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马白细胞介素-18单克隆抗体的制备及其特性的初步鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
摘要：利用纯化的用原核系统表达的重组马白细胞介素-18成熟蛋白(pET-mEIL-18)抗原免疫BALB/c 小鼠，取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，同时以昆虫杆状病毒表达系统获得的马白细胞介素-18成熟蛋白(mEIL-18)作为抗原进行间接ELISA检测，筛选并最终得到了9株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株。利用IFA试验对9株单克隆抗体进行鉴定，结果证实所获得的9株细胞分泌的抗体都是针对mEIL-18的特异性抗体。将此9株单克隆抗体分别与用原核系统分段表达的重组马白细胞介素-18成熟蛋白pET-mEIL-18-(1)(mEIL-18 1～78位氨基酸残基)和pET-mEIL-18-(2)(mEIL-18 79～157位氨基酸残基)蛋白进行特异性ELISA检测，结果表明，9株单克隆抗体有5株识别表达的pET-mEIL-18-(1)(mEIL-18 1～78位氨基酸残基)，而另外4株单克隆抗体与pET-mEIL-18-(2)(mEIL-18 79～157位氨基酸残基)发生反应，说明所获得的9株单克隆抗体至少针对pET-mEIL-18 2个或2个以上不同的抗原表位。单克隆抗体亚型鉴定试剂盒的鉴定结果显示，除M1F11、M3A11和N7D9为IgM，其余的单克隆抗体均为IgG1，而且所有单克隆抗体的轻链均为?资链。 相似文献
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利用噬菌体随机肽库筛选传染性法氏囊病病毒VP2模拟表位 总被引：2，自引：0，他引：2
用纯化的4株传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2单克隆抗体(1B5,5D1,2H11和I4-4-3)筛选噬菌体随机12肽库,对40个克隆(10个单克隆噬菌斑×4株单克隆抗体)进行ELISA验证,获得32个阳性克隆,选20个阳性克隆(5个单克隆噬菌斑×4株单克隆抗体)进行DNA序列分析,确定了4个优势12肽为不同传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗原表位.这4个12肽在一级结构上没有3个以上连续氨基酸与GenBank中传染性法氏囊病病毒、VP2的氨基酸序列相同之处,与单抗的结合可被VP2蛋白有效地抑制,推测可能是构象依赖性表位.将4个模拟表位串联表达后获得目的蛋白,经SDS-PAGE分析,目的蛋白占菌体总蛋白的20%,分子量30 kD.用多克隆抗体对目的蛋白进行免疫印迹分析,结果表明目的蛋白具有特异性和反应原性.试验结果提示:筛选的是传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2单抗的模拟表位. 相似文献
3.
摘要：将原核表达的重组马-干扰素成熟蛋白（mEIFN-）免疫BALB/c小鼠,经4次免疫后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,以昆虫杆状病毒表达系统获得的重组马-干扰素作为检测抗原进行间接ELISA检测,共筛选到15个阳性细胞株。分别经过3轮亚克隆后,最终得到了12株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株。利用间接免疫荧光（IFA）实验对12株单克隆抗体进行鉴定,结果证实所获得的12株细胞分泌的抗体均为针对马-干扰素的特异性抗体。单克隆抗体亚型鉴定结果显示,4株为IgG1、2株为IgG2a、3株为IgG2b、3株为IgM,而且所有单克隆抗体的轻链均为链。将此12株单克隆抗体分别与用原核系统分节段表达的重组马-干扰素GST-mEIFN-(1-84)、GST-mEIFN-(80-146)蛋白进行特异性ELISA检测,结果表明有7株单克隆抗体识别GST-mEIFN-(1-84),而另5株单克隆抗体与GST-mEIFN-(80-146)发生反应,说明所获得的12株单克隆抗体至少针对两个或两个以上不同的抗原表位。这将为今后建立马-干扰素检测方法、监测机体免疫状态和研究机体免疫机制奠定了基础。 相似文献
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本研究旨在制备抗鸭β-防御素9(AvBD9)蛋白的单克隆抗体.首先用pGEX-6p-1载体表达的鸭AvBD9蛋白做抗原免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠(Mus musculus),免疫3次,每次间隔15 d,融合前3 d加强免疫1次.然后将鸭AvBD9基因亚克隆到原核表达载体pET-32a的EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切位点上,构建重组表达质粒pET-32a-duckAvBD9,将重组质粒转化至大肠杆菌(Escheriohia coli)BL21(JM83-)株,经IPTG诱导表达、镍柱纯化后做检测原.用间接酶联免疫吸附实验(ELISA)和Western blot相结合的方法进行筛选及鉴定,经3次亚克隆后得到1株单抗,命名为1F11.结果表明:重组pET-32a-duckAvBD9蛋白大小为26kD,与预期大小一致,并能被抗pGEX-duck AvBD9阳性血清识别.单抗1F11在pGEX-6p-1空载体蛋白、pGEX-duck AvBD9蛋白、pGEX-duck AvBD10蛋白、pGEX-chicken AvBD10蛋白中能够特异性识别pGEX-duckAvBD9蛋白.其亚类鉴定重链为IgG1,轻链为κ链.本研究获得了1株鸭AvBD9蛋白的单克隆抗体,单抗1F11的特异性良好,可用于对鸭AvBD9蛋白的生物学功能及活性作进一步研究. 相似文献
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利用噬菌体随机7肽库分析猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白B细胞抗原表位。以PRRSV BJ-4株N蛋白的单克隆抗体(mAb)GE3作为筛选分子，筛选噬菌体展示的随机7肽库。经序列测定和分子生物学软件分析，表明噬菌体展示的外源氨基酸序列与PRRSV BJ-4株N蛋白的50～55aa的氨基酸序列有极高的同源性。ELISA分析结果表明，筛选到的噬菌体能特异性地与PRRSV阳性血清结合，从而证实了该表位是单克隆抗体GE3所识别的抗原表位。 相似文献
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血凝素（hemagglutinin,HA）蛋白是禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）的一个重要表面抗原性蛋白,在疾病诊断和防治上有重要意义。本研究为了探讨一种更为简便有效的HA重组蛋白表达途径,利用生物信息学软件,对H5N1亚型AIVHA基因编码的氨基酸序列进行分析,在分析其在大肠杆菌中的密码子偏好性、稀有密码子分布情况及有关蛋白的抗原性等重要特性后,构建了HA抗原表位重组表达质粒pET-32a（＋）-HA。经测试,该重组质粒在1mmol/LIPTG诱导剂作用下诱导过夜,能在大肠杆菌Rosetta-gami B（DE3）中高效表达,并得到48.1kD大小的目的重组表达蛋白。重组蛋白用6×His-tagged protein纯化试剂盒纯化后,与福氏佐剂等量混合制备成抗原,以200μg/鸡的剂量皮下注射2月龄SPF鸡3次,采血分离血清。Western-Blot试验结果表明,该重组表达蛋白能分别与所制备的高免鸡血清及H5N1亚型AIV阳性血清发生特异性反应,在硝酸纤维素膜上出现特异性杂交带。说明本试验研究的HA抗原重组表达蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,保留了HA蛋白的抗原活性,提示该重组蛋白在H5亚型AIV的防治技术研究中具有重要的实际应用价值。 相似文献
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制备兔多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)外膜蛋白A(OmpA)重组蛋白单抗,为兔多杀性巴氏杆菌病的诊断提供特异性强,灵敏度高的单克隆抗体。本研究选取并扩增Pm外膜蛋白基因OmpA,原核表达获得了的大小为37.6kD的OmpA重组蛋白,以纯化复性的兔多杀性巴氏杆菌OmpA重组蛋白作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠(Mus musculus),取其脾细胞与SP2/0细胞融合,ELISA筛选出了4株分泌Pm OmpA蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为5D2、BC11、2A2和6A4。其中2A2细胞培养液效价为1∶256,5D2、BC11和6A4效价为1∶128;2A2腹水效价为1∶12800,其余3株达1∶6400。杂交瘤细胞经反复冻存、复苏及多次传代,仍能稳定分泌高效价抗体。Western blot显示,4株单克隆抗体均能与Pm OmpA重组蛋白重组发生特异性反应。用ELISA方法鉴定2A2单克隆抗体亚型为IgG2b,Protein A亲和纯化2A2腹水抗体,获得的单抗浓度为130μg/mL。选取纯化的2A2单克隆抗体进行潜在应用研究,Western blot与间接免疫荧光结果显示,单克隆抗体能与兔多杀性巴氏杆菌分离菌株发生特异性反应。表明利用体外重组表达兔多杀性巴氏杆菌OmpA融合蛋白制成的杂交瘤能够稳定分泌效价高、特异性强的单克隆抗体,可用于兔多杀性巴氏杆菌诊断,本研究结果为兔多杀性巴氏杆菌诊断试剂盒的研制提供技术参数。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and resp iratory syndrom e,PRRS)是以妊娠母猪繁殖失败和仔猪出现呼吸困难为特征的传染病,PRRSV是该病的病原体。将PRRSV CH-1a株ORF6基因疏水性较强的区域删除后,克隆于pGEX-6p-1载体中,转化大肠杆菌,并进行诱导表达。经SDS-PAGA分析发现,表达了M r约为37 000的融合蛋白rtM,W estern b lot分析证实,重组蛋白能被PRRSV抗血清所识别。收获融合表达的rtM,按50μg/只的剂量与等量弗氏佐剂乳化后,经腹腔接种BALB/c小鼠,免疫3次后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,用rtM作为包被抗原,通过间接EL ISA方法筛选阳性克隆,结果获得了1株能稳定分泌抗rtM蛋白抗体的杂交瘤细胞株,将其命名为M 2B3。间接免疫荧光检测结果发现,所获得的单克隆抗体能与PRRSV感染细胞产生特异性免疫荧光。亚型鉴定结果显示,单克隆抗体M 2B3为IgG 1型,其轻链均为κ链。研究获得的融合蛋白rtM及单克隆抗体将为今后深入研究PRRSV病毒结构和功能,分析M蛋白的抗原表位等提供有益帮助。 相似文献
9.
猪传染性胃肠炎(swine transmissible gastroenteritis,TGE)是一种高度接触性肠道传染病,是我国法定检疫的疫病。为研究福建省猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)核衣壳蛋白基因(N)的分子特征及其原核表达产物的抗原性,参照GenBank中的TGEV全基因序列,设计合成一对扩增TGEV福建(FJ)分离株N基因的特异性引物,进行克隆和序列分析,结果表明,TGEV-FJ株N基因全长1149bp,编码382个氨基酸(GenBank登录号JQ700302),与国内外23株TGEVN基因的核苷酸同源性,氨基酸同源性进行比较分析,N基因核苷酸的同源性为95.4%～99.8%,氨基酸同源性为96.1%～100%。TGEV-FJ株N基因克隆至原核表达载体pET-32a中,并转化到大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3)中进行表达。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白约为68kD,与预期分子量一致;Western blot分析表明,重组蛋白能与抗TGEV阳性血清反应出现特异性条带;以纯化的重组TGEVN蛋白为包被抗原建立的间接ELISA抗体检测方法具有良好的特异性,送检20份猪(Sus scrofa)TGEV阳性血清样本中检出16份阳性结果、10份阴性血清样本中检出9份阴性结果。利用纯化的TGEV重组N蛋白免疫Balb/c小鼠,杂交瘤技术制备单克隆抗体,获得了1株特异性好并能稳定分泌抗TGEVN蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株(命名为1-27),间接免疫荧光试验证明,该单抗能特异性识别TGEV全病毒抗原。TGEVN蛋白的单克隆抗体制备为建立TGEV免疫学检测方法提供了基础资料。 相似文献
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海洋双RNA病毒(Marine birnavirus, MABV) 可引起多种海洋鱼贝的腹水病等病症。利用RT-PCR技术得到了MABV Y-6株系A片段的cDNA，进而克隆了病毒的外壳蛋白VP2e的抗原决定簇区642 bp片段(vp2e)和另一结构蛋白VP3编码区序列。通过转座作用构建了重组杆状病毒表达载体，在昆虫细胞中对VP2e 和VP3进行了表达。SDS-PAGE检测和薄层扫描表明，VP2e和VP3与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)融合蛋白表达量分别占整个昆虫细胞蛋白的15.8％和8.2％。用His Tag单抗和MABV病毒多抗对表达的VP2e融合蛋白进行Western blot检测，结果表明表达产物具有很好的抗原性。同样，用His Tag单抗和VP3多抗对表达的VP3融合蛋白进行的Western blot检测，证明融合蛋白表达正确，并且表达产物可溶，易于纯化。实验结果为该病毒结构蛋白和MABV疫苗研究提供了基础。关键词: 海洋双RNA病毒； VP2e; VP3; 杆状病毒表达系统; 表达纯化 相似文献
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小反刍兽疫N蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA方法的建立 总被引：3，自引：0，他引：3
小反刍兽疫(PPR)是由小反刍兽疫病毒(PPRV)引起的一种危害严重的急性接触性传染病。为了检测血清中存在的抗PPRV的抗体,本研究利用纯化后的真核表达的PPRVN蛋白重组蛋白(rBacmid-PPRN)作为免疫原免疫BALB/c小鼠(Mus musculus),并使用原核表达的PPRVN蛋白重组蛋白(rpET-PPRN)作为间接ELISA检测抗原,共筛选得到8株抗PPRVN蛋白的单克隆抗体(mAb)。其中1D5单抗腹水效价达1∶106,分泌单抗亚类为IgG2b。以1D5作为竞争抗体、纯化后的rpET-PPRN蛋白作为包被抗原,建立了检测小反刍兽疫血清抗体的单抗竞争性ELISA(c-ELISA)方法。所建立的c-ELISA方法能够特异性的区分牛瘟阳性血清和小反刍兽疫阳性血清,并具有较高的灵敏度和特异性。应用建立c-ELISA检测方法检测共129份山羊(Capra hircus)血清样品,与标准c-ELISA试剂盒的符合率为96.9%。本研究成功地建立了可特异性检测动物血清中抗PPRV抗体的竞争性ELISA方法,对小反刍兽疫的诊断、疫苗免疫水平的监控及控制其流行具有重要意义。 相似文献
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Li XB Yang W Zhang Y Zhang ZG Kong T Li DN Tang JJ Liu L Liu GW Wang Z 《Journal of agricultural and food chemistry》2011,59(18):9796-9799
BALB/c mice were immunized four times with formalin-prepared abrin-a. Using the polyethylene glycol method, immunized splenocytes were isolated and fused with SP2/0 cells. An indirect ELISA was established and used to detect positive clones secreting monoclonal antibodies (mAbs) against abrin-a. After analysis, three hybridoma clones secreting IgG-subtype mAbs were obtained. The antibodies were purified from the hybridoma growth medium using protein A or G affinity chromatography. Western blot analysis was used to analyze the antigenic epitopes on abrin-a recognized by the mAbs. The mAbs were specific for abrin-a, with no detectable cross-reactivity with several homologous toxins and associated agglutinins. Sandwich ELISA was then developed using these mAbs, which had a detection limit for abrin-a of 7.8 ng/mL. 相似文献
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海洋双RNA病毒(Marinebirnavirus,MABV)可引起多种海洋鱼贝的腹水病等病症。利用RT-PCR技术得到了MABVY-6株系A片段的cDNA,进而克隆了病毒的外壳蛋白VP2e的抗原决定簇区642bp片段(vp2e)和另一结构蛋白VP3编码区序列。通过转座作用构建了重组杆状病毒表达载体,在昆虫细胞中对VP2e和VP3进行了表达。SDS-PAGE检测和薄层扫描表明,VP2e和VP3与增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein,EGFP)融合蛋白表达量分别占整个昆虫细胞蛋白的15.8%和8.2%。用HisTag单抗和MABV病毒多抗对表达的VP2e融合蛋白进行Westernblot检测,结果表明表达产物具有很好的抗原性。同样,用HisTag单抗和VP3多抗对表达的VP3融合蛋白进行的Westernblot检测,证明融合蛋白表达正确,并且表达产物可溶,易于纯化。实验结果为该病毒结构蛋白和MABV疫苗研究提供了基础。 相似文献
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本文合成毒死蜱的半抗原并对其进行结构鉴定,将半抗原与牛血清白蛋白和鸡卵清蛋白共价偶联分别制备免疫原和包被原,再取已免疫的Balb/c小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,建立2株分泌毒死蜱单克隆抗体的杂交瘤细胞。以琼脂双扩散法鉴定抗体亚类类型,间接竞争ELISA方法测定了抗体对毒死蜱的灵敏度、特异性和亲和性。结果表明该抗体分泌IgG1亚类的单克隆抗体,且与毒死蜱的亲和性较高(1.5×107 L / mol),与其他结构类似物的交叉反应均小于1%。本研究成功制备了毒死蜱特异性的单克隆抗体,为今后ELISA方法的建立提供了条件。 相似文献
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用猪瘟兔化弱毒（ＳＦＶ—Ｃ）牛睾丸细胞培养上清液，经ＰＥＧ—２００００沉淀和蔗糖密度梯度离心提纯制备ＳＦＶ—Ｃ抗原，腹腔免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，取抗体阳性的免疫小鼠脾细胞，在５０％（Ｗ／Ｖ）ＰＥＧ—４０００作用下，与ＳＰ２／０－Ａｇ１４小鼠骨髓瘤细胞进行融合，产生杂交瘤细胞。用间接ＥＬＩＳＡ法筛选阳性杂交瘤细胞株。通过有限稀释进行３次克隆，获得了２株分泌抗ＳＦＶ—Ｃ的单克隆抗体杂交瘤细胞株，并对其染色体形态和数目进行分析鉴定。 相似文献
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将猪源Ｏ型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)VP1基因克隆到原核表达载体pMBX上，成功地构建重组表达质粒pMBX-VP1。将其转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞中，经SDS-PAGE分析，融合蛋白分子量约为58 kD，表达产物占菌体总蛋白的35.5％。 经蛋白可溶性分析，目的蛋白在裂解沉淀中占6.8％，在裂解上清中占31.2％，融合蛋白绝大部分是以可溶形式表达的。经Western blot证实，可溶表达的融合蛋白与FMDV阳性血清具有良好的免疫反应性。将可溶表达的融合蛋白用50%Ni-NTA树脂纯化，用融合蛋白作包被抗原，通过ELISA方法，能特异性地检测出口蹄疫阳性血清。 相似文献
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本试验利用杆状病毒载体成功地表达狂犬病病毒糖 (G) 蛋白。从转染重组了日本动物用狂犬病病毒疫苗株RC HL株G蛋白基因的转移载体和野生型杆状病毒DNA 的Sf 9 细胞中, 分离出2 个重组杆状病毒克隆。应用印渍法和荧光抗体法(IFA) 从重组杆状病毒感染的Sf 9 细胞检出了狂犬病毒G 蛋白。Sf9 细胞表达的G 蛋白与狂犬病毒RC HL株感染NA 细胞的G蛋白的分子量一致。35 个抗RC HL株G蛋白的单克隆抗体均与重组杆状病毒感染的Sf 9 细胞反应, 表明表达的G蛋白的抗原性没有发生变异。表达的G蛋白主要分布在Sf 9 细胞的膜表面, 形成类似环状的荧光,这种荧光与RC HL株感染的NA 细胞的荧光相同。 相似文献
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A set of haptens structurally resembling the herbicide imazethapyr (PURSUIT) was synthesized and used to derive monoclonal antibodies (MAbs) and direct and indirect competition enzyme immunoassays (EIAs) which could detect imazethapyr, imazaquin (SCEPTER), imazapic (CADRE), and imazamox (RAPTOR) in the 3-30 ng/mL (parts per billion) range, and imazapyr (ARSENAL) and imazamethabenz-methyl (ASSERT) in the 300-500 ppb range. Two MAbs, 3A2 and 3A5, had affinities of 10-75 nM for imazethapyr. MAbs 1A5, 1D2, and 3A5 were specific for the S isomers of the herbicides. Some MAbs were stable in solutions containing up to 15% methanol and 5% acetonitrile in indirect EIAs. Plates coated with hapten conjugates for indirect EIA could be stored frozen. Selectivity for the imidazolinones by some MAbs varied with different coating conjugates. These MAbs and haptens should prove useful in immunochemical analysis and residue recovery methods for imazethapyr and other imidazolinone herbicides. 相似文献
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人工雌性激素己烯雌酚单克隆抗体的制备及表征 总被引：1，自引：0，他引：1
合成了己烯雌酚的半抗原CP-DES,并将半抗原与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)共价偶联制备免疫原和包被原。将免疫好的Balb/c小鼠脾脏细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选出了1株能稳定分泌己烯雌酚单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D87C412C7。分析该杂交瘤细胞的染色体,并以间接酶联免疫吸附分析法(iELISA)检测了单克隆抗体免疫球蛋白的类型。获得的杂交瘤细胞的平均染色体数目为45-50对左右,它分泌IgG1亚类的单克隆抗体。该细胞株体外传代和冻存复苏后抗体分泌稳定,细胞上清效价大于640,诱导腹水效价大于108,该单克隆抗体的检测限IC20=2.3ng/ml,与己烯雌酚结构类似物存在一定的交叉反应,与两种载体蛋白(BSA,OVA)无交叉反应。本研究为己烯雌酚ELISA检测方法的建立提供了条件。 相似文献