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1.
为了降低烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）和马铃薯Y病毒（potato irus Y,PVY）复合侵染对烟草带来的危害,本实验找到TMV—CP和PVY—CP基因部分保守序列,将保守序列进行双基因融合,此双基因即为RNAi的靶序列,用限制性内切酶将双基因从pMD18-T载体上切下,正反向连接到pUCCRNAi载体后,经酶切鉴定后定向连接到含超强启动子的pC2300—35S—OCS表达载体上,利用冻融法将此表达载体导入只含辅助质粒的根癌农杆菌中,构建含靶序列反向重复结构的RNAi双元载体系统,提取转化质粒,经酶切验证鉴定表明TMV和PVY外壳蛋白基因植物表达双元载体构建成功。并转化烟草,获得了3株对TMV和PVY抗性显著提高的转基因烟草。 相似文献
2.
瞬时表达黄瓜花叶病毒部分复制酶基因和番茄花叶病毒移动蛋白基因的dsRNA能阻止相关病毒的侵染 总被引：12，自引：0，他引：12
根癌农杆菌介导的瞬时表达法已开始用于研究RNA沉默，在非转基因植物细胞中，如能建立借助于根癌农杆菌介导的瞬时表达法。考察反向重复片段转录出的dsRNA对入侵病毒的干涉作用，则可以快速预测所构建重组载体用于抗病毒基因工程的效果。本研究证明用根癌农杆菌浸润法在植物的叶片组织中瞬时表达dsRNA，可以阻止相关病毒的侵染。 相似文献
3.
在植物中通过农杆菌介导的基因瞬时表达和基于RNAi的基因沉默可便捷高效地研究基因功能。本研究采用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)注射侵染法,利用GUS作为报告基因,探讨了月季(Rosa hybrida)品种、农杆菌菌株、开花级别、花瓣位置、农杆菌侵染浓度和侵染液成分等因素对月季花瓣中基因瞬时表达效果的影响。结果表明,月季品种蜜糖3级切花的中层花瓣中瞬时表达效果最佳;农杆菌菌株GV3101介导的瞬时表达效果最好,侵染浓度以OD600=0.9为宜,添加10 mmol/L MgCl2及10 mmol/L MES的侵染液效果优于重蒸水。同时,利用上述优化瞬时表达体系进行RNAi沉默,成功抑制了外源报告基因GUS和内源基因RhSAG的表达。相比对照,RhSAG沉默花瓣的萎蔫速度较慢,说明衰老进程得到延缓。该体系的优化为月季花瓣中基因功能的鉴定提供了有效工具。 相似文献
4.
以含有基因转化操作过程中常用的两种质粒载体pBI121和pCAMBIA2301的根癌农杆菌EHA105为材料,分别转化甜瓜子叶,应用组织化学方法检测了甜瓜子叶和子叶培养后的愈伤组织及根癌农杆菌菌液的瞬时转化效果,研究了两种不同的质粒载体上所含的gus基因在根癌农杆菌中和植物细胞中的表达特性。结果表明,不同质粒载体上所含的gus基因的表达特性不同,质粒载体pBI121上所含的gus基因既能在植物细胞中能表达,也能在根癌农杆菌细胞中表达,而质粒载体pCAMBIA2301上所含的gus基因能在植物细胞中表达,但是不能在根癌农杆菌细胞中表达。 相似文献
5.
人参果是以营养器官繁殖为主的多年生草本植物,连年种植易造成多种病毒病积累。为了寻求一种能同时抵御多种病毒病的方法,本试验以危害人参果的3种主要病毒为研究对象,根据GenBank中烟草花叶病毒(TMV)P126基因、马铃薯M病毒(PVM)CP基因和黄瓜花叶病毒(CMV)2b蛋白基因序列,利用E-RNAi网站提供的分析软件,筛选出含有较多有效小干扰RNA[siRNA,19 nt]的长dsRNA(Long dsRNA)片段作为RNAi的靶序列。用重叠延伸PCR方法将三个靶标片段融合在一起,构建了一种具有内含子(intro)的反向重复结构和嵌合基因的植物RNAi表达载体pCEIHFR。将pCEIHFR通过冻融法导入农杆菌LBA4404并转化人参果,经过草甘膦筛选和PCR检测,确认其中的24株为转基因阳性植株。 相似文献
6.
水稻钙依赖型蛋白激酶（CDPKs）是一个响应逆境胁迫并在植物发育过程中起重要作用的蛋白激酶。我们采用RT—PCR从水稻品种日本晴（Oryza sativa L．CV．Nipponbare）中克隆了OsCPK9基因靠近翻译起始位点下游的一段280bp的特异基因片段。将该片段以正、反向分别连接到来源于小麦TAK14基因的548bp内含子片段（NCBIaccessionnumber：AF325198）两侧,从而获得pSK．OsCPK9-RNAi的中间表达载体。进而将其克隆到植物双元表达载体pCAMBIA1301中,构建shRNAi表达载体pCAMBIA．05CPK9一RNAi。经酶切和测序鉴定正确后,利用农杆菌介导转化水稻。通过抗性筛选和标记基因hyg和gus进行PCR鉴定,筛选到20株转基因水稻植株,实时荧光定量PCR分析显示,部分转基因植株OsCPK9的表达受到显著抑制。 相似文献
7.
病毒病是制约马铃薯生产的重要因素之一。在拟南芥等植物的研究中发现,抑制寄主因子可以显著降低细胞中病毒的累积量,从而缓解病害症状。本研究在获得与拟南芥寄主因子AtTOM1和AtTOM3具有同源性的马铃薯基因StTOM1和StTOM3的基础上,尝试用RNAi方法同时沉默StTOM1和StTOM3。以pUCCRNAi为中间载体,构建同时含StTOM1和StTOM3双基因干扰片段StT1-StT3的质粒pUCStT1-StT3-dRi（±）,再将双基因干扰片段StT1-StT3切下并连接到双元载体pBI121上。用农杆菌介导方法,将StT1-StT3片段导入马铃薯中,获得转基因马铃薯小苗,阳性率达到83.6%。RT-PCR检测表明,转StT1-StT3马铃薯中StTOM1基因mRNA的表达水平下调了78%,StTOM3基因下调了81%。StTOM1和StTOM3沉默转基因马铃薯的获得,为将来验证和评价StTOM1和StTOM3是否为马铃薯病毒的寄主因子及在创建抗病毒马铃薯新种质的潜力,奠定了基础。 相似文献
8.
本研究利用PCR技术从三倍体毛白杨（（Populus tomentosaxP．bolleana）xP．tomentosa）基因组DNA中扩增获得抗病相关PtDRG02基因的一个启动子区（包括其下游5’端非编码区序列）,命名为Ptp01。以β-葡萄糖苷酸酶（舢）基因为报告基因,构建了PtDRG02基因启动子植物表达载体Ptp01／gus。以根癌农杆菌EHA105及LBA4404感受态细胞为受体,转化植物表达载体Ptp01／gus进行瞬时表达,并对启动子进行了功能活性分析,结果表明该启动子能够驱动gus报告基因在毛白杨叶片组织中表达,但表达强度弱于花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子。 相似文献
9.
植物脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶A(fatty acyl-acyl carrier protein thioesterase,FATA)是脂肪酸积累过程中的关键酶,直接调控脂肪酸的含量与组成。目前有关麻疯树(Jatropha curcas)FATA基因(JcFATA)(Gen Bank登录号:EU267122.2)的功能研究还未见报道。本研究首先构建JcFATA基因RNA干涉(RNA interference,RNAi)表达载体,进行下调表达研究,以麻疯树叶片cDNA为模板,克隆出JcFATA基因正向片段FATA1(439 bp),然后将其连接到含内含子的干涉表达载体p YLRNAi.2-35S上,构建JcFATA基因RNAi表达载体pYLRNAi.2-35S-FATA1-FATA2;再通过电击法将其转入到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105感受态细胞中,然后利用花序侵染法进行拟南芥(Arabidopsis thaliana)遗传转化,最后通过PCR检测和Southern blot验证。对转基因拟南芥植株进行了表型观察、表达量分析和脂肪酸的含量测定,结果显示,JcFATA基因干涉表达的转基因植物生长发育可能受到抑制。本研究结果可为进一步探讨JcFATA基因的功能及该基因在麻疯树遗传改良中的应用提供理论依据。 相似文献
10.
水稻OsHsfA7基因RNA干扰载体的构建及遗传转化研究 总被引：1，自引：1，他引：0
为研究水稻热激转录因子基因OsHsfA7的功能及其在水稻耐热育种方面的应用价值,本文通过构建水稻OsHsfA7基因RNA干扰载体获得功能抑制变异材料,从反向遗传学进行基因的功能分析。扩增OsHsfA7c DNA3'编码区470bp片段,分别以反向和正向插入到中间载体pBSK连接的GUS片段两侧,然后将得到的RNA干扰片段克隆到改造的植物表达载体p1301M,构建以CaMV35S启动子驱动表达的水稻OsHsfA7基因RNA干扰表达载体。将该载体转入根癌农杆菌EHA105后,采用农杆菌介导法进行了水稻日本晴品种的遗传转化,获得了23株具有潮霉素抗性的转基因植株,其中12株经GUS染色呈蓝色并且DNA检测10株已插入目的片段,RNA检测其中6株OsHsfA7基因的表达水平下降甚至未检出。结果说明本研究构建的OsHsfA7基因RNA干扰载体对该基因表达沉默是有效的。 相似文献
11.
甘蔗是重要的能源作物和糖料作物,面临病虫害日益严重问题。由于甘蔗遗传背景非常复杂,且缺乏必要种质,难以通过杂交培育抗病虫、除草剂聚合品种。基因工程技术提供了新方法。本研究利用BLAST比对获得甘蔗花叶病毒ScMV-CP基因和黄叶病毒ScYLV-CP基因的保守序列作为干扰序列,通过设计内切酶位点、生物合成和连接,获得全长687 bp的两个保守序列融合片段（MYCP）。并将其正向和反向插入中间载体pHANNIBAL上,形成双价病毒干扰结构。再通过在pHANNIBAL上添加SmaⅠ内切酶位点,将双价病毒干扰结构表达框和Cry1AC基因表达框结合;利用NotⅠ酶切,回收双价病毒干扰结构和Cry1AC基因表达框片段,连接到添加Bar基因表达框的表达载体pART27-Z上,构建了抗病虫及除草剂四价植物表达载体（pART27-MYCP-Cry1AC）。采用基因枪法将构建好的四价植物表达载体转入甘蔗品种FN15的胚性愈伤组织中,通过PPT（草丁膦）筛选获得了抗性再生甘蔗植株,经过PCR、定量以及Bt蛋白试纸检测,获得同时整合四种目的基因并表达的四价转基因甘蔗植株,为培育多抗甘蔗新品种提供了材料。 相似文献
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大麦黄矮病毒单双价外壳蛋白基因植物表达载体构建及小麦遗传转化 总被引：8，自引：0，他引：8
从我国小麦上分离纯化的大麦黄矮病毒PAV分离物，通过RT－PCR、克隆和序列测定后，确认该分离物的外壳蛋白基因由600个核苷酸组成，编码199个氨基酸。该片段克隆到表达质粒pEmu-mcs-N上，构建了植物表达载体pPPI10，同时，在克隆了PAV和GPV外壳蛋白的基础上，构建了编码GPV＋PAV双价CP基因的植物表达载体pPPI14。用花粉管通道法分别净这两种质粒导入小麦品种北京837，经Kan^R筛选、点杂交、PCR、Southern杂交等一系列分析鉴定，转化率分别为2.5%和0.36%,温室和田间抗病毒接种。部分转基因植株对病毒的侵染表现出发病症状较轻，与未转化对照株相比，其发病时间明显延迟。由此推测，转基因植株获得了一定的抗性。 相似文献
13.
水稻卷窄叶突变相关基因OsCSLD4的RNAi研究及表达分析 总被引：1，自引：1，他引：0
在图位克隆获得目的基因OsCSLD4的基础上,利用Invitrogen公司的Gateway系统将500bp的OsCSLD4基因cDNA编码序列以反向互补的方式插入pANDA35HK,构建了水稻卷窄叶突变相关基因OsCSLD4的干涉载体pANDAH05。利用农杆菌转化法将干涉载体pANDAH05及对照空载体pANDA35HK分别转化突变体原始亲本日本晴幼胚。转基因阳性植株表型观察结果显示:干涉载体pANDAH05转化日本晴幼胚后,T0代植株出现了类似于突变体1ah137的表型,叶片明显变窄,卷曲程度增加,株高降低;对照空载体pANDA35HK转化日本晴幼胚后,T0代植株仍保持野生型表型;Real-timePCR检测结果显示:日本晴转干涉载体pANDAH05后,目的基因表达量明显降低,干涉强度不同目的基因表达量降低程度不同,研究结果表明目的基因OsCSLD4在水稻叶片形态发育过程中起着非常重要的作用。 相似文献
14.
通过基因工程手段加强八氢番茄红素合成酶（Psy）基因的表达和通过RNAi抑制番茄红素β-环化酶（Lcy）基因（该基因是调控番茄红素转化为其他类胡萝卜素的主要的基因）的表达是培育高番茄红素品种的重要手段之一。根据GenBank中拟南芥的Psy基因序列（NM-121729），通过聚合酶链式反应（PCR）从拟南芥的cDNA中扩增出了长1296的Psy基因。根据GenBank中番茄的Lcy基因序列（X86452）和Pds启动子序列（U46919）分别设计特异引物从番茄中扩增出了Lcy基因的高度保守的长302bp的DNA片段和长1790的Pds启动子片段。根据RNAi的原理，将Lcy基因的长302bp的DNA片段以正反两个方向通过一段内含子序列连接在一起形成RNAi片段插入到抗Kan的pVCT2020的表达载体中，并通过具有果实特异性特点的启动子——八氢番茄红素去饱和酶基因（Pds）启动子控制该干扰片段的表达，同时将Psy基因在Pds启动子调控下插入到同一载体中，从而构建成了能同时加强Psy基因的表达和抑制Lcy基因表达的植物表达载体。 相似文献
15.
脯氨酸是水分胁迫植物中最常见的渗透保护物质之一,脯氨酸脱氢酶（ProDH）是存在于线粒体内的催化脯氨酸降解的关键酶,构建RNAi表达载体转化青花菜可以抑制脯氨酸分解提高其抵抗干旱胁迫和盐胁迫的能力。本研究利用同源重组和RACE技术克隆青花菜脯氨酸脱氢酶基N（ProDH）,以酶切、连接的方法利用载体pFGC1008构建植物RNAi表达载体pFGC—PDHi。序列分析表明,本文首次克隆了1595bp的青花菜脯氨酸脱氢酶基因cDNA全长,该序列编码498个氨基酸;序列比对发现该核酸序列与拟南芥、甘蓝型油菜、芜菁分别有83．26％、89．07％和97．73％的同源性,其氨基酸序列和拟南芥、甘蓝型油菜、芜菁分别有89．78％、91．38％和98．80％的同源性。测序和酶切鉴定表明青花菜ProDH基因RNA干扰表达载体已经构建成功,并将其转化青花菜得到转化株,经PCR检测,转化株均为阳性株,证明干扰载体的T-DNA区已经成功地整合到了青花菜基因组中。研究还发现在外源的L-脯氨酸存在时,转化株的脯氨酸脱氢酶的活件受到了明显的抑制。本研究为青花菜的抗旱育种提供了非常有价佰的新种质材料。 相似文献
16.
作为类黄酮途径的第二步关键酶,查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)催化四羟基查尔酮成为柚皮素,用于合成各种类黄酮物质,影响多种性状。芸薹属含有多种重要的油料、蔬菜和观赏植物。本研究从甘蓝型油菜克隆了芸薹属CHI基因家族的干扰片段BCHII(761bp),采用NcoⅠ+AatⅡ和BamHⅠ+XbaⅠ双酶切方案分别将其反义片段和正义片段亚克隆到植物RNA干扰(RNAi)平台载体pFGC5941M的启动子与间隔区、间隔区与终止子之间,形成了11674bp的RNAi载体pFGC5941M-BCHII(简称pBCHII),多种PCR检测表明2个片段的插入方向正确,重组载体完整,将其转化根癌农杆菌菌株LBA4404以后获得了工程菌株LBA4404-pBCHII-①。本研究结果将促进研究CHI与芸薹属异花授粉、植株色彩、黄籽和抗逆性等性状的关系和开展相关分子育种。 相似文献
17.
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC）是控制植物体中蛋白质和脂肪酸含量比例的关键酶。本研究从棉花中克隆得到船PC基因,长度为433bp,并将该基因的正反义片段分别和种子特异性启动子napin启动子（1123bp）、α球蛋白B基因启动子（1149bp）连接,插入到植物表达载体pCADS1341中。经酶切和PCR鉴定,成功的构建了PEPC基因的种子特异性ihpRNA表达载体pCADSNPSPA和pCADSBPSPA,为后期高含油量棉花材料的选育打下了基础。 相似文献
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RNA干扰技术在植物寄生线虫中的应用 总被引：1，自引：0，他引：1
已证实在植物寄生线虫中存在RNA干扰(RNAi)现象,当寄生前的线虫幼虫或卵吸取能激发系统RNA干扰反应的双链RNA后,能诱导特定类型细胞中的基因表达沉默。RNAi将成为基因组范围内鉴定基因功能的有力工具,可以帮助更好地了解植物寄生线虫。最近的研究描述了RNAi技术在植物寄生线虫中的作用机制、途径、表现型的决定、专化性和持久性等。研究进展表明,植物双链RNA表达靶定的线虫基因能够成功地诱导线虫基因沉默。 相似文献