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1.
陆秀君 《农业生物技术学报》2007,15(5)
从土壤中分离得到营养期对鳞翅目害虫高毒的Bt LS1菌株。分子检测菌株中存在营养期杀虫蛋白基因，进行了该基因的克隆表达。设计全长基因引物扩增得到了约2.3kb的靶片段；克隆序列分析证实为新Vip3A基因，命名为Vip3A-LS1，GenBank登录号DQ016968，Bt基因命名委员会命名为Vip3Aa22。该基因推导蛋白与其它已知同源蛋白8个氨基酸不同。构建vip3A-LS1基因的表达载体，SDS-PAGE检测约88kD目的蛋白大量表达；生物测定表明，胞内可溶性蛋白对棉铃虫和甜菜夜蛾活性最高。纯化蛋白对初孵棉铃虫和甜菜夜蛾的LC50分别为73.6和32.2µg/g。 相似文献
2.
家蚕谷胱甘肽转移酶基因的克隆、序列分析及其表达模式 总被引：2，自引：0，他引：2
谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)是昆虫体内重要的解毒酶系,在对外源和内源化合物解毒代谢中起着重要的作用。以GenBank中已知的昆虫GST的氨基酸序列在家蚕(Bombyx mori)基因组序列中作TBLASTN检索,获得了多个可能的家蚕GST同源基因。对其中的一个GST新基因进行了EST分析和克隆,结果表明,该基因编码区全长663bp。以该基因推导的氨基酸序列与其它物种的GSTs进行相似性比较和系统发育分析,发现此基因为delta家族的成员,并命名为BmGSTd3。RT-PCR结果表明,BmGSTd3基因在家蚕5龄第3天的8个组织中都有表达,中肠和表皮的表达丰度较高。在辛硫磷处理家蚕后的72h内,BmGSTd3基因的转录水平与对照组相比没有显著的变化。对BmGSTd3基因的5'侧翼区的调控序列进行了预测,共发现12个可能与内源和外源物代谢以及抗氧化相关的转录调控元件。 相似文献
3.
棉铃虫组织蛋白酶B酶原在大肠杆菌中的表达及纯化 总被引：6，自引：0，他引：6
用合成的基因特异性引物通过RT-PCR扩增，获得棉铃虫(Helicoverpa armigera)组织蛋白酶B基因(HCB)，将基因克隆到pGEX-4T-1载体，在大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α内进行扩增，经过PCR筛选获得阳性克隆并提取质粒和测序验证后，再转化大肠杆菌BL21进行诱导表达。表达产物为组织蛋白酶B-谷胱甘肽S转移酶的融合蛋白，分子量在63kD左右。表达产物形成了包涵体，经过对包涵体变性和复性处理，得到了可溶性的融合蛋白，可被Glutathione Sepharose 4B柱亲和纯化，用凝血酶裂解融合蛋白后，经SDS-PAGE分离到37kD左右的棉铃虫组织蛋白酶B酶原。N-末端氨基酸测序鉴定表达产物为棉铃虫组织蛋白酶B。 相似文献
4.
用RACE技术从西伯利亚蓼（Polygonum sibiricum Laxm.）中克隆了谷胱甘肽转移酶（PsGSTU1）基因完整编码区 cDNA序列,长度669 bp,编码222个氨基酸。经与谷胱甘肽转移酶家族其它成员的氨基酸序列比对和系统进化分析,初步确定PsGSTU1属于谷胱甘肽转移酶Tau家族。利用荧光定量RT-PCR分析表明,PsGSTU1在西伯利亚蓼的叶、茎和地下茎中均有表达,茎中表达量最高,叶和地下茎次之; 3% NaHCO3胁迫后,此基因在叶和茎中的最大表达量出现在胁迫后48 h,而茎在72 h;去胁迫后,此基因在不同部位的表达量表现为：地下茎＞叶＞茎。将PsGSTU1完整的cDNA片段连接至pET28a质粒以构建原核表达载体,并导入大肠杆菌（Escherichia coli）,经IPTG诱导后表达了分子量为26 kD的目的蛋白,表达PsGSTU1的大肠杆菌显著提高了耐受NaHCO3胁迫的能力。 相似文献
5.
从土壤中分离得到营养期对鳞翅目害虫高毒的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)LS1菌株,分子检测该菌株中存在营养期杀虫蛋白基因,进行了该基因的克隆和表达。设计全长基因引物扩增得到了约2.3kb的靶片段,序列分析证实为新vip3A基因,命名为vip3A-LS1,GenBank登录号为DQ016968,Bt基因命名委员会命名为Vip3Aa22。该基因推导蛋白与其它已知同源蛋白有8个氨基酸不同。构建vip3A-LS1基因的表达载体,SDS-PAGE检测约88kD目的蛋白大量表达;生物测定表明,胞内可溶性蛋白对棉铃虫(Helicoverpa armigera)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)活性最高。纯化蛋白对初孵棉铃虫和甜菜夜蛾的LC50分别为73.6和32.2μg/g。 相似文献
6.
利用兼并性引物克隆出棉铃虫线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅱ基因(cox2),cox2基因编码框包含682个核苷酸,编码227个氨基酸的蛋白质;起始密码子为ATG,终止密码子仅有一个T组成。利用GenBank数据库搜索了其他12种昆虫的线粒体cox2基因序列,通过同源性比较,发现棉铃虫的cox2与鳞翅目4种蚕的cox2同源性最高,核苷酸和氨基酸序列同源性分别达到85%~88%和93.0%~94.7%。同时,根据cox2核苷酸和编码的氨基酸序列进行了13种昆虫的分子系统学分析的探讨,发现分子系统树与形态分类基本一致,但略有差异。 相似文献
7.
精氨酸激酶(arginine kinase,AK)是一种磷酸转移酶,参与无脊椎动物的细胞内能量代谢.为深入了解AK在棉铃虫(Helicoverpa armigera)细胞色素P450 (cytochrome P450) CYP6B6基因表达过程中起到的作用和调控机理,基于酵母单杂交结果采用RT-PCR从棉铃虫中肠cDNA扩增得到棉铃虫精氨酸激酶(HarmAK),构建大肠杆菌(Escherichia coli)重组菌株BL21:pET28a-HarmAK,异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达后通过镍柱纯化获得目的蛋白,Western blot检测目的蛋白的表达和纯化结果,pH-分光光度法检测HarmAK蛋白的催化活性,qRT-PCR检测棉铃虫不同发育阶段和6龄幼虫不同组织中HarmAK基因的表达规律.研究结果表明,克隆得到HarmAK基因大小为1 068 bp,编码355个氨基酸,预测蛋白质分子量和等电点分别是39.8 kD和5.76.氨基酸序列分析表明,HarmAK蛋白不含信号肽和跨膜结构域.HarmAK在大肠杆菌BL21中为可溶蛋白,Western blot和pH-分光光度法结果显示,融合蛋白His-HarmAK的大小与预期一致,且活性达到(5.5±0.85) μmol/(min· mg),表明HarmAK能磷酸化L-精氨酸.HarmAK在棉铃虫的所有发育阶段和6龄幼虫的所有组织中均有表达,1龄幼虫及6龄幼虫中肠的表达量最高.本研究将为利用HarmAK基因作为分子靶标来控制棉铃虫的研究奠定基础. 相似文献
8.
棉铃虫核型多角体病毒（HaSNPV）ORF27编码区全长768bp，编码255个氨基酸残基组成的多肽，预计分子量29.5kD。PCR扩增获得该基因，克隆到融合表达载体pGEX-4t-2中，表达蛋白分子量55.5kD，表达量约占细菌总蛋白的9.2%。割胶透析法纯化融合蛋白，免疫家兔制备多克隆抗体。再把该基因插入到转移载体pFastBacHTb，转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，构建重组病毒；提取病毒基因组DNA，在Lipofectin介导下转染昆虫细胞Tn-5B1-4。表达蛋白分子量为32kD，表达量约占细胞总蛋白的2.9%。将ORF27在昆虫细胞中表达产物固定，免疫电镜法确定表达蛋白主要存在于细胞的细胞质中。ORF27基因表达及在细胞内定位为其进一步研究提供了基础。 相似文献
9.
玉米逆境响应基因ZmGST23克隆和表达分析 总被引：2，自引：0，他引：2
谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)是植物抗氧化系统的重要成员,在初生代谢、次生代谢、细胞信号转导及逆境响应等生物学过程中发挥着重要作用.本研究以GenBank中公布的玉米谷胱甘肽-S-转移酶23基因(ZmGST23)mRNA序列(GenBank登录号:NM_001111524)为依据,采用RT-PCR方法从玉米(Zea mays)自交系F83中克隆得到ZmGST23基因669 bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码222个氨基酸,蛋白分子量为24.84kD,理论等电点为5.68.保守结构域分析表明,该基因具有GSTs所特有的N端及C端结构域,并含有典型的G位点及H位点,属于Tau类谷胱甘肽硫转移酶.系统进化分析表明,ZmGST23编码蛋白与高粱(Sorghum bieolor)GST蛋白亲缘关系最近,且在不同物种间存在明显的种属特性.启动子序列分析结果显示,ZmGST23基因启动子区含有多个响应逆境及植物激素的作用元件,包括脱落酸(abscisic acid,ABA)响应元件、生长素(auxin,IAA)响应元件、赤霉素(gibberellin,GA)响应元件、厌氧响应元件、防御及逆境响应元件以及干旱诱导的MYB转录因子(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog,MYB)结合位点.胁迫诱导表达分析表明,ZmGST23的表达显著受干旱脱水、水涝、盐、ABA、IAA、GA、低温及高温等非生物胁迫的诱导.组织特异性表达分析表明,ZmGST23基因在幼芽和成熟叶片中表达量较高,在幼根、花丝、苞叶、雌穗及雄穗中表达量较低,存在明显的组织特异性.将ZmGST23基因片段连接至原核表达载体pEASY-E1中,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21,用0.5 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ3-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达1～4 h后获得30 kD的诱导蛋白.本研究结果为进一步利用该基因进行玉米抗性改良提供了一定的理论依据. 相似文献
10.
嗅觉是昆虫产生行为的基础之一,在长期进化的过程中昆虫形成了复杂的嗅觉系统,完成这一过程,需要有多种与嗅觉相关的蛋白参与,包括气味结合蛋白、化学感受蛋白、气味受体和感觉神经元膜蛋白等。了解昆虫感受外界信息的嗅觉机制可以帮助我们更好地理解昆虫识别配偶、天敌及寻找食物来源、产卵场地等行为特征,为进一步调控昆虫的行为、防控害虫侵袭、保护和利用有益昆虫奠定基础。本文综述了昆虫嗅觉相关的几类重要蛋白的生化特性和生理功能,并对昆虫气味分子的识别机制、气味分子在昆虫体内运输机制的最新研究进展进行了概述。 相似文献
11.
Glutathione (GSH) can be found in plants in considerable amounts. It is very important for numerous metabolic functions and for the detoxification of xenobiotics. The present study was carried out to show the inducibility of glutathione S-transferase (GST) isozymes in spruce by various substrates commonly used to assay GST activity, Inducers were: chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB), 1,2-dichloro-4-nitrobenzene (DCNB), para-nitrobenzoylchloride (pNBC), fluorodifen and n-ethylmaleinimide (NEM). Conjugation of CDNB was enhanced by the xenobiotics ranking in the order: CDNB > fluorodifen > pNBC > NEM > DCNB. 相似文献
12.
Kim YM Park K Joo GJ Jeong EM Kim JE Rhee IK 《Journal of agricultural and food chemistry》2004,52(13):4192-4196
A gene responsible for the chlorothalonil biotransformation was cloned from the chromosomal DNA of Ochrobactrum anthropi SH35B, capable of efficiently dissipating the chlorothalonil. The gene encoding glutathione S-transferase (GST) of O. anthropi SH35B was expressed in Escherichia coli, and the GST was subsequently purified by affinity chromatography. The fungicide chlorothalonil was rapidly transformed by the GST in the presence of glutathione. LC-MS analysis supported the formation of mono-, di-, and triglutathione conjugates of chlorothalonil by the GST. The monoglutathione conjugate was observed as an intermediate in the enzymatic reaction. The triglutathione conjugate has not been previously reported and seems to be the final metabolite in the biotransformation of chlorothalonil. The glutathione-dependent biotransformation of chlorothalonil catalyzed by the bacterial GST is reported. 相似文献
13.
采用PCR方法扩增出苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）几丁质酶基因（chiA）编码区1.6kb全长片段,并将该片段分别克隆至原核表达载体pET30a和杆状病毒Bac to Bac表达系统转移载体pFastBac中,分别在大肠杆菌（E. coli）BL21(DE3)和草地贪夜蛾细胞系Sf-9中进行了表达。SDS-PAGE分析表明,在大肠杆菌和昆虫细胞中均有效表达了60kDa的蛋白。将表达产物饲喂5龄棉铃虫幼虫后取其围食膜,扫描电镜结果显示,围食膜结构遭到破坏形成大量孔洞。生物测定结果表明,以上两种表达产物对Bt和NPV均具有增效作用。以AcMNPV ChiA在大肠杆菌和细胞系Sf-9中的表达产物分别与Bt Cry2Ac蛋白混合饲喂棉铃虫幼虫,增效率分别为33.4％和54.5％,其LT50较对照处理分别缩短了17.8h和20.6h;当AcMNPV ChiA在大肠杆菌和细胞系Sf-9中的表达产物分别与甘蓝夜蛾核型多角体病毒（MbNPV）混合处理棉铃虫幼虫时,其LT50与对照比较分别缩短了16.6h和22.4h。 相似文献
14.
紫杆柽柳谷胱甘肽硫转移酶基因的克隆及功能鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank已公布的植物谷胱甘肽硫转移酶基因EST序列，设计引物利用3’和5’RACE方法，获得紫杆柽柳GST基因(TaGST)全长cDNA序列，全长为1175 bp，开放读码区672 bp, 编码224个氨基酸。其所编码的蛋白与大豆的GST10同源性最高为48%。利用pET-28a（+）构建了紫杆柽柳GST基因的原核表达载体，转入BL21大肠杆菌进行了原核表达。诱导表达蛋白的SDS-PAGE检测表明, 所表达的蛋白分子量约为26 kD，与预测的分子量大小一致。初步的酶学活性的检测表明所克隆的基因编码的肽段具有催化GST蛋白通用底物CDNB和GSH反应的活性。 相似文献
15.
我国Bt棉花商业化的环境影响与风险管理策略 总被引：23，自引：0，他引：23
吴孔明 《农业生物技术学报》2007,15(1):1-4
Bt转基因棉花于1997年在我国商业化种植，到2006年种植面积已达棉花总面积的70％。环境影响监测表明，Bt棉花有效地控制了棉铃虫和红铃虫的发生和为害，但盲蝽蟓类害虫演化上升成为棉田的主要害虫。抗性分析显示，虽然棉铃虫自然种群对Bt棉花抗性基因频率没有明显的变化，但Bt棉花髙强度种植地区的棉铃虫耐受性正逐年提高，已成为影响Bt棉花持续利用的主要因素。基于Bt棉花环境风险和影响因子的综合分析，本文讨论了Bt棉花环境风险的管理策略。 相似文献
16.
17.
采用PCR方法扩增出苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcMNPV)几丁质酶基因(chiA)编码区1.6kb全长片段,并将该片段分别克隆至原核表达载体pET30a和杆状病毒BactoBac表达系统转移载体pFastBac中,分别在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)和草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞系Sf-9中进行了表达。SDS-PAGE分析表明,在大肠杆菌和昆虫细胞中均有效表达了60kD的蛋白。将表达产物饲喂5龄棉铃虫(Helicoverpa armigera)幼虫后取其围食膜,扫描电镜结果显示,围食膜结构遭到破坏形成大量孔洞。生物测定结果表明,以上两种表达产物对苏云金芽孢杆菌(Bt)和核型多角体病毒(NPV)均具有增效作用。以AcMNPVChiA在大肠杆菌和细胞系Sf-9中的表达产物分别与BtCry2Ac蛋白混合饲喂棉铃虫初孵幼虫,增效率分别为33.4%和54.5%,其LT50较对照处理分别缩短了17.8和20.6h;当AcMNPVChiA在大肠杆菌和细胞系Sf-9中的表达产物分别与甘蓝夜蛾(Mamestra brassica)核型多角体病毒(MbNPV)混合处理棉铃虫初孵幼虫时,其LT50与对照比较分别缩短了16.6和22.4h。 相似文献
18.
为探究ROP基因在棉花抵御逆境胁迫中的生物学功能,利用同源克隆的方法获得一个陆地棉GhROP6基因,通过生物信息学方法分析其理化性质、结构及进化关系,利用实时荧光定量PCR(qRTPCR)技术探究GhROP6基因的组织表达特异性及不同逆境胁迫和外源激素处理下的表达模式,构建GhROP6基因的VIGS载体并转化棉花,利用qRT-PCR技术检测其沉默效率。结果显示,GhROP6基因开放阅读框（ORF）为597 bp,编码一个含198个氨基酸的I类ROP蛋白;多重序列比对结果显示,GhROP6符合ROP蛋白结构特征,且与其他物种ROP蛋白高度同源;进化树分析结果显示GhROP6蛋白与拟南芥AtROP6蛋白同源性最高;GhROP6基因在棉花根、茎、真叶及子叶中均有表达,且在真叶中表达量最高;GhROP6基因对干旱、高盐、低温、高温等胁迫和外源脱落酸（ABA）、生长素（IAA）处理均有不同程度的响应,可能在棉花抗逆反应中扮演着重要角色。GhROP6在棉花的叶片和根部均得到有效沉默,表明已获得GhROP6基因沉默植株。本研究为进一步了解GhROP6基因的分子生物学功能奠定了基础。 相似文献
19.
水稻几丁质酶的原核表达、复性及体外抑菌活性的研究 总被引：3，自引：0，他引：3
利用RT-PCR反应,从纹枯菌诱导的水稻叶片cDNA中克隆了1个水稻几丁质酶基因RC7的全长编码序列（ORF）。通过亚克隆方法,RC7与原核表达载体pGEX-4T-1上的GST融合,构建成GST-RC7重组蛋白的原核表达载体pGST-RC7,然后,将其转化到大肠杆菌细胞中。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导,获得了以包涵体形式高效表达的GST-RC7。经过洗涤、溶解（变性）、复性及纯化等处理,包涵体中GST-RC7得到溶解、复性和纯化。纯化的复性GST-RC7蛋白具有几丁质酶活性。对6种重要作物病原真菌进行体外抑菌活性分析的结果表明, RC7可显著抑制水稻纹枯病菌、小麦纹枯菌、小麦赤霉菌、棉花黄萎菌、烟草赤星菌的菌丝生长,说明RC7可作为上述植物病害抗性基因育种的重要基因。 相似文献