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1.
【目的】菌核病是由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的一类真菌病害,核盘菌寄主范围广泛,严重危害多种作物的品质。本研究利用寄主诱导基因沉默（HIGS）的方法在寄主中诱导核盘菌致病相关基因的沉默从而增强寄主的菌核病抗性,为菌核病抗病育种提供新的思路。【方法】铜锌超氧化物歧化酶是一种重要的抗氧化剂,以核盘菌铜锌超氧化物歧化酶铜伴侣基因（copper chaperone for copper/zinc superoxide dismutase,SsCCS）为靶基因,通过生物信息学分析该基因的结构特点,并利用MEGA6.0软件构建系统发育树;通过分别比对拟南芥及核盘菌基因组,选择特异的干扰片段进行扩增;采用农杆菌介导的浸花序法,将HIGS载体转入拟南芥Col-0,通过DNA鉴定以及标记筛选出稳定的HIGS-CCS转基因拟南芥;选取4—5周龄的HIGS-CCS转基因拟南芥植株叶片接种核盘菌野生菌株1980,于接种24 h后统计病斑面积,分析转基因株系的菌核病抗性;通过qRT-PCR分析核盘菌侵染转基因植株过程中SsCCS的表达情况;同时在接种6、12、24 h后利用DAB染色的方法检测转基因植株与核盘菌互作过程中H2O2的积累。【结果】生物信息学分析结果表明,SsCCS（SS1G_00102）全长为1 010 bp,编码序列长759 bp,共编码253个氨基酸,该蛋白分子质量为27 176.96 Da,等电点（PI）为5.04,与灰霉病菌BcCCS（EDN25358）亲缘关系最近,氨基酸同源性达到87%,与拟南芥AtCCS（AT1G12520.1）亲缘关系较远;通过与核盘菌以及拟南芥基因组比对,选择314 bp特异干扰片段,成功构建SsCCS的HIGS表达载体,转化拟南芥。T1及T2代转基因拟南芥接种核盘菌24 h后的病斑面积均小于野生型拟南芥。从T2代中获得3个稳定表达的T3代HIGS-CCS转基因拟南芥株系：HIGS-CCS-5、HIGS-CCS-8、HIGS-CCS-13;与野生型拟南芥相比,转基因拟南芥在接种核盘菌24 h后,病斑面积显著减小46%—61%;qRT-PCR结果显示核盘菌在侵染转基因植株过程中,SsCCS的表达量显著低于侵染野生型拟南芥。DAB染色结果表明,在侵染过程中,转基因拟南芥植株中H2O2的积累明显少于野生型拟南芥,ROS水平降低。【结论】利用HIGS方法在拟南芥中干扰核盘菌SsCCS的表达能够显著提高拟南芥的抗病性,研究结果为油菜等农作物菌核病抗病改良提供了参考。 相似文献
2.
《中国农业科学》2020,(4)
【目的】菌核病是由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的一类真菌病害,核盘菌寄主范围广泛,严重危害多种作物的品质。本研究利用寄主诱导基因沉默(HIGS)的方法在寄主中诱导核盘菌致病相关基因的沉默从而增强寄主的菌核病抗性,为菌核病抗病育种提供新的思路。【方法】铜锌超氧化物歧化酶是一种重要的抗氧化剂,以核盘菌铜锌超氧化物歧化酶铜伴侣基因(copper chaperone for copper/zinc superoxide dismutase,SsCCS)为靶基因,通过生物信息学分析该基因的结构特点,并利用MEGA6.0软件构建系统发育树;通过分别比对拟南芥及核盘菌基因组,选择特异的干扰片段进行扩增;采用农杆菌介导的浸花序法,将HIGS载体转入拟南芥Col-0,通过DNA鉴定以及标记筛选出稳定的HIGS-CCS转基因拟南芥;选取4—5周龄的HIGS-CCS转基因拟南芥植株叶片接种核盘菌野生菌株1980,于接种24 h后统计病斑面积,分析转基因株系的菌核病抗性;通过qRT-PCR分析核盘菌侵染转基因植株过程中SsCCS的表达情况;同时在接种6、12、24 h后利用DAB染色的方法检测转基因植株与核盘菌互作过程中H2O2的积累。【结果】生物信息学分析结果表明,SsCCS(SS1G_00102)全长为1 010 bp,编码序列长759 bp,共编码253个氨基酸,该蛋白分子质量为27 176.96 Da,等电点(PI)为5.04,与灰霉病菌BcCCS(EDN25358)亲缘关系最近,氨基酸同源性达到87%,与拟南芥AtCCS(AT1G12520.1)亲缘关系较远;通过与核盘菌以及拟南芥基因组比对,选择314 bp特异干扰片段,成功构建SsCCS的HIGS表达载体,转化拟南芥。T1及T2代转基因拟南芥接种核盘菌24 h后的病斑面积均小于野生型拟南芥。从T2代中获得3个稳定表达的T3代HIGS-CCS转基因拟南芥株系:HIGS-CCS-5、HIGS-CCS-8、HIGS-CCS-13;与野生型拟南芥相比,转基因拟南芥在接种核盘菌24 h后,病斑面积显著减小46%—61%;qRT-PCR结果显示核盘菌在侵染转基因植株过程中,SsCCS的表达量显著低于侵染野生型拟南芥。DAB染色结果表明,在侵染过程中,转基因拟南芥植株中H2O2的积累明显少于野生型拟南芥,ROS水平降低。【结论】利用HIGS方法在拟南芥中干扰核盘菌SsCCS的表达能够显著提高拟南芥的抗病性,研究结果为油菜等农作物菌核病抗病改良提供了参考。 相似文献
3.
【背景】隔膜蛋白Septin广泛存在于除植物以外所有真核生物中,是高度保守的GTP结合蛋白家族,被认为是继微管、微丝和中间纤维之后的第4种细胞骨架蛋白。病原真菌的Septin蛋白参与细胞极性的确定、形态塑造及与致病相关的形态转换。【目的】鉴定玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）Septin基因家族,并进一步分析其在不同发育时期的表达模式,为明确隔膜蛋白Septin与真菌侵染结构发育之间的关系打下基础。【方法】以玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）中6个Septin蛋白的氨基酸序列为探针,在玉米大斑病菌数据库在线Blastp比对和关键词搜索,获得大斑病菌的候选Septin,对其基因结构、理化性质以及跨膜区结构等方面进行生物信息学分析。收集人造疏水介质诱导下侵染结构发育不同时期以及侵染感病寄主叶片不同时间的玉米大斑病菌材料,利用实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR）技术系统分析Septin基因家族在玉米大斑病菌侵染结构形成不同阶段的转录水平。【结果】获得了玉米大斑病菌6个候选Septin,其中4个核心Septin,均含有G1、G3、G4基序,分别将其命名为StSep1、StSep2、StSep3、StSep4。在人造疏水介质诱导下,Septin表达水平均呈上升趋势。StSep1在芽管形成后期表达最活跃,其表达量达到分生孢子时期的25.69倍（P<0.01）,StSep4的表达水平在附着胞发育后期到达高峰,随后表达逐渐下调。该基因家族在病菌侵染寄主叶片过程中的转录水平变化趋势与其在人造疏水介质诱导下的表现趋于一致。StSep1在接种后6 h转录水平极显著上调（P<0.01）,随着时间延长,表达水平下降,StSep4在附着胞形成阶段表达活跃,表达量在接种后18 h达到高峰值,之后表达下调,但仍高于萌发初期。StSep2、StSep3在接种后18 h和24 h表达活跃,高于萌发初期。【结论】玉米大斑病菌基因组中含有4个核心Septin,StSep1和StSep4分别在芽管和附着胞形成时期活跃表达,结果可为进一步明确 Septin的功能及玉米大斑病菌的侵染调控机制提供依据。 相似文献
4.
《云南农业大学学报(自然科学版)》2021,(3)
【目的】研究番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus,TSWV)核衣壳蛋白基因(N)对辣椒抗病性的影响。【方法】以易感TSWV的辣椒湘研11为研究对象,采用同源序列克隆获得辣椒CaPDS基因和TSWV N基因;利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)和病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术构建辣椒CaPDS基因沉默载体(pTRV2-CaPDS)和TSWV N基因沉默载体(pTRV2-N),农杆菌GV3101注射接种辣椒,通过qRT-PCR检测重组载体沉默效率。【结果】湘研11接种含pTRV2-CaPDS载体菌液3周后,新叶出现白化现象,说明辣椒上的pTRV2-CaPDS沉默载体构建成功。qRT-PCR结果表明:pTRV2-N载体可高效沉默N基因,其表达量仅为6.79%±2.56%,说明沉默N基因后,湘研11不易感染TSWV。【结论】本研究成功构建了pTRV2-N沉默载体,沉默TSWV的N基因后辣椒对入侵的TSWV产生一定的抗性。 相似文献
5.
【目的】白粉病（powdery mildew）是番茄生产上的重要病害,严重影响番茄的产量。番茄基因组测序工作的完成为抗病基因挖掘提供了重要的信息资源。ARP2/3（actin-related protein 2 and 3）复合体是肌动蛋白微丝骨架动力学的主要调控因子,能够参与包括响应外界胁迫等多种细胞学过程。本研究通过对番茄ARPC5（actin-related protein C5）进行克隆和抗病功能验证,为番茄基因组信息完善、抗病机制解析和分子育种等方面打下基础。【方法】从番茄LA1777（Solanum habrochaites）cDNA中PCR扩增ShARPC5,使用DNAMAN 6.0进行多序列比对;MEGA 6.0构建系统发育树;应用在线工具ProtComp v. 9.0进行亚细胞定位预测。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）比较接种白粉菌（Oidium neolycopersici,On-Lz）后高感品种Moneymaker（MM）和高抗品种LA1777中番茄ARPC5的表达特征,分析白粉菌侵染与ARPC5表达的相关性。应用病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术进一步验证该基因在番茄中的抗病功能,观察沉默株和野生型株系接种后表型变化,利用台盼蓝和DAB染色法检测植株产生过敏性坏死和H2O2的能力,并检测ShARPC5沉默后一些与植物抗病相关标记基因的表达变化。采用农杆菌浸花法遗传转化拟南芥过表达ShARPC5植株,观察转基因和野生型株系接种后表型变化,并统计单病斑分生孢子数。【结果】从番茄品种LA1777中克隆到ShARPC5,编码132个氨基酸残基,包含一个保守的P16-Arc结构域。与番茄MM-白粉菌亲和互作相比,非亲和互作的番茄品种LA1777在接种白粉菌后,ShARPC5显著上调表达,尤其在接种后18 h。在番茄上沉默ShARPC5能够增加植株对白粉菌On-Lz的敏感性,防卫反应基因PR1b1显著下调表达。组织学观察显示与对照植株相比,ShARPC5沉默植株接种后诱导产生过敏性坏死和活性氧减少。在烟草上瞬时过表达ShARPC5能够诱导产生坏死斑。相反,在拟南芥上过表达ShARPC5能够增加植物的抗病性。【结论】ShARPC5是番茄响应白粉菌侵染的重要基因,可减轻番茄白粉病的发病程度,在番茄抗白粉病机理研究方面具有较大的应用价值,可作为番茄抗白粉病分子育种的一个候选基因。 相似文献
6.
【目的】马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）是危害烟草、马铃薯、番茄、辣椒等主要农作物的重要病毒,给农业生产带来巨大损失。论文旨在克隆Hsc70-2蛋白在本氏烟（Nicotiana benthamiana）中的基因序列并分析其生物学信息,研究NbHsc70-2蛋白对PVY侵染烟草的影响,为进一步解析PVY的侵染机制提供理论依据。【方法】以本氏烟为材料,克隆NbHsc70-2蛋白的基因编码序列（coding sequence,CDS）,利用MEGA 6.0 进行多序列比对并构建系统进化树;利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析NbHsc70-2在本氏烟各组织中的表达水平;采用在线软件BaCeILo和SignalP 4.0对NbHsc70-2进行生物信息学分析;构建NbHsc70-2-RFP融合蛋白确定该蛋白的亚细胞定位;研究PVY处理对本氏烟叶片中NbHsc70-2的影响;利用激光共聚焦观察PVY-GFP处理对NbHsc70-2-RFP定位的影响;构建NbHsc70-2 VIGS沉默体系及瞬时表达载体,采用qRT-PCR比较NbHsc70-2在沉默/过表达后对PVY表达的影响。【结果】NbHsc70-2编码649个氨基酸,系统进化树分析表明,NbHsc70-2与普通烟NaHsc70-2序列相似性最高,亲缘关系最近,属于热激蛋白家族,C端具有热激蛋白家族的高度保守基序结构;qRT-PCR分析表明,NbHsc70-2在叶中表达量最高,在根和茎中的表达量较低;BaCeILo预测及激光共聚焦显微镜观察均显示NbHsc70-2定位在细胞质中,并且PVY-GFP侵染本氏烟后NbHsc70-2-RFP部分转移至细胞核,与PVY-GFP共定位在细胞质及细胞核中;将NbHsc70-2基因沉默载体pTRV::NbHsc70-2导入本氏烟中7 d后相比于对照组,沉默组出现心叶皱缩及矮化现象;接种PVY-GFP 7 d后通过手持紫外灯观察到沉默组中无明显绿色荧光出现,而对照组中PVY-GFP系统侵染使得非接种叶片呈现荧光现象,沉默组荧光点数约为对照组28%;接种PVY后,利用qRT-PCR检测沉默NbHsc70-2后1、3、5 d的PVY CP基因积累量,结果表明沉默NbHsc70-2后PVY CP基因积累量下降,其中3 d和5 d与对照相比差异显著,基因表达水平分别为对照的14%和0.004%;将NbHsc70-2过表达载体pEarleyGate100::GWC::NbHsc70-2与PVY同时导入本氏烟后,结果表明相比于对照组,过表达组48 h和72 h 其PVY CP基因积累量显著上升,基因表达水平分别为对照组的2.31、2.56倍。【结论】PVY侵染会引起NbHsc70-2表达量上升;NbHsc70-2是PVY侵染本氏烟重要的组成成分,沉默该基因显著抑制PVY的表达,过表达NbHsc70-2则显著提高PVY的表达,即NbHsc70-2的表达水平与PVY复制呈正相关,NbHsc70-2蛋白促进PVY对烟草的侵染。 相似文献
7.
【目的】获得玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）SC35类剪接因子的基因,并分析该基因家族之间的相互作用及在病菌不同生长发育时期与侵染过程中的表达规律,为明确剪接因子SC35家族与真菌生长发育的关系打下基础。【方法】以拟南芥（Arabidopsis thaliana）SC35编码的氨基酸序列为探针序列,在玉米大斑病菌全基因组数据库进行同源比对,获得玉米大斑病菌中潜在的SC35蛋白;利用生物信息学方法对其保守结构域、系统进化关系进行分析;分别收集接种在感病玉米叶片表面不同时间及玉米大斑病菌菌丝、分生孢子、芽管、附着胞及侵入丝等不同发育时期的材料,利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术分析在对玉米叶片侵染不同时间及不同发育时期可变剪接因子的转录水平;利用酵母双杂交技术明确玉米大斑病菌可变剪接因子之间的相互作用。【结果】在玉米大斑病菌中获得了8个潜在的SC35类蛋白基因,其编码的氨基酸具有典型的SR蛋白（Ser-Arg rich protein）结构域,而StSC1 C端具有2个RRM基序。8个基因位于染色体组的不同物理位置,不具有连锁关系。系统进化分析表明8个剪接因子分布于不同进化支,同源性较低。在病菌侵染寄主叶片过程中,StSC1、StSC2、StSC3、StSC4、StSC5、StSC6、StSC8在侵染18 h时表现为表达上调趋势,StSC7呈下调趋势,StSC4在6—18 h表现出较高表达活性;不同生长时期中,StSC1在病菌附着胞及侵染丝形成时期表达水平极显著上调（P＜0.001）,是分生孢子时期的24.44、8.25倍,其余7个可变剪接因子在病菌的生长过程中表达水平均呈下调趋势。酵母双杂交结果表明StSC4与StSC6、StSC3与StSC8、StSC3与StSC4、StSC8与StSC4有体外互作关系。【结论】在玉米大斑病菌侵染过程中及不同发育时期可变剪接因子的表达模式不同,StSC4在病菌整个侵染过程均活跃表达;StSC1、StSC4和StSC6对病菌附着胞和侵入丝的形成发挥比较重要的调控作用;StSC4与StSC6、StSC3与StSC8、StSC3与StSC4、StSC8与StSC4通过互作,调控剪接复合体的形成。 相似文献
8.
【目的】γ-谷氨酰磷酸还原酶是真菌脯氨酸合成途径中的一个关键性酶,本研究旨在对核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)γ-谷氨酰磷酸还原酶编码基因SsGPR1进行沉默,并对沉默转化子菌丝生长、菌核形成和致病力等表型进行研究,为揭示核盘菌的生长发育与致病机理打下基础,并为作物菌核病的绿色防控提供线索。【方法】通过BLAST进行蛋白同源比对分析,并利用MEGA 5.0软件构建蛋白进化树。通过实时荧光RT-PCR检测SsGPR1在核盘菌菌丝生长、菌核发育和萌发的各个阶段以及致病不同时期的表达模式。根据RNA干扰原理构建SsGPR1的沉默载体,通过PEG介导原生质体转化的方法将沉默载体转入到野生型核盘菌菌株1980中。利用实时荧光RT-PCR鉴定基因沉默转化子,对沉默转化子的菌丝形态、生长速度和菌核形成等表型进行观察,并测定沉默转化子在氧化胁迫条件下的菌丝生长。将沉默转化子分别接种至活体油菜叶片和拟南芥植株,观察并测量病斑大小。通过酸性茚三酮法对沉默转化子中的游离脯氨酸进行测定。【结果】核盘菌SsGPR1全长1 454 bp,编码449个氨基酸,在氨基酸H~(10)-N~(426)处含有谷氨酰磷酸还原酶结构域。同源比对发现SsGPR1蛋白与灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的BC1G_13183蛋白和白霉病菌(Sclerotinia borealis)的SBOR_2215蛋白相似性最高,氨基酸序列一致性分别达95%和94%,系统进化树结果表明三者聚为一个小的分支。SsGPR1在核盘菌菌丝生长时期的表达量较高,在菌核不同发育阶段表达量相近,但均低于菌丝生长时期。SsGPR1在致病时期表达量不断升高,在接种后9 h表达量最高。将SsGPR1基因沉默载体pSIGPR1导入到核盘菌野生型菌株中,并通过实时荧光RT-PCR检测不同转化子中SsGPR1的表达水平,结果表明SiGPR1-104和SiGPR1-149为SsGPR1基因沉默转化子。沉默转化子在PDA培养基上形成的菌核数量及均重与野生型菌株无显著性差异,且菌核均能萌发形成子囊盘,但菌丝生长稠密,生长速度显著下降。在含有H_2O_2的培养基中,SsGPR1基因沉默转化子菌丝生长受到更强的抑制,表明沉默转化子对氧化胁迫更加敏感。SsGPR1基因沉默转化子在活体油菜叶片和拟南芥植株上能引起发病,但病斑面积减小,表明沉默转化子致病力减弱。SsGPR1基因沉默转化子菌丝中的游离脯氨酸含量与野生型菌株相比无显著差异。【结论】SsGPR1与核盘菌的生长和菌丝形态相关,且参与核盘菌对氧化胁迫的抵御及致病过程。 相似文献
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【目的】马铃薯Y病毒（potato virus Y,PVY）是危害我国烟草生产的最重要病毒之一,NAC转录因子与植物的抗病、抗逆密切相关,本论文克隆NbNAC062进行生物信息学分析,并研究其在PVY侵染过程中的作用,为烟草抗病毒药剂的开发提供靶标。【方法】以本氏烟（Nicotiana benthamiana）为材料克隆NbNAC062,利用MEGA、UniProt、SMART、TMHMM Server 2.0、Sol Genomics Network、PlantCARE等技术进行生物信息学分析;利用激光共聚焦与实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）明确PVY侵染前后NbNAC062蛋白定位及mRNA表达量变化;基于病毒介导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）和过表达技术,构建pTRV::NbNAC062沉默载体与pEarleyGate100::RFP::NbNAC062过表达载体,采用qRT-PCR和Western blot检测NbNAC062在本氏烟中沉默与过表达后,PVY的积累量变化及未折叠蛋白应答（unfolded protein response,UPR）相关基因BiP的表达差异。【结果】NbNAC062编码646个氨基酸,N端28—179 aa为NAC结构域,129—185 aa为DNA结合区域,C末端621—643 aa为疏水跨膜结构,系统进化树与蛋白序列分析表明本氏烟NbNAC062与渐狭叶烟草NaNAC062亲缘关系最近。NbNAC062启动子中包含脱落酸、茉莉酸甲酯、水杨酸以及逆境响应相关的多种顺式作用元件。PVY侵染激活NbNAC062从细胞膜转移至细胞核,且诱导NbNAC062上调表达。PVY侵染本氏烟5、7 d,处理组NbNAC062 mRNA水平分别为对照组的2.52、1.95倍;PVY侵染3 d,BiP mRNA表达量为对照组的2.39倍,PVY侵染7 d,BiP表达量极显著低于对照组,下调表达56.77%。本氏烟沉默NbNAC062并接种PVY,接种后3、5、7 d,与对照组相比,沉默组PVY CP mRNA上调表达,分别为对照组的2.12、2.41、1.38倍,BiP mRNA表达量则下调,分别下调28.19%、58.11%、10.77%,接种后5、7 d沉默组PVY CP蛋白含量亦显著高于对照组。过表达NbNAC062并接种PVY,接种后24、48、72 h,与对照组相比,过表达组PVY CP mRNA分别下调22.60%、34.51%、36.21%,接种48、72 h,BiP mRNA上调表达,分别为对照组的1.56、1.35倍,过表达组PVY CP蛋白含量亦低于对照组。【结论】NbNAC062属于NAC类膜结合转录因子,可被PVY侵染激活转移至细胞核,可能通过调控UPR相关基因BiP的表达,促进细胞生存,抑制PVY早期侵染。 相似文献
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【目的】拟轮枝镰孢（Fusarium verticillioide）是一种主要的病原真菌,侵染玉米可以导致穗粒腐病、茎腐病、苗期根腐病及引起种子腐烂。由拟轮枝镰孢引起的病害不仅影响玉米的产量和品质,而且其病原菌代谢过程中产生的伏马菌素等多种真菌毒素严重威胁了人畜安全。通过宿主诱导的基因沉默（host-induced gene silencing,HIGS）技术创制抗拟轮枝镰孢的玉米种质,为玉米抗病育种提供新的优异抗源。【方法】通过同源克隆方法克隆可能与拟轮枝镰孢生长发育相关的关键基因,并通过体外转录获得相应的dsRNA片段;将不同基因的dsRNA与拟轮枝镰孢的分生孢子悬浮液预混后,用于后续的体外RNA沉默试验;对感病玉米自交系西502的种子进行消毒与接种,在培养皿中28℃避光培养48 h,调查种子的发病程度;在混有dsRNA的孢子悬浮液中加入葡萄糖,25℃培养24 h后,在显微镜下观察孢子萌发与菌丝生长情况;将三叶期的西502幼苗转移至预混dsRNA的孢子悬浮液中进行培养,7 d后观察苗期根腐病发病状况;通过种子鉴定与苗期鉴定体系,逐步筛选具有显著抑制效果的沉默靶标基因;合成筛选出的重点靶标基因片段,构建沉默载体并转化感病玉米自交系西502;对转基因株系的种子接种鉴定,验证转化玉米株系的抗性;提取接种后转基因种子的总RNA,对拟轮枝镰孢的靶标基因进行荧光定量分析,确定HIGS株系的沉默效果。【结果】从拟轮枝镰孢中克隆出18个与其生长发育相关的候选基因;通过种子接种鉴定,发现11个候选基因被沉默后,种子的发病等级极显著降低;进一步筛选出6个沉默后影响拟轮枝镰孢的孢子萌发和菌丝生长的候选靶标基因deo、Ras2、Dpdc、Hsp90、Frp1和Atg15;通过苗期接种鉴定,最后筛选出3个在体外具有显著抑制效果的沉默靶标基因deo、Atg15和Frp1;进而将3个靶标基因的特异区段人工融合成一段序列并构建沉默载体,获得转基因植株;鉴定发现转基因植株的T2代种子对拟轮枝镰孢的抗性显著增强,且3个靶标基因的表达量均显著下降。【结论】拟轮枝镰孢基因deo、Atg15、Frp1与其生长发育密切相关,且沉默后能够显著提升玉米对拟轮枝镰孢的抗性。 相似文献
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YUAN JunHu DING YiJuan YANG WenJing YAN BaoQin CHAI YaRu MEI JiaQin QIAN Wei 《中国农业科学》2019,52(23):4274-4284
【Objective】 Sclerotinia stem rot (SSR) caused by Sclerotinia sclerotiorum is the main problem in rapeseed planting in China, which causes serious yield and quality loss. Secretory proteins play an important role in the pathogenesis of pathogens. The genome of S. sclerotiorum contains a large number of genes encoding secretory proteins. The objective of this study is to identify and screen the secretory protein genes related to pathogenicity, reveal the pathogenic mechanism of S. sclerotiorum, and to provide an important target for the prevention and control of SSR. 【Method】 SMART software was used to analyze the protein domains of 8 candidate genes with signal peptides that were differentially expressed in the process of S. sclerotiorum infecting the susceptible and resistant Brassica oleracea lines, then the domains obtained by SMART analysis were annotated in SCOP, Pfam and PDB databases. The fragment with the length of around 300 bp in the encoding region of these genes was cloned into pTRV2 vector together with the GFP fragment. The suspension of pTRV1 was mixed equally with pTRV2-Gene and pTRV2-GFP, respectively. After 3 hours at room temperature, pTRV2-Gene vector and control (pTRV2-GFP) were transformed into 5-6 week-old leaves of Nicotiana benthamiana using syringe infiltration method. Subsequently, the infiltrated plants were cultured in dark for 48 hours and then grown in the normal light for 7 days. PDA mycelium blocks of S. sclerotiorum with a diameter of 6 mm were used to inoculate the infiltrated leaves of tobacco at the 9th day after transformation in vivo, in which the carrying surface was close to the leaves. After 48 hours of inoculation, the lesion size was measured and RNA from necrotic and infected tissues (around 1 cm from the edge of necrotic tissue) was extracted. qRT-PCR analysis was carried out to estimate the relative expression of target gene in N. benthamiana lines carrying TRV-HIGS vector. 【Result】 The putative functions of these 8 genes predicated with SMART and domain annotation were involved in the hydrolysis of proteins, nucleic acids or polysaccharides, the immunity response of host plants, and the tolerance to drugs and biotin synthesis of S. sclerotiorum. The average lesion area of control carrying TRV-GFP was 3.44 cm 2 at 48 hours post inoculation of S. sclerotiorum. Except for one line (SS1G_07655), the lesion area of other 7 lines carrying TRV-HIGS vector was significantly lower than that of the control plants (P≤0.05), ranging from 1.63 to 2.61 cm 2. qRT-PCR analysis showed that the gene expression level of these 7 genes in the TRV-HIGS lines was significantly lower than that of the control (P≤0.05). 【Conclusion】 Eight secretory protein genes with unknown function in S. sclerotiorum were successfully identified by TRV-HIGS technique. Seven genes related to the pathogenicity of S. sclerotiorum were screened out. Among them, SS1G_03146 with the strongest effect on the pathogenicity of S. sclerotiorum may be involved in the synthesis of biotin, and SS1G_04343 and SS1G_11912 may be involved in the immune response of host. 相似文献
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【目的】烟草花叶病毒属（Tobamovirus）是危害辣椒、烟草等茄科作物的主要病毒之一,严重影响蔬菜作物的种植和生产。本研究旨在探明侵染江苏省南京市辣椒的烟草轻绿花叶病毒（tobacco mild green mosaic virus,TMGMV）分离物（TMGMV-JS）的基因组结构特征、系统进化关系及其致病性,为TMGMV的防控提供科学依据。【方法】从江苏省南京市采集的辣椒病样,提取总RNA,利用TMGMV特异检测引物确认阳性后,设计病毒特异性全长引物扩增TMGMV-JS全基因序列,通过同源重组的方法克隆至pCB301植物表达载体上,获得TMGMV-JS分离物基因组序列和全长cDNA侵染性克隆。BLAST分析TMGMV-JS分离物与已报道分离物的同源性,利用MEGA7软件的邻接法进行系统进化分析。将侵染性克隆通过农杆菌浸润本氏烟和辣椒,经RT-PCR和Western blot检测验证侵染效果,测定TMGMV-JS分离物的致病性。【结果】侵染江苏省南京市辣椒的TMGMV全长序列为6 356 nt,编码4个功能蛋白,分别为126K复制相关蛋白、183K复制酶、运动蛋白MP和外壳蛋白C... 相似文献
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【目的】小柱孢酮脱水酶（scytalone dehydratase,SCD）是黑色素合成过程中的关键酶。本文旨在鉴定玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）小柱孢酮脱水酶基因（StSCD）家族,并分析玉米大斑病菌附着胞发育过程中StSCD基因家族表达量差异及SCD抑制剂对黑色素合成的影响,为进一步研究StSCD基因家族在黑色素合成和附着胞发育中的作用打下基础。【方法】利用玉米大斑病菌野生型菌株01-23的全基因组数据,获得StSCD基因家族的全序列,并与玉米小斑病菌（Cochlibolus heterostrophus）、稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、瓜类炭疽病菌（Colletotrichum lagenaria）等真菌的SCD进行序列比对;收集玉米大斑病菌附着胞不同发育时期的材料进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析,获得不同时期、不同StSCD的表达量,从而确定与病菌侵染和附着胞黑色素化密切相关的脱水酶基因;使用SCD抑制剂环丙酰菌胺处理玉米大斑病菌,测定菌落生长速度、黑色素合成量、附着胞膨压等,确定StSCD在附着胞发育过程中的作用。【结果】玉米大斑病菌全基因组中共鉴定到4个StSCD,其编码蛋白具有SCD保守结构域及保守的催化及底物结合氨基酸残基。StSCD3与灰葡萄孢（Botrytis cinerea）中功能冗余的SCD2蛋白具有较高同源性,StSCD4与多主棒孢（Corynespora cassiicola）中参与黑色素合成的SCD蛋白具有较高同源性。通过分析玉米大斑病菌生长发育过程中不同时期StSCD的表达量发现,在附着胞时期4个StSCD表达量均上调,其中StSCD3、StSCD4表达量上调尤为显著,附着胞再生菌丝时期StSCD3、StSCD4的表达量均显著下降,并且在附着胞诱导整个时期StSCD4的表达量较高。环丙酰菌胺处理玉米大斑病菌后,黑色素合成受阻,附着胞膨压显著降低。【结论】玉米大斑病菌含有4个StSCD,推测StSCD4参与DHN（1,8-间苯二酚）黑色素的合成,并进而影响附着胞膨压积累。 相似文献
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【目的】脱落酸（ABA）作为一类逆境激素,在植物生长发育、生物胁迫和非生物胁迫中发挥着重要作用。脱落酸受体蛋白PYR/PYL/PCAR及SNF1相关的蛋白激酶（SnRK2）是介导脱落酸信号转导的重要调控因子。本研究通过预测脱落酸及其信号转导途径中关键基因在谷子白发病致病菌禾生指梗霉（Sclerospora graminicola）中的调控作用,为谷子内源脱落酸响应禾生指梗霉侵染的互作研究提供参考。【方法】通过对禾生指梗霉侵染的晋谷21号谷子进行转录组测序和脱落酸含量测定,基于谷子全基因组对脱落酸信号转导通路上的PYL和SnRK2家族基因进行鉴定、分析,利用测定的转录组构建加权基因共表达网络（WGCNA）,并与禾生指梗霉侵染引起的寄主内源脱落酸含量进行关联,预测脱落酸及其下游信号转导基因PYL和SnRK2在谷子与禾生指梗霉互作调控中的关键核心基因;利用qRT-PCR技术对候选基因进行验证。【结果】谷子中存在禾本科中较为保守的PYL和SnRK2家族基因各11个,且在PYL和SnRK2家族基因的启动子上均预测到脱落酸响应元件。在禾生指梗霉侵染后,寄主内源脱落酸在第一、第二时期大量积累,含量显著高于对照组,分别为22.50和18.08 ng·mL-1,而在第三、第四和第五时期脱落酸含量下降,低于对照组。在基因共表达网络分析中,利用18 535个基因共构建了34个基因共表达模块。通过对脱落酸含量和PYL、SnRK2家族基因的关联分析,预测到MEpaleturquoise和MEbrown模块为核心候选模块。利用GO功能富集和模块关键基因的挖掘共预测到1个PYL家族基因Seita.1G030500和2个SnRK2家族基因Seita.2G394500、Seita.3G03200,以及3个核心基因Seita.4G105600、Seita.6G218100和Seita.9G138400,共6个基因可能在脱落酸及其信号转导调控过程中参与谷子与禾生指梗霉的互作。对预测到的3个核心基因在水稻和拟南芥数据中进行比对,鉴定到Seita.4G105600为转导蛋白/WD40重复超家族蛋白、Seita.6G218100为WRKY57转录因子、Seita.9G138400为TIFY转录因子。qRT-PCR分析表明Seita.2G394500、Seita.4G105600和Seita.6G218100基因在谷子白发病早期表达均上调。【结论】谷子在受到禾生指梗霉侵染后脱落酸会在体内大量积累,预测到1个PYL家族基因、2个SnRK2家族基因、2个转录因子基因和1个WD40家族蛋白基因参与谷子内源脱落酸响应禾生指梗霉侵染过程。qRT-PCR结果表明1个SnRK2家族基因、1个WD40家族蛋白基因和1个WRKY57转录因子基因共3个基因可能在谷子脱落酸响应禾生指梗霉侵染过程中发挥重要作用。 相似文献
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【背景】条锈病是小麦上的重大病害,由条形柄锈菌小麦专化型（Puccinia striiformis f. sp. tritici,Pst）侵染引起。条锈菌是活体营养型寄生真菌,在侵染过程中形成吸器,通过吸器从寄主植物汲取营养。同时,吸器分泌效应蛋白调控寄主免疫,促进侵染过程。【目的】明确条锈菌效应蛋白的功能及其作用机理,为揭示条锈菌的致病机制打下基础。【方法】比较分析条锈菌夏孢子、芽管和吸器转录组,获得在吸器诱导表达的分泌蛋白基因Hasp83,在本氏烟叶片细胞中瞬时表达观察是否能抑制由BAX引起的细胞坏死;利用qRT-PCR分析该基因在条锈菌侵染小麦不同阶段的表达水平。借助荧光假单胞菌Ⅲ型分泌系统和寄主诱导的基因沉默（host-induced gene silencing,HIGS）分析Hasp83在条锈菌侵染过程中的功能。利用酵母双杂交系统筛选小麦中与Hasp83互作的蛋白,免疫共沉淀技术进一步在烟草细胞中共表达验证Hasp83及其候选靶标蛋白的互作。【结果】Hasp83开放阅读框全长522 bp,编码173个氨基酸,蛋白N端1—29位氨基酸为信号肽,无保守结构域,在本氏烟叶片细胞中... 相似文献