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1.
鸡白介素-2基因在大肠杆菌中表达及多克隆抗体制备* 总被引：3，自引：0，他引：3
将编码鸡(Gallus gallus)白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)蛋白的基因亚克隆到大肠杆菌(Eschetichia coli)原核表达载体pPROEX^HT中，构建重组质粒并进行确证性序列测定。然后将重组质粒转化大肠杆菌DH5α并用IFTG于37℃诱导培养。SDS-PAGE和Western blot分析显示，表达的鸡IL-2融合蛋白分子量约为19kD。融合蛋白经薄层扫描发现目的蛋白表达量约占菌体蛋白的30％。包涵体被6mol／L，盐酸胍裂解后，通过镍离子亲和树脂进行了纯化。用所获得的重组鸡IL-2融合蛋白及其纯化产物免疫家兔，制备兔抗鸡IL-2多克隆抗血清，并用琼脂扩散实验对多克隆抗血清进行鉴定，表明其与纯化的重组鸡IL-2蛋白具有良好的反应性，而且该反应是特异的。 相似文献
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摘要：斜纹夜蛾多粒包埋型核型多角体病毒（Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedrovirus，SpltMNPV）bjdp (baculovirus J domain protein) 基因是杆状病毒基因组中唯一编码J 结构域蛋白的基因。利用PCR方法扩增得到此全长基因，将其克隆到5'端有6×His编码序列的原核表达载体pQE30上并转化E. coli M15[pREP4]， 在IPTG诱导下表达了一个分子量为36 kD的融合蛋白。以纯化过的6×His-BJDP融合蛋白为抗原，免疫新西兰大白兔，得到该蛋白的抗血清。免疫印迹分析表明，该抗血清能与感染斜纹夜蛾多粒包埋型核型多角体病毒的细胞蛋白样品发生特异性反应。 相似文献
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将猪源Ｏ型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)VP1基因克隆到原核表达载体pMBX上，成功地构建重组表达质粒pMBX-VP1。将其转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞中，经SDS-PAGE分析，融合蛋白分子量约为58 kD，表达产物占菌体总蛋白的35.5％。 经蛋白可溶性分析，目的蛋白在裂解沉淀中占6.8％，在裂解上清中占31.2％，融合蛋白绝大部分是以可溶形式表达的。经Western blot证实，可溶表达的融合蛋白与FMDV阳性血清具有良好的免疫反应性。将可溶表达的融合蛋白用50%Ni-NTA树脂纯化，用融合蛋白作包被抗原，通过ELISA方法，能特异性地检测出口蹄疫阳性血清。 相似文献
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中国野生华东葡萄抗白粉病转录因子VpRFP1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备 总被引：1，自引：0，他引：1
为揭示中国野生华东葡萄抗病转录因子基因在与葡萄白粉病互作过程中的作用机制,本研究以中国野生华东葡萄(Vitis pseudoreticulata W.T.Wang)高抗葡萄白粉病株系白河35-1为材料,接种葡萄白粉病菌(Unicinula necator(Schw.)Burr.)病原菌诱导后7个不同时期的反转录产物为模板,用RT-PCR扩增得到V.pseudoreticulata RING-finger protein1基因(VpRFP1)的开放阅读框1053bp;将其克隆到pMD19-T载体经测序后,亚克隆到pGEX-4T-1原核表达载体并转化大肠杆菌(Escherichia.coli)BL21;经IPTG诱导表达出64kD的融合蛋白GST-VpRFP1,主要以包涵体表达形式存在;采用电透析法纯化融合蛋白,并以纯化产物免疫新西兰大白兔获得抗血清,Western blot检测免疫-抗原反应良好。本研究结果表明,在27℃、0.1mmol/L的IPTG诱导4h融合蛋白GST-VpRFP1的表达量最大,免疫大白兔获得的抗血清能够用于VpRFP1基因的功能分析。 相似文献
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本研究以本实验室保存的含重组载体pDEST17-NSP的原核表达菌株E．coliBL21（DE3）为材料，于25℃、0．1mmol／LIPTG条件下诱导4h，集菌后超声波破碎，获得以包涵体形式表达的约20kD的融合蛋白。实验结果表明，将沉淀的融合蛋白溶于含6mol／L尿素的Binding Buffer中，再经Ni^2＋-NTA亲和层析纯化后，可获得高纯度的融合蛋白。将纯化融合蛋白经12％SDS-PAGE电泳，切胶回收目的带，液氮研磨并按1：1（W／V）混合佐剂，4次免疫家兔，获得BBTV病毒核穿梭蛋白的特异性抗血清。以融合蛋白作抗原，间接ELISA法测定其抗血清效价为1：5000。田间检测样品的最佳抗血清工作浓度为1：500。Western Blot鉴定结果表明抗血清能与目的蛋白特异性结合。本研究的结果将为下一步NSP基因转录调控和蛋白功能研究奠定一定基础。 相似文献
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鸡输卵管组织特异性分泌表达载体的构建和表达 总被引：4，自引：0，他引：4
摘要：为了实现外源基因在鸡(Gallus gallus )输卵管上皮细胞内的特异性分泌表达，采用RT-PCR的方法扩增了鸡溶菌酶基因的450 bp的cDNA片段，该片段保留了5ˊ端信号肽编码序列。将该片段插入到含有1.2 kb卵清蛋白5ˊ调控序列的特异性表达载体pOVA-GFP中，与绿色荧光蛋白基因形成融合基因，使融合蛋白具有分泌功能。新构建的分泌表达载体pOVALG转染鸡胚成纤维细胞和大鼠乳腺上皮细胞系SHZ-88后，成功地检测到了绿色荧光蛋白的表达。 相似文献
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手掌参中赤霉酸诱导的富含半胱氨酸蛋白基因的表达、纯化及鉴定 总被引：3，自引：0，他引：3
目的: 构建含赤霉酸诱导的富含半胱氨酸蛋白基因(gcgasa)的原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达。材料：手掌参。方法：设计带有EcoR I和Hind III酶切位点的引物,分别对gcgasa基因编码区全长及信号肽缺失的片段进行PCR扩增,将目标片段克隆入原核表达载体pET-32(a),构建重组质粒。经测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白,并采用SDS-PAGE、Western-blotting、电镜超薄切片技术检测外源蛋白的表达及定位情况。对于水溶性蛋白,采用Ni2+-NTA亲和层析及凝胶过滤手段纯化。结果: 含有信号肽的外源基因在大肠杆菌周质空间中以包含体形式存在,而信号肽缺失的片段主要以可溶形式表达,经Ni2+-NTA纯化可获得目的蛋白。结论：首次在原核表达系统中高效表达了水溶性的gcgasa蛋白,为其结构和功能的研究奠定了基础。 相似文献
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猪细小病毒VLPs供外源蛋白插入的候选位点发现及其重组PCV2-ORF2的病毒样颗粒构建 总被引：2，自引：0，他引：2
先将猪细小病毒(PPV)SC-1株VP2基因扩增产物克隆到pMD18-T载体构建质粒pMD-VP2;设计两对引物(分别引入Hind Ⅲ和Sac Ⅰ两个酶切位点)扩增猪圆环病毒二型(PCV2)SC株ORF2基因,构建了pMD-ORF2.A和pMD-ORF2.B两质粒;经相应内切酶酶切后回收目的片段,插入PPV SC-1株VP2基因的Hind Ⅲ和Sac Ⅰ两个特异限制酶切位点处(分别对应于PPV VP2蛋白N端和C端1/3处),得到重组质粒pPVP2-ORF2.A和pPVP2-ORF2.B.经鉴定后的质粒pPVP2-ORF2.A和pPVP2-ORF2.B用Kpn Ⅰ、BamH Ⅰ和ApaL Ⅰ三酶切,回收含VP2和ORF2基因的目的片段克隆至真核表达载体(pEGFP-C1),得到重组质粒pEGFP.VO.A和pEGFP.VO.B.脂质体法转染重组质粒于Cos7细胞后,采用荧光显微镜和电镜观察基因表达情况,结果仅在转染pEGFP.VO.A的样品中观察到了病毒样颗粒(VLPs).纯化VLPs免疫小鼠,结果显不能产生较好的细胞免疫和针对PPV和PCV2的特异性体液免疫,该结果表明研究中获得了PCV VP1-PCV2ORF2重组VLPs,同时也揭示PPV VPLs的N端1/3适于外源蛋白插入构建重组VLPs 相似文献
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液泡加工酶(VPE)基因是植物内启动和执行细胞程序性死亡的关键基因,β型VPE是种子特异表达并且为种子蛋白成熟所必须的基因.本研究以黑比诺葡萄(Vitis vinifera cv.Pinot Noir)花后8个不同时期胚珠的cDNA混合样为模板,通过RT-PCR扩增得到葡萄β型液泡加工酶基因(暂命名VvβVPE,GenBank登录号:KC136352),开放阅读框1 485 bp.进一步将VvβVPE克隆到pGEX-6P-1原核表达载体并转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中,经IPTG诱导,获得约81.3 kD的包涵体融合蛋白GST-VvβVPE.将诱导条件优化后,在37℃、0.05 mmol/L IPTG诱导5h后融合蛋白GST-VvβVPE的表达量最大,采用电透析与盐酸胍处理后透析复性两种方法获得纯化包涵体蛋白,电透析纯化法获得纯化包涵体蛋白的浓度可达到免疫要求.使用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗血清,经Western blot检测,该抗血清(稀释到1∶10 000)与GST-VvβVPE融合蛋白识别反应良好,获得的抗血清可用于以后的VvβVPE的酶活性分析、免疫亚细胞定位分析以及转基因植株蛋白水平的鉴定等,为进一步明确VvβVPE在葡萄胚珠发育中的作用提供基础数据. 相似文献
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制备鸡(Gallus gallus)肝脏胆汁酸结合蛋白(L-BABP)的多克隆抗血清,并分析L-BABP的组织表达特性.利用RT-PCR扩增L-BABP基因的CDS区,构建鸡L-BABP基因的GST融合蛋白表达质粒pGEX-4T/L-BABP.将重组表达质粒转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中,经IPTG诱导后产生GST/L-BABP融合蛋白,利用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化目的蛋白,将纯化的GST/L-BABP融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗血清.诱导得到了1个38 kD(12 kDL-BABP+26 kD GST)的融合蛋白,经间接ELISA方法测定制备的抗血清效价为1:100 000.利用此抗血清分析鸡L-BABP的组织表达特性,结果表明该基因仅在肝脏组织中特异性表达,在肾、肺、腿肌、腺胃、胸肌、心脏、脂肪、脾、回肠、肌胃、空肠和十二指肠等12种组织中没有检测到表达信号.本研究制备的高效价、高特异性的鸡L-BABP抗血清,为从蛋白水平上深入研究L-BABP的生物学功能提供了良好的基础. 相似文献
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本研究利用PCR方法扩增出Ⅰ群禽腺病毒FAVⅠhexon基因主要抗原区,连接于表达载体pGEX-4T-1中,构建成重组质粒pGEX-hexon,并转化大肠杆菌DH5α,用IPTG诱导表达,对表达的Hexon蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western-blot分析。结果显示,试验成功扩增获得hexon基因主要抗原区序列,大小为1020bp。重组蛋白主要以包涵体形式存在,融合蛋白大小为63.1ku,与预测值相符。经Western-blot分析,表明重组蛋白与FAVⅠ的阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性,为FAVⅠ诊断试剂盒的研制奠定基础。 相似文献
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33K蛋白是Ⅰ群禽腺病毒（fowl adenovirus groupⅠ,FAVⅠ）的非结构蛋白,在感染的过程中起重要作用。为了构建原核表达载体pGEX-33K作为诊断抗原,本研究根据GenBank中FAVⅠ33K基因序列,设计1对特异性引物。用PCR方法扩增目的片段,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建了重组质粒pGEX-33K。将其转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,pGEX-33K表达的分子量为36.7KD,表达产物主要以可溶性的形式存在于菌体中;最佳IPTG诱导浓度为0.75mmol/L,最佳诱导时间为4h;经Western Blot鉴定,pGEX-33K重组蛋白可与FAVⅠ阳性血清发生特异性反应,为FAVⅠ抗体ELISA鉴别诊断试剂盒的研究奠定基础。 相似文献
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根据Gen bank中公布的牛抗菌肽bac7、bac5和防御素（LAP）成熟肽基因序列,人工合成了抗菌肽融合基因Bac7-Bac5-β,克隆到BAC-TO-BACTM重组杆状病毒表达系统的pFAST HTb载体中,构建了重组转座载体pFASTBac-B7-B5-β,转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,PCR方法筛选阳性菌落,抽提大分子质粒DNA,获得重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-B7-B5-B,转染昆虫草地夜蛾Sf9细胞出现病变后,收集含有重组病毒颗粒的培养上清,重新感染草地夜蛾Sf9单层细胞,收集Sf9细胞超声破碎,12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳可见表达的融合蛋白带,分子量大小为20kD,与预测大小相符,表达量约占细胞总蛋白的10.6％。体外抑菌实验表明重组的rB7-B5-B蛋白对大肠杆菌具有抑菌活性,本研究为新型抗菌制剂的研制和开发奠定了基础。 相似文献
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参照GenBank中小反刍兽疫病毒((Peste des petits ruminants virus,PPRV)N基因序列（Nigeria/75/1）(1 578 bp)设计了1对添加EcoRⅠ和Not Ⅰ酶切位点的引物,对从奥地利引进的pCI-neo-PPRN质粒进行PCR扩增,克隆至pGM-T载体,并转化大肠杆菌Escherichia. coli TOP10感受态细胞,获得重组质粒pGM-T-PPRN。将重组质粒经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切的产物插入原核表达载体pET-32a（+）,构建原核表达质粒pET-PPRN,将其转化进BL21(DE3)感受态细胞中后用IPTG诱导表达, 收集菌液进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析,结果表明小反刍兽疫病毒N基因在BL21(DE3) 成功表达。所表达融合蛋白的相对分子质量约为80 kD,并能被组氨酸单抗、PPRV标准阳性羊血清及PPRV疫苗免疫羊血清所识别。 相似文献
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高恒 《农业生物技术学报》2009,17(4)
目的 克隆牛杀菌/通透性增强蛋白(BPI)N端cDNA,构建原核表达载体,在大肠杆菌中表达BPI蛋白,并纯化重组蛋白。方法 参照Genbank报道的序列,应用RT-PCR技术,从牛嗜中性粒细胞mRNA中扩增出杀菌/通透性增加蛋白基因,然后将该基因插入原核表达载体pGEX-4T-1中,重组质粒转化大肠杆菌BL21,进行诱导表达。结果 获得BPI N端长度为714 bp的基因片断,序列分析证实该片断中有1个点突变。大肠杆菌中的表达产物为相对分子质量约为52×103的GST-BPI融合蛋白。结论 成功的表达和纯化了BPI重组蛋白。 相似文献
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构建亚非马蜂(Polisteshebraeus)溶血肽基因重组转移载体pBacHT-GFPTPhMT,转化含穿梭载体Bacmid的受体菌Escherichiacoli(DH10Bac)中,得重组穿梭载体Bacmid-GFPTPhM,再用Lipofectin介导其DNA转染粉纹夜蛾(Trichoplusiani)细胞系Tn。SDS-PAGE分析表明,感染Bacmid-GFPTPhM的Tn-5B1-4细胞的表达产物在约为34kD处出现特异性条带,表达量约占细胞总蛋白的3%。Westernblot显示表达产物具有良好的免疫活性。感染Bacmid-GFPTPhM的细胞表达时相动态分析进一步表明,与增强型绿色荧光基因融合的亚非马蜂溶血肽基因的重组病毒已在昆虫细胞中进行了成功地表达,感染后72h表达量可达最高水平。 相似文献
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摘要：利用PCR技术，扩增去除部分序列、长度为1320 bp、编码440个氨基酸的禽流感病毒(AIV)NP基因片段，将其克隆至pR质粒的T4噬菌体SOC基因C末端获得重组质粒pR-NP，以此重组载体转化大肠杆菌E2，用溶菌酶缺陷噬菌体T4-Z1感染重组E2菌，重组载体与缺陷噬菌体T4-Z1基因发生同源重组，将NP基因整合到噬菌体基因组中，用PCR方法筛选重组噬菌体并命名为T4-Z1-NP。经Western blot检测证实，T4-Z1-NP表达的NP融合蛋白具有免疫学活性。成功构建了表达禽流感病毒核蛋白的重组噬菌体。 相似文献