25的缺失有助于EMCV的复制。研究结果为后续TRIM25抗病毒机制研究提供了理论依据。 相似文献
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为探究天然免疫分子维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-I)在猪肠道组织中的表达情况，评价其在猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)致病机制中的作用。本研究经原核表达重组RIG-I蛋白(rRIG-1)并采用SDS-PAGE切胶纯化该蛋白，将其免疫大白兔制备兔RIG-I多克隆抗体，采用间接ELISA检测抗体效价。结果显示获得了效价可达1∶64 000的兔RIG-I多克隆抗体。利用该抗体经western blot检测SPF猪各肠道组织中RIG-I的表达。结果显示，制备的多克隆抗体可与猪各肠道中的RIG-I反应，且RIG-I在SPF猪空肠中的表达量最高。利用该抗体经western blot检测TGEV感染的ST细胞及猪空肠中RIG-I的表达水平。结果显示，TGEV感染后ST细胞中RIG-I的表达水平极显著高于空白对照细胞(P<0.01)；与正常SPF猪空肠相比，TGEV感染的SPF猪空肠组织中RIG-I蛋白的表达水平明显提高。表明TGEV感染后能够刺激细胞内源性及感染猪肠道组织中RIG-I蛋白的表达水平。将本研究构建的重组质粒p CAGGS-RIG-I-flag和RIG-I干扰RNA (siRIG-I)分... 相似文献