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【背景】 地磁场（geomagnetic field,GMF）并不是稳定不变的,其随时间和空间时刻变化。目前,随着对动物磁生物学研究的日益深入,基于实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术开展的磁响应基因转录表达谱研究有力促进了磁响应通路的鉴定和磁感受机制的揭示。【目的】 筛选近零磁场（near-zero magnetic field,NZMF）下短翅型灰飞虱（Laodelphax striatellus）稳定表达的内参基因,使对目的基因的定量分析更加准确。【方法】 迁飞性昆虫灰飞虱采自江苏省农业科学院试验田并在室内使用TN1三叶期稻苗进行扩繁（温度：（25.0±1.0）℃,相对湿度：70%—90%,光周期：14L﹕10D）。采用亥姆霍兹线圈室内模拟近零磁场（NZMF;＜500 nT）和地磁场（GMF;~50 000 nT）,人工模拟磁场强度有效处理空间为直径30 cm的球形空间,试验过程中严格控制除磁场强度外的环境因子（温度：（25.0±1.0）℃,相对湿度：75%,光周期：14L﹕10D）并利用磁通门计每日对人工模拟磁场进行校准和监测,灰飞虱连同TN1三叶期稻苗均置于试管中进行暴露处理,每隔两日与对照磁场中稻苗对调以避免稻苗潜在磁响应对灰飞虱的影响。利用Trizol法分别提取初羽化灰飞虱雌、雄成虫总RNA,检测各生物学重复RNA质量并调至含量一致,反转录为cDNA,利用qRT-PCR技术并结合常用内参筛选分析软件geNorm、NormFinder、BestKeeper以及在线综合分析系统RefFinder对在NZMF和GMF两种磁场强度下灰飞虱体内的内参基因稳定性进行评估筛选,其中,待评估的11个常用内参基因包括Actin1、Tubulin（α1TUB和α2TUB）、Elongation factor 1 alpha（EF-1α）、Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）、Ubiquitin（UBI）、Ribosomal protein S11（RPS11）、Ribosomal protein S15e（RPS15）、Ribosomal protein L8（RPL8）、Ribosomal protein L9（RPL9）和ADP ribosylation factor2（ARF2）。【结果】 不同磁场环境（NZMF vs. GMF）下,灰飞虱短翅雌成虫EF-1α和RPL9表达稳定性在geNorm和NormFinder两种评估方法中都居于前两位,与BestKeeper软件的结果略有差异,进而利用在线工具RefFinder对以上3种方法的评估结果进行稳定性综合排序,结果表明EF-1α稳定性最好,RPL9稳定性次之;灰飞虱短翅雄成虫中,基于geNorm、NormFinder和BestKeeper 3种评估方法,α2TUB和RPL9表达稳定性中均居于前两位,而Actin1表达稳定性虽在NormFinder和BestKeeper中处于前两位,但其在geNorm中稳定性较低,最后,通过在线工具RefFinder综合分析表明,α2TUB稳定性最好,RPL9稳定性次之。【结论】 明确了不同磁场强度（NZMF vs. GMF）下适用于灰飞虱短翅雌、雄成虫中稳定表达的内参基因,其中,若使用双内参系统,雌成虫中可使用EF-1α和RPL9搭配,雄成虫中可使用α2TUB和RPL9搭配,为稳定表达的内参基因系统。此外,RPL9在灰飞虱短翅型雌、雄成虫中均可作为稳定的单一内参基因使用。研究结果确保了对灰飞虱响应磁场强度变化研究中关键目的基因转录表达的准确定量,并为今后开展磁场强度变化下的转录表达谱分析提供了有力保障。 相似文献
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【目的】筛选大蒜在盐胁迫下的稳定内参基因,并分析1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因（AsACO）对盐胁迫和促生菌的响应表达特性,为深入探究促生菌的促生机制及大蒜对盐胁迫的响应机制研究提供理论参考。【方法】以乐都紫皮大蒜为试材,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测5个内参基因ACT、UBC、HIS3、18S rRNA、TUB在盐胁迫下的表达稳定性,结合GeNorm、NormFinder和BestKeeper筛选出最稳定的内参基因,并分析恶臭假单胞菌UW4对盐胁迫下AsACO基因表达的影响。【结果】 5个候选内参基因引物的特异性强、无引物二聚体。GeNorm分析得出候选内参基因稳定性排名为18S rRNA=TUB>HIS3>UBC>ACT,NormFinder分析得出内参基因稳定性排名为18S rRNA>HIS3>TUB>UBC>ACT,BestKeeper分析得出内参基因稳定性排名为UBC>HIS3>18S rRNA>TUB>ACT,最终以几何平均数综合分析得出18S rRNA为最稳定的内参基因。以18S rRNA为内参基因,检测出AsACO基因表达具有明显的组织特异性,在叶片中的相对表达量明显高于根。整个处理过程中,盐胁迫明显诱导AsACO基因在不同处理时间及不同组织中表达上调,根和叶片中AsACO基因的相对表达量分别在2 d和12 h时达最高,较正常培养（CK）分别显著升高124.43%和238.34%（P<0.05,下同）,与盐胁迫处理相比,盐胁迫+浇施恶臭假单胞菌UW4处理显著降低AsACO基因在不同处理时间根和叶片中的相对表达量,其中在2 d和12 h时降幅较大,分别降低了112.08%和343.34%。【结论】18S rRNA是盐胁迫下大蒜中最稳定的内参基因。盐胁迫可诱导大蒜根和叶片中AsACO基因的上调表达,从而间接促进ACO和乙烯水平升高,加速由乙烯调控的细胞衰老,甚至死亡,但盐胁迫下恶臭假单胞UW4具有抑制AsACO基因表达的作用,以减少ACO和乙烯的合成,从而延缓大蒜细胞衰老,提高逆境耐受性。 相似文献
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【目的】对比大豆Pre-miRNAs候选内参基因和传统内参基因的表达稳定性,筛选出适合盐、碱胁迫条件下RT-qPCR分析的最稳定内参基因。【方法】选用了6个保守的Pre-miRNAs基因和4个常规的内参基因作为候选内参基因,通过RT-qPCR的方法,利用GeNorm和NormFinder软件,评价了10个候选内参基因在大豆盐、碱胁迫条件下的稳定性。【结果】大豆盐胁迫下,叶中表达最稳定的基因组合是Pre-miR166和Pre-miR172,表达最稳定的单一基因是FboX;根中表达最稳定的基因组合是Act11和EF1A,表达最稳定的单一基因是Act11。大豆碱胁迫下,叶中表达最稳定的基因组合是Pre-miR393和Pre-miR172,表达最稳定的单一基因是Pre-miR393;根中表达最稳定的基因组合是Act11和60S,表达最稳定的单一基因是Pre-miR172。【结论】大豆Pre-miRNAs可以与传统内参基因一样作为内参定量目的基因。 相似文献
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【目的】为研究蔷薇属植物响应黑斑病侵染的稳定表达的最适内参基因，解析茉莉酸在蔷薇属植物响应蔷薇盘二孢侵染过程中的作用。【方法】以黑斑病病原菌蔷薇盘二孢侵染的6个蔷薇属种/品种不同时间的离体叶片为材料，利用qRT-PCR技术及geNorm、NormFinder、BestKeeper软件对9个候选内参基因（ACT、GAPDH、PP2A、Rcl2、SAND、TIP、TUA、TUB、UBC）的表达量进行测定和分析，利用筛选出的内参基因，对蔷薇属植物茉莉酸（JA）抗病途径相关基因（COI1、OPR3、MYC2、JAR1）的表达水平进行定量分析。【结果】（1）UBC可作为6种蔷薇属植物共同适用的内参基因，可用于后续分析JA抗病途径相关基因的表达水平。（2）内源JA含量在6种蔷薇属植物响应蔷薇盘二孢侵染的过程中存在差异。在黑斑病高抗植物受侵染0～4 d间JA含量下调，4～8 d间上调。在黑斑病易感植物受侵染0～8 d间，内源JA含量呈下调趋势。（3）JA合成相关基因OPR3及JAR1表达量在受侵染初期表达量趋势存在差异。在除荷花蔷薇外的其余5种植物中，OPR3在侵染初期（0～0.5 d）表达下调，J... 相似文献
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在分析青花菜花蕾发育过程长链非编码RNA(LncRNAs)的表达中，筛选稳定表达的内参基因至关重要。通过前期高通量测序筛选出16个候选内参基因，利用qRT-PCR技术检测其表达水平，并结合geNorm、NormFinder和BestKeeper 3个软件对16个LncRNAs在青花菜花蕾不同部位和不同发育时期的表达稳定性进行分析。结果表明，在花蕾不同部位中，geNorm算法认为XLOC＿000400、XLOC＿008536、XLOC＿034059为最适内参基因；NormFinder计算XLOC＿021473、XLOC＿000400、XLOC＿034059为最佳内参基因；BestKeeper显示XLOC＿025578表达最稳定。在花蕾不同发育时期中，geNorm算法认为XLOC＿000108、XLOC＿039609、XLOC＿021473为最适内参基因；NormFinder计算XLOC＿021473、XLOC＿039609、XLOC＿000108为最佳内参基因；BestKeeper显示XLOC＿034059表达最稳定。综合评估后，在花蕾不同部位和不同发育时期中适宜的内参基因对分别为XLO... 相似文献
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【目的】通过分析大豆中候选内参基因的稳定性,筛选大豆干旱胁迫处理条件下适合成熟miRNA、前体miRNA及靶基因mRNA荧光定量PCR的内参基因。【方法】以干旱胁迫处理后的大豆根和叶片为材料,选择了5个成熟miRNAs和5个传统的看家基因作为候选内参基因,利用GeNorm和NormFinder程序对10个候选内参基因的稳定性进行评价。【结果】在干旱胁迫下,大豆根、叶片中,成熟miRNA定量最合适的单个内参基因分别为miR156a、miR167a,最合适的内参基因组合分别为miR1520d与miR156a、miR1520d与miR167a。前体miRNA和靶基因mRNA定量最合适的单个内参基因分别为Fbox、Act11,最合适的内参基因组合分别为Act11与Fbox、Act11与EF1A。【结论】筛选出大豆干旱胁迫条件下成熟miRNA、前体miRNA及其对应靶基因mRNA的荧光定量PCR的内参基因,最稳定内参基因数目为2个。 相似文献
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为了筛选桂花Osmanthus fragrans不同组织基因表达分析中适合的内参基因,以桂花‘堰虹桂’O. fragrans‘Yanhong Gui’花蕾、盛开花序、嫩叶、成熟叶和1年生茎等5个不同组织为材料,利用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测7个候选内参基因的表达水平,并利用geNorm,NormFinder和BestKeeper软件对各候选内参基因的表达稳定性进行评价,最后利用桂花不同组织中OfCRTISO1基因相对表达水平验证筛选的内参基因的可靠性。结果表明:综合3个软件的评价排序,确定不同组织中最佳内参基因为OfRAN1和OfUBC2,而Of18S是最差内参基因。OfCRTISO1基因相对表达水平分析证实,不同组织中qRT-PCR分析使用OfRAN1和OfUBC2等2个表达最稳定的基因组合,即可获得更为精确的基因表达结果。旨在为桂花组织间重要基因的定量表达分析提供科学依据。图 4 表 4 参34 相似文献
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【目的】研究盐胁迫下盐穗木生长素通路中miR393b和预测的靶基因TIR1的表达模式和相关性。【方法】采用生物信息学方法预测盐穗木miR393b的靶基因;通过qRT-PCR方法检测盐胁迫下盐穗木miR393b及预测靶基因HcTIR1(transport inhibitor response1)的相对表达模式,并分析其相关性。【结果】miR393b成熟体在不同植物种中高度保守;盐穗木miR393b预测的靶基因为TIR1;盐胁迫处理,盐穗木同化枝中两基因响应高盐胁迫,并具有一定的负相关性。【结论】盐穗木miR393b和预测的靶基因响应高盐胁迫,二者具有一定的负相关。该结果为进一步探讨盐穗木miR393b与预测靶基因TIR1的生物学功能奠定基础。 相似文献
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实时定量PCR(qRT-PCR)是分析功能基因表达水平的常用方法之一,qRT-PCR数据统计分析离不开合适内参基因的选择。为了选择中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus, CWMV)侵染条件下的小麦内参基因,本实验通过PCR扩增效率和扩增特异性分析,从10个持家基因中选择8个候选基因,然后以接种CWMV的小麦样品为材料,利用qRT-PCR技术进一步检测上述8个基因在CWMV侵染条件下小麦样品中的时空表达特性。基于这些数据,通过geNorm、NormFinder程序分析,结果表明,2个小麦基因(即26S和CDC)在CWMV侵染前后以及不同组织中表达最为稳定,26S和CDC组合可选作CWMV与小麦互作过程中功能基因表达分析的内参基因。 相似文献
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【目的】实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）以高灵敏度和特异性等优点，成为基因表达分析的主要工具，而选择适合不同条件下工作的内参是qRT-PCR分析的前提。筛选得到适用于杜鹃红山茶不同器官、不同时期花瓣的qRT-PCR分析的内参基因，为后续相关基因功能研究提供可用的内参基因。【方法】选择转录延伸因子编码基因（EF1α）、α-tubulin（TUA）、β-tubulin（TUB）、Ubiquitin（UBQ）、肌动蛋白（Actin）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）6个看家基因，使用2种不同的计算程序GeNorm和NormFinder评估了6个基因表达的稳定性。进一步通过CaGASA3基因的表达模式验证了所选内参基因的适用性。【结果】在不同器官中通过GeNorm和NormFinder筛选出稳定性最好的基因，排名前2位的均为TUA和GAPDH，GAPDH基因在两种计算程序评估中稳定性均最佳。而在不同时期花瓣中，通过2种程序得出排名前2位的内参基因均为TUB和UBQ；UBQ基因在GeNorm程序评估中稳定性最好，TUB基因在NormFinder程序的评估中稳定性最佳。【结论】杜鹃红山茶不同器官中最佳内参基因为TUA和GAPDH，不同时期花瓣中最适内参基因为TUB和UBQ。 相似文献
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【目的】以世界性害虫马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）为研究对象,筛选其参与噻虫嗪解毒的细胞色素P450主效基因。【方法】于2018、2019年利用点滴法监测新疆察布查尔县、伊宁县、塔城市、乌鲁木齐市和吉木萨尔县11个马铃薯甲虫田间种群对噻虫嗪的抗性水平,并测定分析噻虫嗪LD50处理72 h后成虫中3种主要解毒酶细胞色素P450酶（P450）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）和酯酶（EST）的活性变化。利用Illumina HiSeqTM 2500 高通量测序技术进行转录组测序,获得抗性和敏感种群之间的差异表达基因（DEG）,运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术验证3个P450基因并分析6个P450基因（CYP4C1、CYP9e2、CYP305a1、CYP9Z25、CYP9Ya和CYP9Yc）在不同种群及噻虫嗪处理后的表达情况。【结果】抗性监测发现,2018年的YN1、URMQ1、TC和QPQL1以及2019年的YN2和JMS种群成虫对噻虫嗪抗性倍数（RR）分别达到5.99、8.81、10.86和20.33倍和11.82、14.05倍,为低至中水平抗性。解毒酶活性测定结果表明,2个敏感种群URMQ2、URMQ3以及2个抗性种群YN2、JMS成虫分别经噻虫嗪LD50处理72 h后其P450活性均显著增加,分别为对照的1.76、2.75、1.91和1.66倍。另外,URMQ3种群的GST（CDNB和DCNB为底物）及URMQ2、YN2种群的EST活性显著升高,分别为对照的1.19、2.10倍和1.35、1.91倍。转录组分析表明,通过合并组装分别获得噻虫嗪敏感和抗性种群样品56 872 051和62 249 136个原始序列数据以及55 903 706和61 082 076个过滤后的序列数据,过滤后的序列长度分别为8.39和9.16 G,碱基错误率均为0.03%。抗性种群中差异表达的P450基因13个,其中2个基因显著上调。3个上调的P450基因CYP4C1、CYP9e2和CYP305a1的qRT-PCR检测结果与转录组测序结果基本一致,qRT-PCR分析还发现CYP9Ya、CYP9Yc、CYP4C1、CYP305a1和CYP9Z25在抗性种群成虫中表达量显著增加,噻虫嗪LD50处理均可引起URMQ2种群4龄幼虫和成虫CYP9Ya、CYP9Yc表达量显著上调。相关性分析发现成虫对噻虫嗪的抗性水平与CYP9Ya表达量呈显著正相关。【结论】CYP9Ya可能在马铃薯甲虫中对噻虫嗪具有重要的解毒作用,其他基因的作用也不能排除。 相似文献
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目的 扩展蛋白（Expansin）是细胞壁的重要组成部分,在植物的生长发育及逆境胁迫应答等方面均发挥着重要作用。基于全基因组水平系统鉴定陆地棉Expansin基因家族,并通过生物信息学及表达模式分析,为揭示扩展蛋白基因在棉花生长发育中的功能及后续利用奠定基础。方法 利用BLAST和HMMER在陆地棉基因组中搜索并鉴定扩展蛋白基因家族成员;利用ClustalW、MEGA、MCScanX、Prot Param、MEME、SignalP、Euk-mPLoc、FancyGene和DnaSP等软件对其基因序列和蛋白序列进行生物信息学分析。通过RNA-seq数据分析扩展蛋白基因的表达模式和部分同源基因间表达差异,利用qRT-PCR验证部分扩展蛋白基因的表达谱。结果 陆地棉基因组中含有46个EXPA基因、8个EXPB基因、6个EXLA基因和12个EXLB基因,合计72个Expansin基因;四倍体陆地棉中扩展蛋白成员的数量几乎是二倍体棉种（亚洲棉与雷蒙德氏棉）的2倍。除GhA02和GhD06 2个染色体外,其余各染色体上均分布有数目不等的扩展蛋白基因（2—4个）,具有部分同源关系的染色体GhA08和GhD08分别有5个和8个扩展蛋白基因。系统发育树显示,各亚家族成员聚集成群,并且大部分的末端分支均由来源于3个物种的4个（亚）基因组的4个基因组成,如EXPA亚家族的Cotton_A_28454/Gh_A03G0885/Gh_D02G1269/Gorai. 005G142200等等,4个基因之间具有同线性关系。亚细胞定位发现陆地棉所有的扩展蛋白均位于细胞外。基因结构分析显示,扩展蛋白基因由3—5个外显子组成,外显子-内含子结构在进化上高度保守且与氨基酸序列的多样性一致,且在外显子上存在密码子偏好性。RNA-seq数据显示,不同基因在不同时空条件下存在特异性表达,如GhEXPA19A和GhEXPA19D相比其他基因在纤维10 DPA和20 DPA中的表达量很高;在不同的组织（如子叶、新叶、老叶、苞叶）中,GhEXPA24D具有较高的表达量。部分同源基因之间具有不同的表达模式,显示它们之间功能的异化与互补。qRT-PCR结果与RNA-seq数据基本吻合,如GhEXLA3A和GhEXLA3D在纤维发育的伸长阶段高量表达。GhEXPA19D和GhEXLA2D在3DPA的胚珠中表达活跃。结论 陆地棉基因组中含72个扩展蛋白基因,其在DNA水平和氨基酸水平具有一致的结构多样性和进化保守性,在转录水平具有各异的表达模式,显示出家族内成员间功能上的异化与互补。 相似文献
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黄瓜幼苗下胚轴长度GWAS分析及候选基因挖掘 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】挖掘与黄瓜幼苗下胚轴长度显著相关的SNP位点及候选基因,为揭示下胚轴长度的遗传基础和分子机制提供理论依据,为短下胚轴分子标记辅助选择育种奠定基础。【方法】以95份黄瓜核心种质为试验材料,分别于2016年春季、2017年春季、2017年秋季和2018年春季在中国农业科学院南口试验基地塑料大棚进行种植,在两叶一心期调查黄瓜幼苗的下胚轴长度;利用Structure 2.3.4软件分析群体结构,Haploview 软件分析连锁不平衡的衰减;基于最优模型对下胚轴长度进行全基因组关联分析（GWAS）,依据关联SNP位点的LD区间序列,预测与下胚轴长度相关的重要关联候选基因,并利用荧光定量PCR对预测基因进行表达模式分析。【结果】共检测到8个显著关联的位点（Hl1.1、Hl1.2、Hl2.1、Hl3.1、Hl3.2、Hl4.1、Hl5.1、Hl6.1）,分别位于1、2、3、4、5、6号染色体,其中,Hl2.1、Hl3.1、Hl3.2、Hl5.1、Hl6.1等5个位点被重复检测到两次以上。通过分析关联SNP位点的LD区间序列,获得Csa1G074930、Csa1G475980、Csa2G381650、Csa3G141820、Csa4G051570、Csa3G627150、Csa5G174640、Csa6G362970 8个与黄瓜下胚轴长度有关的候选基因,其中既有光形态建成、泛素化、激素信号通路等调控基因,也有调控网络下游参与细胞生长发育,调节细胞大小,直接调控黄瓜下胚轴长度的基因。多基因在不同黄瓜材料中的有机分布,形成了具有不同下胚轴长度的黄瓜种质。基因表达分析显示Csa1G074930、Csa1G475980、Csa2G381650、Csa4G051570、Csa5G174640在短下胚轴材料中高表达。Csa3G141820、Csa3G627150在长下胚轴材料中高表达。【结论】检测到Hl1.1、Hl1.2、Hl2.1、Hl3.1、Hl3.2、Hl4.1、Hl5.1、Hl6.1等8个与黄瓜下胚轴长度密切关联的SNP位点,挖掘到Csa1G074930、Csa1G475980、Csa2G381650、Csa3G141820、Csa4G051570、Csa3G627150、Csa5G174640、Csa6G362970等8个调控下胚轴长度的候选基因。 相似文献
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【目的】花色变异对丰富观赏植物花色具有重要意义,但由于花色变异的不确定性,使其变异机理尚未弄清。荷兰鸢尾是重要球根观赏植物,通过探索荷兰鸢尾蓝紫色野生型‘展翅’及白色突变株‘玉妃’的显色分子机制及色素积累差异,为花色变异机理提供依据。【方法】本研究通过超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱联用（UHPLC-QTOF-MS）方法测定荷兰鸢尾2个品种花的花色素苷和黄酮醇的种类及含量。以荷兰鸢尾‘展翅’和‘玉妃’的旗瓣为材料,通过转录组测序,筛选花色素苷合成相关差异基因。以2个品种花发育不同时期为材料,对差异基因进行荧光定量PCR验证。【结果】代谢组分析结果表明,飞燕草素和矢车菊素及其衍生物在蓝紫色花中积累,在白色花中几乎没有积累,而黄酮醇类物质在白色‘玉妃’中含量上升。RNA-seq结果表明,共获得46 485个unigenes,其中27 073个unigenes被公共数据库功能注释,占全部unigenes的58.24%。获得701个差异表达基因,其中485个基因在‘玉妃’中上调表达,216个基因在‘玉妃’中下调表达。花色素苷途径中,2个二氢黄酮醇-4-还原酶（dihydroflavonol 4-reductase,DFR）基因和1个黄酮醇合成酶（flavonol synthase,FLS）基因有差异表达,分别命名为IhDFR1、IhDFR2和IhFLS1。白色‘玉妃’中,IhDFR1和IhDFR2下调表达,IhFLS1上调表达,导致花色素苷含量显著降低和黄酮醇积累,使代谢流由花色素苷转向黄酮醇。3个基因的qRT-PCR结果显示,IhDFR1和 IhDFR2在蓝紫色花中随着花的发育表达量升高,在白色花中均低表达,IhFLS1在白色花中随着花的发育表达量升高,在蓝紫色花中均低表达,与RNA-seq结果保持一致。【结论】白色‘玉妃’中,IhDFR1和IhDFR2的低表达,及IhFLS1的高表达,使花色素苷积累受阻,部分代谢流由花色素苷转向黄酮醇,导致花色由蓝紫变为白色。 相似文献
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【目的】热激蛋白（heat shock protein,HSP）是一种在生物体内广泛存在且高度保守的蛋白质,在生物抗逆过程中发挥重要作用。当生物体遭受不利环境条件胁迫时,其迅速产生可保证生物体的正常生理活动。本研究以重大检疫害虫马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）为研究对象,对其热激蛋白HSP70基因（Ld-hsp70）进行克隆,并对其在温度胁迫下的表达特性进行分析,明确HSP70在马铃薯甲虫温度胁迫中的作用。【方法】基于NCBI数据库检索筛选马铃薯甲虫HSP70的cDNA序列,利用RT-PCR和RACE技术对Ld-hsp70的全长cDNA进行克隆;利用DNAMAN软件对其全长序列进行拼接;采用生物信息学方法对Ld-hsp70及其编码氨基酸的序列特性进行分析;使用MEGAX软件的邻接法（neighbor-joining,NJ）构建马铃薯甲虫HSP70与其他昆虫HSP70的系统进化树;利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对Ld-hsp70在不同温度胁迫条件下的表达模式进行分析;利用Primer 5.0软件设计试验所用的特异性引物。【结果】基于NCBI数据库获得3类马铃薯甲虫HSP70 cDNA序列,分别命名为HSP70a、HSP70b和HSP70c,经克隆、拼接获得其全长序列,分别命名为Ld-hsp70a、Ld-hsp70b和Ld-hsp70c,GenBank登录号分别为KC544268、KC544269和KC544270。序列分析表明,3个Ld-hsp70编码的氨基酸序列均包含了完整保守结构域和3段保守的HSP70家族签名序列,且在氨基酸C末端具有保守的亚细胞定位基序。Ld-hsp70a和Ld-hsp70c的氨基酸C末端具有保守基序EEVD,属于胞质型热激蛋白;Ld-hsp70b的氨基酸C末端具有保守基序KDEL,属于内质网型热激蛋白。系统进化树分析显示,Ld-hsp70a和Ld-hsp70b与其他物种的HSP70分别聚为一支,Ld-hsp70c与已报道的马铃薯甲虫HSP70聚为一支。其中,Ld-hsp70a与龟纹瓢虫（Propylaea japonica）的Pj-hsp70,Ld-hsp70b与稻水象甲（Lissorhoptrus oryzophilus）的Lo-hsp70,Ld-hsp70c与大猿叶甲（Colaphellus bowringi）的Cb-hsp70同源性最高。qRT-PCR结果表明,高、低温均能诱导马铃薯甲虫雌、雄成虫的3个Ld-hsp70的表达。不同温度胁迫处理1 h后,马铃薯甲虫雌、雄成虫体内3个Ld-hsp70的相对表达量未见显著变化;而4 h后,马铃薯甲虫雌、雄成虫Ld-hsp70a的相对表达量与对照相比分别在低温-10℃和高温44℃时显著上调至2.24和2.41倍,Ld-hsp70b和Ld-hsp70c相对表达量在胁迫4 h后与对照相比差异均不显著。另外,无论是雌虫还是雄虫,3个Ld-hsp70的相对表达量在同一温度不同的胁迫处理时间之间均无显著差异。【结论】Ld-hsp70a可以响应高、低温胁迫,可能在马铃薯甲虫抵御温度胁迫中发挥作用,而Ld-hsp70b和Ld-hsp70c对高、低温均不敏感,表明马铃薯甲虫3个Ld-hsp70在抗温度胁迫中发挥不同的作用。 相似文献
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【目的】 从大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）中鉴定木糖苷酶基因,研究其与大丽轮枝菌致病力的关系,为解析大丽轮枝菌致病分子机制提供理论依据,同时为制定更好的棉花黄萎病防治策略提供科学依据。【方法】 利用生物信息学方法从大丽轮枝菌基因组数据库中鉴定全部木糖苷酶基因,并对基因编码蛋白的结构域、基因的染色体定位及进化关系等进行分析。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测木糖苷酶基因在不同抗/感棉花品种根系分泌物培养0、6、12、24和48 h大丽轮枝菌中的表达量。利用寄主诱导的基因沉默（host-induced gene silencing,HIGS）技术对木糖苷酶基因VdxyL3在大丽轮枝菌侵染过程中的功能进行初步分析。将VdxyL3的目标片段转化棉花,采用伤根法接种大丽轮枝菌Vd991,观察转化植株的表型,调查病情指数,同时利用qRT-PCR技术对植株中真菌生物量和VdxyL3的表达量进行检测。【结果】 利用生物信息学方法从大丽轮枝菌中查找出13个木糖苷酶基因（VdxyL1—VdxyL13）,其编码序列长度介于1 461—2 544 bp,蛋白质分子量介于38.78—90.97 kD,理论等电点介于4.67—5.89。结构域和进化树分析发现13个木糖苷酶基因中包括9个糖苷水解酶43家族成员、1个3家族成员和3个31家族成员。染色体定位分析发现13个基因分布在6条染色体上,未形成基因簇。qRT-PCR结果发现选取的6个基因均受到根系分泌物的诱导,在一种或多种根系分泌物中培养6 h或12 h后,表达量均明显升高,然后降低。其中VdxyL3受海岛棉根系分泌物诱导后表达量明显升高,表明该基因的表达明显受海岛棉根系分泌物的诱导。HIGS研究结果表明,接菌14 d和21 d后转化VdxyL3基因干扰片段的棉花发病明显较重,其病情指数（33.3和83.9）明显高于空载体对照（21.7和66.1）。qRT-PCR分析发现转化VdxyL3基因干扰片段的棉花植株茎中VdxyL3的表达量明显低于空载体对照,真菌生物量显著多于对照。【结论】 利用HIGS技术将VdxyL3基因沉默后,棉株的抗病性明显降低,表明VdxyL3在大丽轮枝菌致病及宿主-病原体互作过程中可能发挥着重要的作用。 相似文献
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【目的】TET（ten-eleven translocation）家族蛋白在调控胚胎和胎盘发育等过程中具有重要作用,输卵管与子宫内膜细胞的死亡平衡会影响受精卵及早期胚胎的发育。因此探讨TETs、细胞程序性死亡相关基因和附植相关基因在妊娠早期山羊输卵管及子宫角中的表达规律及其潜在调控作用,以期为研究胚胎发育及附植的分子机制奠定基础。【方法】以合川白山羊为研究对象,采集妊娠19d（P19）山羊子宫角及输卵管组织,以空配19d（C19）为对照,利用H.E染色观察C19组和P19组山羊子宫角组织形态,利用qRT-PCR技术检测了胚胎附植相关基因（WNT5a、OPN、VEGFA）、TETs（TET1、TET2、TET3）、细胞程序性死亡相关基因（凋亡相关基因（BAX、BCL2、Caspase9）、焦亡相关基因（GSDMD、NLRP3、Caspase1）和炎症相关基因（NF-kB、TNF-α））的相对表达,并分析了TETs及细胞程序性死亡相关基因在输卵管和子宫角组织的表达相关性。【结果】H.E染色结果显示,在P19组中山羊子宫角的腺体增多,形态多变。qRT-PCR结果显示,OPN在P19组山羊子宫角中的表达量极显著高于C19组（P＜0.01）,BAX/BCL2的表达量显著增加（P＜0.05）,而WNT5a和 VEGFA表达差异不显著;TET1、TET2、TET3在山羊子宫角及输卵管中均有表达,在C19组和P19组山羊子宫角中TET1及TET2的表达量极显著高于C19组和P19组中TET3的表达（P＜0.01）;在P19组山羊输卵管中TET2（P＜0.01）、NF-kB（P＜0.01）、Caspase1（P＜0.01）、GSDMD（P＜0.05）显著增高。相关性分析表明,输卵管中TET2与TET3（P＜0.01）、NF-kB（P＜0.01）、Caspase9（P＜0.05）显著正相关;子宫角中,TET3与VEGFA（P＜0.05）、WNT5a（P＜0.01）显著负相关,胚胎附植关键基因OPN与Caspase1（P＜0.01）、NLRP3（P＜0.05）、GSDMD（P＜0.05）显著正相关,而细胞焦亡关键基因GSDMD在输卵管与子宫角中均与Bax（P＜0.05）、Caspase1（P＜0.01）、NLRP3（P＜0.05）呈显著正相关。【结论】在妊娠早期山羊子宫角和输卵管中TETs表达与细胞程序性死亡部分基因表达具有一定的相关性,推测TETs与细胞凋亡或焦亡的发生对输卵管、受精卵、早期胚胎及子宫的发育具有一定的调控作用。胚胎附植关键基因OPN与焦亡相关基因显著相关,暗示妊娠早期子宫角中细胞焦亡的发生可能参与胚胎附植。为研究TETs通过细胞程序性死亡相关基因在妊娠早期输卵管及子宫角中的表达规律提供了理论参考。 相似文献