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H9亚型禽流感病毒环介导等温扩增检测方法的建立与荧光指示剂的应用 总被引：1，自引：0，他引：1
利用反转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP),建立了一种特异、灵敏、便捷的H9亚型禽流感病毒(H9subtype of avian influenza virus,H9-AIV)的检测方法。该方法使用了对应于H9亚型禽流感病毒血凝素(hemagglutinin HA)基因的8个不同区域的6条特异引物,在63℃的等温条件下反应,最低可检测到103拷贝的目的基因重组质粒片段,较RT-PCR方法敏感10倍。通过对15种H亚型禽流感病毒、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)的检测表明,该方法具有良好的特异性。在反应体系中使用钙黄绿素与Mn2+的混合溶液作为荧光指示剂可以用于RT-LAMP结果判定,并且其判断结果与浊度判断结果一致。对109份禽咽喉拭子及泄殖腔拭子临床样品进行检测,RT-LAMP与RT-PCR检出阳性样本数分别为61份和46份,表明RT-LAMP方法阳性检出率高于RT-PCR。 相似文献
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环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种快速、灵敏度高和特异性强的等温核酸扩增技术,已被广泛用于各领域.与此同时,高灵敏度也使得扩增时极易出现交叉污染,而利用闭管检测技术能有效降低其污染机率.本研究引入了一种新型的金属指示剂-酸性络蓝K (acid chrome blueK,ACBK),建立了闭管LAMP扩增和检测结果可视化检测技术.首先,本研究分别在LAMP 扩增的起始体系中,先后分别测试ACBK与缓冲液、dNTPs、引物和Mg2+等组分反应,确定了含有ACBK的LAMP体系中的颜色变化由Mg2+决定,化学方法也进一步验证了这一结论.随后,对LAMP检测体系中的ACBK指示剂的浓度及Mg2+的浓度进行了选择和优化,最终选定25 μL扩增体系中ACBK的检测浓度为:2 μL 0.04％ ACBK,Mg2+浓度为:6 mmol/L.以胭脂碱合成酶基因终止子(terminator of nopaline synthase gene,TNOS)为靶基因,建立了TNOS-ACBK-LAMP检测体系.建立的体系的检测灵敏度针对转基因水稻的检测限为100拷贝,在分别含有50 ng的水稻(Oryza sativa)、大豆(Glycine max)、油菜(Brassica napus)和玉米(Zea mays)基因组中能检测出0.1％的转基因含量.同时,利用不同转化事件及不同作物的转基因材料验证了其检测特异性,结果表明,构建的TNOS-ACBK-LAMP的检测系统具有很强的检测特异性.最终,将该检测体系成功用于对实际玉米样品转基因成分的检测,检测结果既可以裸眼直接判断也可以借助紫外可见光谱分析.该方法的建立为可以加快转基因成分检测的速度,同时也为等温扩增方法的判断提供了新的思路. 相似文献
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荧光显色在环介导等温扩增（LAMP）检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的应用 总被引：5，自引：0，他引：5
介绍了一种应用荧光显色的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)的检测方法.该方法使用了针对靶序列M+N基因的一组引物,并且能在63 ℃等温条件下30 min内完成反应.在敏感性检测中RT-LAMP与RT-PCR都能检测103个包含靶基因片段的重组质粒.几种其它病原的核酸也被用来比较这两种方法的特异性,两种方法只能检测PRRSV.在荧光显色剂应用试验中,证实0.05 mmol/L钙黄绿素以及0.6 mmol/L锰离子可以用于LAMP扩增产物的判断,并且其判断结果与浊度判断结果一致.在对103个临床血液样本的检测中,RT-LAMP与RT-PCR检出的阳性样本数量分别是56个和48个.结果说明,应用荧光显色剂的RT-LAMP检测方法可以快速检测PRRSV. 相似文献
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环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测转基因玉米LY038 总被引：3，自引：0，他引：3
为了施行对转基因作物的监管,许多国家和机构制定了转基因标识制度的相关条例,因此建立针对转基因产品的检测方法是十分必要的.本研究运用环介导等温扩增技术(LAMP)建立了对转基因玉米(Zea mays L.) LY038外源基因的快速检测技术,该方法依据cordapA基因的序列设计了4条特异性引物,结果表明,引物特异性良好,该检测体系在63℃恒定温度下,反应50 min,可检测到0.01％的样本,是常规PCR方法的5倍.该检测方法具有高度的特异性、灵敏性和稳定性,该方法不需要特殊仪器、快速简便,在基层和现场检测中有很好的应用前景. 相似文献
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为建立能快速检测猪蓝耳病病毒（PRRSV）的检测方法,本研究根据基因库中PRRSV非结构蛋白NSP2基因的保守序列,设计了一套特异性环介导等温扩增（RT-LAMP）引物,建立了PRRSV的RT-LAMP可视化检测方法。该方法的敏感性可达10 copies RNA,高于常规PCR方法 10倍;全部反应可以在50 min内完成;可通过肉眼观察钙黄绿素（calcein）颜色变化直接判定结果;对其它常见病原体的检测结果均为阴性,同时应用实时浊度仪对反应体系浊度及浊度的变化速率进行实时测量,结果相一致。结果表明建立的RT-LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于PRRSV感染的快速检测。 相似文献
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环介导核酸等温扩增(LAMP)技术可在恒温条件下特异、高效、快速地扩增靶序列,对仪器要求低,还可节约试剂成本。本文综述了基于LAMP技术的快检技术研究进展,拟为食品安全领域快检技术的发展提供参考。 相似文献
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为建立一种快速准确检测马铃薯卷叶病毒(potato leafroll virus,PLRV)的方法,本研究以PLRV CP(coat protein,CP)基因ORF3保守序列为靶标,建立了PLRV反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测体系,并对建立的RT-LAMP检测体系的特异性、灵敏度、实际应用效果进行评估。结果表明,建立的PLRV RT-LAMP检测方法,在62℃恒温下扩增50 min,扩增产物中加入双链嵌合荧光染色(SYBR Green Ⅰ),阳性样品颜色变为绿色,阴性样品颜色仍为褐色,可直接目测判断待检测样品是否感染PLRV。该方法只特异性检测PLRV,不与马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯A病毒(PVA)和马铃薯M病毒(PVM)等其他5种马铃薯主要病毒发生交叉反应。此外,建立的PLRV RT-LAMP检测方法的灵敏度较反转录PCR(RT-PCR)方法高100倍。田间样品检测验证,该方法与标准RT-PCR方法符合率达100%。本研究建立的以SYBR Green Ι为颜色指示的PLRV可视化检测RT-LAMP方法,特异、灵敏、便捷,成本低,可满足科研、基层单位对该病毒快速诊断和检测的需要。 相似文献
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《农产品质量与安全》2015,(5)
环介导等温扩增技术(LAMP)是一种新型的基因扩增方法。本试验以牛奶为研究对象,采用LAMP方法检测其中沙门氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157、志贺氏菌和单增李斯特菌,并与国标方法进行比较。结果表明,LAMP方法和国家标准方法检测结果一致,结果符合率为100%,重复性好,灵敏度≤2 CFU/25g,特异性高。LAMP方法可广泛应用于牛奶中致病菌的快速检测。 相似文献
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伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)传统诊断方法具有程序繁琐、周期长、成本高、特异性差等缺点,本实验建立了敏感、特异的PRV的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并在此基础上应用金属离子指示剂羟基萘酚蓝(hydroxy naphthol blue,HNB)进行反应结果判定.实验选取保守性较高的gB基因(glycoprotein B,糖蛋白gB)筛选引物,确定反应体系后,可在45 min内完成检测.LAMP方法特异性与PCR方法一致,敏感性是PCR方法的100倍,最低能够检测10个拷贝的目的基因.在HNB的应用试验中,发现LAMP反应体系中,HNB浓度为150 μmol/L时,阴阳性的颜色对比明显且反应的敏感性最高,可用于LAMP扩增产物的判断.临床样本的检测结果表明,PCR方法和LAMP方法的检出率一致.因此,本研究中所建立的LAMP方法是一种高度特异敏感的,可替代PCR方法的检测技术. 相似文献
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牛支原体(Mycoplasma bovis是感染牛的一种重要的致病性病原体.本研究利用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术建立了牛支原体的快速检测方法.该方法以牛支原体保守性基因uvrC为靶序列设计了5条特异引物,在58℃等温条件下,60 min即可完成反应.LAMP方法能检测出20 pg牛支原体DNA,较PCR方法高100倍,用牛鼻支原体(M.bovirhinis)、无乳支原体(M.agalactiae)、精氨酸支原体(M.ariginini)、牛副流感病毒(BPIV)、牛腺病毒(BADV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)作特异性检测,两种方法均有很高的特异性.本研究还将荧光显色剂钙黄绿素(calcein)和Mn2+用于LAMP反应结果的可视化检测.临床鼻拭子样品煮沸后,可直接进行等温扩增,省去了DNA提取步骤.在对167个临床鼻拭子样本的检测中,LAMP方法检测结果阳性率(26.95％)高于PCR方法检测出阳性率(19.16％),这证明本研究所建立的方法,与PCR法比较更适于临床样品的检测.研究结果表明,LAMP方法具有操作简便、快速、高效、敏感、特异、经济等特点,适于基层实验室监测的广泛使用. 相似文献
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利用环介导等温扩增技术快速检测水产品中的副溶血弧菌 总被引：7，自引：0，他引：7
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种重要的食源性致病菌。首次将环介导等温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP）应用于副溶血弧菌的快速检测。针对副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因（tlh）设计四条特异性引物,建立了副溶血弧菌LAMP检测方法,1 h即可完成。对12种细菌共28株菌进行LAMP扩增,仅副溶血弧菌得到阳性结果,证明引物具有很高的特异性;副溶血弧菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别为90 fg/LAMP反应体系和24 cfu/mL,对模拟食品样品进行直接检测,检测限为89 cfu/g;对40份水产样品进行检测,8份副溶血弧菌LAMP阳性,其中6份传统培养阳性。本研究表明,该方法检测副溶血弧菌特异性强、灵敏度高,并且操作简便、快捷、检测成本低,有望发展成为快速检测副溶血弧菌的有效手段。 相似文献
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作为水产养殖集成信息化管理的主要信息源,水产动物视觉属性信息的测量不仅是判定水产动物生长状况,调控水质环境的主要信息依据,也是对水产动物进行喂养、用药、捕获、选别和分级等操作的前提基础。近年来,计算机视觉技术作为一项快速、客观、无损的检测方法,已被逐渐用于水产动物视觉属性的测量中,许多研究学者开展了大量的研究工作。该文更新和总结了国内外近20多年来有代表性的相关研究和解决方案,在描述计算机视觉检测系统的概念和组成结构的基础上,围绕尺寸测量、形状分析、颜色识别和质量估计等方面详细分析了计算机视觉技术在水产动物(以鱼类为主)视觉属性测量方面的国内外研究现状,着重阐述总结了研究人员在水产动物视觉检测的图像采集、轮廓提取、特征标定与计算等方面的具体改进措施,并对基于计算机视觉测量的水产动物疾病诊断,识别分类等综合应用现状也进行了分析探讨,以评估计算机视觉技术在水产动物视觉质量检测领域的总体应用情况和现存的主要问题,同时给出了今后的研究趋势与发展方向。 相似文献
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新鲜度是判断水产品品质的一项重要指标。传统新鲜度检测方法大多繁琐、费时费力,建立快速便捷的检测方法具有重要的现实意义和学术价值。生物传感器操作简单、检测快速、成本低,近年来被广泛研究应用于水产品新鲜度的检测。本文在简要阐述传统和新型新鲜度检测方法的基础上,综述了生物传感器在水产品新鲜度检测上的应用,着重介绍了酶固定载体和纳米传感器方面的最新进展,并概述用于水产品新鲜度检测的生物传感器技术当前存在的问题及发展趋势,旨在为该光传感器的后续研发提供参考。 相似文献
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猪胸膜肺炎放线杆菌环介导等温扩增检测方法的建立与应用 总被引：1，自引：0，他引：1
本文建立了敏感、特异的胸膜肺炎放线杆菌环介导等温扩增检测方法。以1型胸膜肺炎放线杆菌ApxIV基因片段为靶序列设计了一组引物,并建立了LAMP反应体系,在63℃等温条件下反应45min,最低能检测到102个拷贝的目的基因,敏感性是PCR方法的10倍。通过对1～10型胸膜肺炎放线杆菌、多杀巴氏杆菌、链球菌、支原体等18种病原微生物的检测,证明该法具有很强的种特异性。另外,通过对8头实验感染猪和127份临床发病猪的鼻拭子的检测发现,该法对鼻拭子中胸膜肺炎放线杆菌的检出率为100%,优于PCR方法。 相似文献
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环介导等温扩增技术快速检测大西洋鲑的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为探究环等温扩增技术(LAMP)在鲑科鱼类物种鉴定方面的应用,以大西洋鲑为研究对象,针对其线粒体CR区段设计特异性的LAMP引物,并通过单因素试验和正交试验研究反应体系中d NTP Mix、Mg~(2+)、甜菜碱终浓度对LAMP扩增结果的影响。结果表明,大西洋鲑LAMP扩增的最优条件为:引物SS-CR-F3/SS-CR-B3各0.2 m M,SS-CR-FIP/SS-CR-BIP各1.6 m M,dNTP Mix 1.4 m M,Mg~(2+)6 m M,甜菜碱0.8M,Bst DNA聚合酶8 U,扩增温度为65℃,反应时间60 min。在此条件下LAMP扩增产物电泳检测特异性强、稳定性好,对大西洋鲑DNA的检出限达0.01 ng·μL~(-1),并可对混合样本进行检测。本研究结果为大西洋鲑快速物种鉴定提供了一种重要技术手段,该技术可应用于鲑科鱼类物种鉴别的日常检验检疫和市场监管工作中。 相似文献
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荧光原位杂交（FISH）技术应用于哺乳动物性别鉴定,近年来取得了长足进展。本文阐述了荧光原位杂交技术的原理及其在胚胎性别鉴定方面和精细胞筛选鉴定方面较PCR法和LAMP法所具有的优势,并着重概述了该技术在人类医学和家畜性别鉴定方面的研究进展和应用前景。 相似文献
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Detection and quantification of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) is important for any work with this group of root symbionts. We here applied loop-mediated amplification (LAMP), an isothermal DNA amplification technique, to AMF under in vitro culture conditions. In this first application of LAMP to AMF, we introduce LAMP primers that were able to amplify AMF DNA from colonized carrot roots (Glomus intraradices), and genomic DNA from several taxa of AMF (input template as low as 1×10?2 ng). This study is the starting point for testing this method under more challenging environmental conditions. 相似文献
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Wang X Teng D Tian F Guan Q Wang J 《Journal of agricultural and food chemistry》2012,60(18):4586-4595
Three methods of DNA extraction from feed products and four detection methods for the 5'-junction fragment of genetically modified (GM) Roundup Ready soybean (RRS) were compared and evaluated. The DNA extraction methods, including cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), sodium dodecyl sulfate (SDS), and guanidine hydrochloride (Kit), were assessed for their yields and purity of DNA, extraction time, and reagent cost. The DNA yields of CTAB, SDS, and Kit were 52-694, 164-1750 and 23-105 ng/mg sample, and their extraction time was 2.5-3, 2-2.5, and 1.5-2 h with reagent cost about US dollar 0.24, 0.13, and 1.9 per extraction, respectively. The SDS method was generally well suited to all kinds of feed matrices tested. The limits of detection for the four amplification protocols, including loop-mediated isothermal amplification (LAMP), hyperbranched rolling circle amplification (HRCA), conventional polymerase chain reaction (PCR), and real-time PCR, were 48.5, 4.85, 485, and 9 copies of the pTLH10 plasmid, respectively. The ranked results of the four detection methods were based on multiattribute utility theory as follows (from best to worse): HRCA, LAMP, PCR, and real-time PCR. This comparative evaluation was specifically useful for selection of a highly efficient DNA extraction or amplification method for detecting different GM ingredients. 相似文献