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采用PCR定点突变技术,将家蝇(Musca domestica)防御素抗菌肽成熟肽段的基因(des-hf)第32位氨基酸残基由甘氨酸(G)突变为带正电荷的精氨酸(R),构成第一个突变体des-hf-MU1;采用同样的方法在des-hf基因的C端加上6个带有正电荷的赖氨酸(K),构成第2个突变体des-hf-MU2.采用毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统对上述2个突变体进行表达.抗菌特性表明,抗菌肽突变体对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)有较好的抑菌活性.琼脂孔扩散法检测des-hf-MU1和des-hf-MU2的抑菌效价比des-hf分别提高了2.4和8.0倍.酸稳定性试验显示,抗菌肽突变体在pH值为5～6时活性最高,热稳定性试验显示des-hf-MU1和des-hf-MU2 100℃加热10 min后仍具有抑菌活性.显示了两抗菌肽突变体具有良好的应用前景. 相似文献
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对乳糖诱导工程菌株BL-pET-hBD3-Bra表达的人β防御素3和植物des-pGlu1-Brazzein融合蛋白进行了纯化和活性分析。并对工程菌株的乳糖诱导表达条件进行了优化。对目的蛋白的活性分析表明,hBD3-Bra融合蛋白有一定的甜味,但是杀菌活性很弱,经凝血酶切割后,重组hBD3有明显的抑菌活性,des-pGlu1-Brazzein的甜度大约为蔗糖甜度的600倍。乳糖浓度、诱导时间和诱导温度对菌株生长和目的蛋白表达的试验结果显示：高浓度乳糖对菌株生长有抑制作用（P<0.01）,对目的蛋白的表达无显著影响(P>0.05);时间延长对于菌株生长有利（P<0.01）,对目的蛋白的表达无显著影响（P>0.05);温度对菌株生长和目的蛋白的表达均有显著影响（P<0.01）。进一步的研究表明,菌株在30℃-32℃生长,在30℃诱导最优,乳糖和IPTG的诱导结果无显著差异（P>0.05)。 相似文献
3.
为了明确突变体小麦穗型变化的分子机制,对源自扬辐麦4号的穗型突变体sui1进行表型分析,并在不同的穗生长阶段（孕穗期T1、灌浆期T2）,对突变体sui1与野生型的穗轴节和穗下节进行转录组分析。结果发现,相较于野生型,突变体的穗轴节、穗下节长度变短,株高降低,赤霉病发病程度加重。转录组分析结果表明,相同时期穗下节差异表达基因多于穗轴节,相同组织孕穗期差异表达基因多于灌浆期,筛选出差异表达基因2 526个,其中上调基因890个,下调基因1 636个;对差异表达基因进行基因本体论（GO）分类发现,不同组织的分子功能注释基因在两个时期富集相同,大部分集中在三磷酸腺苷（ATP）结合上;差异表达基因京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析结果发现,植物-病原体互作通路富集基因最多,不同时期生物中的碳固定通路富集因子最高,不同组织光合作用-天线蛋白通路富集因子最高;对差异表达基因进行植物-病原体互作通路基因筛选,筛选出相关基因160个,其中防御反应基因63个（39%）,蛋白激酶活性基因21个（13%）,二磷酸腺苷（ADP）结合基因18个（11%）,推测这些基因可能对小麦突变体sui1穗轴节及穗型... 相似文献
4.
为进一步阐明植物盐代谢机理，以哥伦比亚生态型（Columbia type)野生拟南芥（Arabidopsis thaliana)及其盐敏感突变性（salt overly sensitive2,sos2）为材料，50mmol/L NaCl处理3d，利用mRNA差异显著显示技术分离得到了只在野生型拟南芥中表达，而在sos2突变体中不表达的一个未知功能的At2g29080基因片段DD156。序列同源性分析表明，它是一类大的蛋白家族AAA ATPase（ ATPase associated to a variety of cellular activities)中一员。Northern blot显示，随着NaCl处理浓度的升高。该基因在野生型拟南芥中的表达量增加。而在sos2突变体中，该基因的表达一直处于很低水平。这是首次发现AAA ATPase与植物的盐代谢有关。进一步研究发现，线粒体细胞色素氧化酶活化的变化，与与该基因在野生型和sos2突变体中的表达呈密切相关。表明该基因的编码产物可能参与了拟南芥线粒体细胞色素氧化酶活性的调控。 相似文献
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摘 要：小球藻繁殖快,培养简单,用转基因小球藻表达目的基因产物具有重要的应用前景。本研究构建了兔防御素NP-1的植物表达载体,NP-1由Ubiquitin启动子控制,含NPTII基因和硝酸还原酶基因两个筛选标记。以椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)硝酸还原酶缺失突变体nrm-4为受体,采用原生质体转化的方法将目的基因转入该突变体中。用含G418的硝酸盐培养基筛选出阳性藻落,经PCR和RT-PCR检测,证明获得了转基因藻株。转基因藻株在无抗生素筛选压力的硝酸盐培养基上继代培养后进行抑菌活性检测。研究表明,转基因椭圆小球藻表达的NP-1具有正常的生物活性,并在无抗生素的培养基中稳定遗传。本研究的结果为小球藻表达外源基因提供了新的技术途径,也为NP-1的规模化生产奠定了基础。 相似文献
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在α-螺旋抗菌肽序列比较和两亲性分析的基础上,提取序列模板,计算机辅助（螺旋轮法）设计出新型抗菌肽模式肽PGYa(Peptide以Gly开头,以Tyr-NH2结尾),然后选用毕赤酵母偏爱密码子,设计合成了PGYa基因（rPCR法）。所合成的基因全长为94bp,并在其N端引入kex2裂解位点,以保证表达抗菌肽具有天然N端。基因克隆入pPICZα-A质粒,构建分泌型酵母表达载体pPICZα-A-PGYa。在AOX1 (醇氧化酶)启动子调控下,PGYa蛋白获得分泌表达,其表达量达到132 mg/L。初步抑菌（E.coli DH5α）活性显示：PGYa有较好的抗菌活性。 相似文献
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抗菌肽在哺乳动物先天免疫系统中发挥着非常关键的作用.猪β-防御素1(pBD-1)和β-防御素2(pBD-2)是猪体内两种重要的抗菌肽.本研究采用化学方法合成pBD-1和pBD-2,通过改良的微量肉汤稀释法研究了pBD-1和pBD-2对8种革兰氏阴性菌和3种革兰氏阳性菌的抗菌活性,并利用透射电镜初步探究了pBD-1和pBD-2可能的杀菌机制;本研究还进一步探讨了pBD-1和pBD-2的体外抗氧化活性.抗菌试验结果表明,pBD-1对Escherichia coli EPEC O78:K80和Bacillus subtilis ATCC 6633具有较好的抑菌活性,最小抑菌浓度(MIC)均为32 μg/mL,最小杀菌浓度(MBC)分别为32 μg/mL和128 μg/mL;pBD-2仅对Pseudomonas.aeruginosa CMCC 10104有较好的抗菌活性,MIC为8μg/mL,MBC为32μg/mL,对其他细菌抗菌活性较弱;透射电镜观察结果表明,pBD-1和pBD-2能够作用于菌体细胞膜杀灭细菌;抗氧化活性实验结果表明,pBD-1和pBD-2在0～256 μg/mL范围内,具有清除自由基的功能和还原力,且呈现浓度依赖效应.研究结果揭示,pBD-1和pBD-2对特定细菌发挥抗菌作用的同时,还具有一定的抗氧化活性,为进一步阐明pBD-1和pBD-2的生物学功能及其开发和应用提供了基础资料. 相似文献
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植物防御素是植物免疫系统的一员,具有防御病原菌侵染植物的功能。本文采用RACE法成功地克隆花生防御素基因,并对其原核表达蛋白进行研究。研究结果表明,采用RACE方法克隆花生防御素基因（AhORRP）,得到的cDNA全长为585bp,含一个225bp的开放阅读框（open reading frame,ORF）,编码75个氨基酸;经同源分析,花生防御素蛋白与其它物种具有33％～70％的同源性。原核表达获得大小约28kD AhDRRP融合蛋白。该基因的克隆及其原核表达融合蛋白的获取为花生防御素功能鉴定打下一定基础。 相似文献
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本文以解淀粉芽孢杆菌YN-1菌株为研究对象,利用PCR方法从基因组DNA中扩增出编码TasA抑菌基因的全长DNA,并构建pGEX-4T2/TasA原核表达载体,获得TasA-GST融合表达的抑菌蛋白。测序结果表明,解淀粉芽孢杆菌YN-1TasA基因核苷酸序列全长为786bp(GenBank登录号:EU131674),编码261个氨基酸残基;同源性分析表明,它与解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens FZB42(YP_001421886)序列的同源性最高,达98%,预测蛋白分子量为31kD。SDS-PAGE分析表明,TasA基因能在大肠杆菌BL21中表达,Western印迹分析pGEX-4T2/TasA原核表达载体,检测到约57kD的TasA-GST融合外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量大小相符。表达产物细胞裂解液上清经Ni柱层析,表明浓度为500mmol/L咪唑洗脱缓冲液时获得较高浓度和纯度的纯化蛋白。进一步抑菌活性分析表明表达产物对黄瓜灰霉病病原菌检测平板上显示出较好的抑菌活性。本研究结果将为今后深入研究TasA抑菌蛋白基因以及抗病转基因工程提供了参考。 相似文献
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为明确甜樱桃砧木脱水素基因特征及其在干旱、高盐和低温胁迫过程中的表达模式,以甜樱桃砧木Y1为材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆了甜樱桃砧木脱水素基因Pc DHN1,利用生物信息学分析其编码蛋白特征,并采用qRT-PCR分析该基因的表达模式。序列分析显示,甜樱桃砧木脱水素基因Pc DHN1的c DNA全长893 bp,编码225个氨基酸,推测编码蛋白分子量约为23.98 k D,理论等电点为8.65。氨基酸序列分析显示,Pc DHN1含有2个Y-片段、1个S-片段和2个K-片段,具有植物脱水素蛋白的特征性结构,属于YnSK2型脱水素。表达特性分析显示,Pc DHN1在干旱、高盐和低温胁迫条件下受胁迫诱导而上调表达,但对低温胁迫响应比较迟缓,说明该基因可能参与了甜樱桃砧木对干旱和高盐胁迫的耐受调节过程。本研究结果为甜樱桃砧木抗逆基因工程提供了一定的参考。 相似文献
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内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中高效表达及表达条件研究 总被引：2，自引：0，他引：2
根据枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因序列设计引物,采用PCR扩增到获得去除信号肽后约1.4Kb的内切葡聚糖酶表达片段。以此片段成功构建了pPIC-End载体,并转化至巴斯德毕赤酵母GS115。经过MD、MM平板筛选和酶活性测定,获得了高效表达的转化子GS115-pPIC-EndⅠ、GS115-pPIC-EndⅦ、GS115-pPIC-EndⅧ。在摇瓶培养条件下,对酵母工程菌表达条件进行了优化研究：在pH4-8条件下均能稳定表达,诱导起始OD600=5表达水平最高,甲醇诱导最佳浓度为0.5%-1%,加大培养通气量对表达有显著的促进作用。三种工程菌在优化条件后诱导培养,酶活性可达860.7U、760.3U、786.2U,分别为原始菌株酶活（63.78U）的13.5倍、11.9倍和12.3倍。SDS-PAGE分析表明表达产物分子量约为79.82KDa,热稳定性分析表明该酶在65℃保温30min可保持最高酶活的80%以上。 相似文献
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本研究前期利用重离子诱变水稻品种科辐粳7号获得受环境响应的水稻早衰快腐突变体ad1(automatic degradation 1)植株,为研究该突变体衰老腐解的发生机制,对其进行生物学特性及遗传分析。结果表明,突变体ad1在抽穗期时遇到高温茎叶会快速腐解,引起整个植株坍塌。衰老发生时,突变体ad1净光合速率、气孔导度和蒸腾速率极显著低于野生型(WT),胞间CO2浓度极显著高于WT。突变体ad1总叶绿素含量及类胡萝卜素含量低于WT。石蜡切片观察发现突变体ad1叶肉细胞受损,排列松散,气孔结构受损;茎秆表皮变薄,厚壁组织细胞排列松散、细胞变少。透射电镜观察发现突变体ad1叶绿体结构异常,淀粉颗粒明显增多,类囊体排列紊乱,片层结构模糊,基粒垛叠松散。组织化学染色表明ad1突变体中死细胞、过氧化氢以及超氧阴离子含量比WT高。与WT相比,突变体ad1叶片中总超氧化物岐化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化力活力(T-AOC)及丙二醛(MDA)含量显著升高,可溶性蛋白(SP)含量显著降低。遗传分析表明ad1突变表型受一对隐性核基因控制。本研究结果为进一步研究突变体ad1基因定位和基因功能奠定了一定的理论基础。 相似文献
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为了提高普鲁兰酶产酶酶活,以GX-6为出发菌株,采用低能离子束修饰技术对其进行诱变,并通过响应面法优化其发酵培养基。结果表明,最佳离子束诱变参数为:注入能量10 keV、诱变剂量1×1015 ions·cm-2、诱变时间38 s,此条件下菌株正突变率比负突变率高,利用离子束诱变技术反复诱变,最终获得一株普鲁兰酶酶活较高且遗传性稳定的突变菌株GX-6-2,其酶活为2.13 U·mL-1,较出发菌株酶活(0.65 U·mL-1)提高了2.28倍。由Plackett-Burmen试验分析得到影响普鲁兰酶酶活的3个显著因素分别是玉米淀粉、麦芽糖和吐温-80。通过响应面试验得到最佳发酵培养参数为:玉米淀粉56.5 g·L-1、麦芽糖11.5 g·L-1、吐温-80 1.0 mL·L-1、黄豆饼粉 25 g·L-1、pH值7.0、发酵温度37℃、接种量3%、发酵时间24 h、装液量50 mL、转速180 r·min-1,此条件下诱变菌株的酶活为2.57 U·mL-1,较出发菌株酶活提高了2.95倍。对突变菌株的发酵特性进行初步研究发现,发酵培养24 h时,突变菌株酶活达到2.67 U·mL-1,较出发菌株提高了3.11倍。本研究结果为利用低能离子束修饰技术诱变选育普鲁兰酶产生菌提供了一定的理论参考。 相似文献
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本试验研究了突变体和原品种杂交的F_1代主要性状的表现,以及F_2代主要性状的分离变异的表现。试验表明,利用突变体和原品种进行正反交,在考察的F_1代性状中,绝大多数性状具有超高值亲本的趋势。在正反交的F_2代中,多数性状的变异系数超过了它们的杂交亲本的变异系数,说明这些性状发生了突变,其中,矮秆突变,在正反交的F_2代呈3:1的分离,表明矮秆突变为受单隐性核基因控制,而短粒突变在正反交的F_2代中表现不一致,说明突变体82—350不仅带有单隐性核基因突变,而且细胞质基因也发生了突变。辐射诱发的这种突变,在水稻杂交育种和杂种优势利用中均有学术意义。 相似文献
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实时荧光定量PCR技术在转基因猪生长激素基因差异表达中的应用 总被引：1，自引：0，他引：1
为确定猪生长激素基因(pGH)在F1代转基因猪体内的遗传稳定性及其在育肥初期表达水平的差异,利用SYBRGreenⅠReal-time PCR法检测精子介导纳米基因载体法获得的F0代母猪与非转基因公猪配种所产的7头转pGH基因猪和9头非转基因猪3月龄生长激素的表达水平。根据16个血液样品荧光定量结果绘制溶解曲线和扩增曲线图谱,并用F=(1+E)﹣ΔΔCt,公式进行Ct均值的分析,得出F1代转pGH基因猪生长激素平均表达水平是同期非转基因猪的1.77倍。结果证实,1)外源pGH基因在转基因猪体内能稳定传代;2)并非每头转基因猪体内pGH基因的表达量均高于非转基因猪;3)在F1代转基因猪体内,pGH的平均表达水平显著高于同期非转基因猪。本实验建立了能够稳定测评家猪生长激素相对基因表达水平的方法,为研究转基因与非转基因动物之间生理指标与定量表达的差异性等提供了科学依据。 相似文献
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为了深入分析SBP基因家族在谷子中的功能作用,本研究在谷子全基因组水平,通过NCBI blast及HMMER search等生物信息学方法进行了谷子SBP基因家族鉴定,分析了SBP蛋白理化性质及系统发育,利用RT-qPCR分析了谷子SBP基因在PEG和ABA胁迫下的表达情况。结果表明,谷子SBP基因家族有19个成员,位于9条染色体上,编码的氨基酸序列长度为199~1 118 aa。谷子SBP蛋白系统发育树结果显示,该蛋白家族可分为两大类:第一类分为六个亚类,第二类仅有一个SBP蛋白。谷子SBP蛋白家族成员的外显子数从2~11个不等,且均为亲水性蛋白。亚细胞定位预测结果显示,除SBP7外,所有的SBP蛋白在细胞核中均有信号。谷子SBP蛋白与拟南芥SBP蛋白在进化关系上较远,而与高粱、水稻SBP蛋白进化关系较近。谷子SBP基因家族启动子区域的顺式作用元件主要为植物激素、干旱、光照及病原菌、创伤类的响应元件。RT-qPCR分析结果显示,PEG和ABA胁迫诱导下,SBP基因在叶和茎中的表达均上调,表达量增幅表现为:叶>茎。PEG胁迫后SBP基因的表达增长量显著高于外源ABA诱导;其中,SiSBP13的表达量增幅最大,PEG胁迫4 h叶和茎中的表达量分别达到未胁迫时的180倍和15倍,ABA诱导4 h茎中的表达量最高达到未胁迫时的8倍,而叶中的表达量持续升高,24 h时达到未胁迫时的28倍。本研究为下一步深入研究SiSBPs基因在谷子生长发育阶段中的功能奠定了基础,也为谷子功能基因的挖掘利用提供了候选基因。 相似文献