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1.
为了研究向日葵锈病的致病机制,将向日葵锈菌转录组中表达量较高的一个基因(KU994904)中成熟部分进行生物信息学分析及基因克隆。利用Interpro对蛋白ORF区域进行分析,确定其成熟区域,通过生物信息学相关软件对其进行结构预测及预测分析,从向日葵锈菌中提取总RNA,并利用RT-PCR方法扩增此蛋白酶成熟基因并克隆。结果显示:该蛋白酶成熟基因序列全长1 335 bp,编码445个氨基酸,分子质量49.5 ku,其与M36家族中5条序列具有较高相似性,并发现同胞外金属蛋白酶基因序列相似度达到53.77%。因此,推断其为弹性金属蛋白酶。 相似文献
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为了获得黄瓜中ClpP基因的cDNA全序列,研究其与黄瓜芽黄突变现象的关系,本研究采用TRNzol法提取芽黄突变的黄瓜叶片总RNA,并以其为模板反转录合成cDNA第一链。根据NCBI预测的黄瓜ClpP基因序列设计并合成1对特异引物,通过PCR扩增得到目的条带后测序,并构建植物表达载体;成功获得黄瓜中ClpP基因的cDNA全序列,并提交到NCBI。该基因编码区全长495 bp,共编码氨基酸158个。预测其理论等电点为5.22,理论蛋白质分子量为41.00356 KDa,编码的蛋白包含S14_ClpP_2保守结构域,无信号肽。通过与其他植物Clp蛋白酶的氨基酸序列比对发现与毛茛属植物的Clp蛋白酶同源性较高。并成功构建了以CaMV35S为启动子的植物表达载体pBI121-ClpP。黄瓜中ClpP基因的cDNA全序列的获得说明该基因在黄瓜中确实存在,这是首次克隆得到了黄瓜中的ClpP基因的cDNA全序列。 相似文献
3.
丝氨酸羧肽酶（Serine carboxypeptidases,SCPs）是一类在酸性pH环境下参与多肽和蛋白质的加工、修饰与降解等多个重要环节的真核生物蛋白水解酶。根据华北大黑鳃金龟丝氨酸羧肽酶（ HoSCP）全长基因序列设计引物,利用PCR方法克隆hoscp基因并分别连接到表达载体pET28b和pPIC9K上,转化大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115,实现了其在原核以及真核体系中的表达。结果显示,HoSCP在原核细胞及酵母细胞中均能稳定表达50 kDa的特异蛋白。 HoSCP的成功表达为其在华北大黑鳃金龟体内的活性和生物学功能研究提供了可能。 相似文献
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克隆岩栖蝮蛇（Gloydius saxatilis）纤维溶解酶（Fibrinolytic enzyme,FLE）基因,分析基因序列并对该基因的功能进行分析;构建真核表达载体并鉴定。从岩栖蝮蛇毒腺细胞中提取总RNA,通过RT-PCR法扩增纤溶酶基因,与pMD18-T载体连接进行TA克隆,再进行序列的测定并且对该序列进行分析。测序鉴定后将纤溶酶基因克隆入真核表达载体pEGFP-C1,构建该基因的真核表达载体pEGFP-FLE,进行双酶切、PCR和测序鉴定。扩增得到包括完整开放读码框在内的长为774 bp的纤溶酶基因序列,成功克隆了编码岩栖蝮蛇纤溶酶的基因序列,开放读码框编码257个氨基酸,其分子质量约为30 KDa,成功构建了真核表达载体pEGFP-FLE。成功克隆岩栖蝮蛇毒纤溶酶基因并构建该酶的真核表达载体为该基因的真核表达及后续研究提供依据。 相似文献
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少孢节丛孢菌丝氨酸蛋白酶基因同源性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为了比较不同地理株的捕食线虫性真菌-少孢节丛孢菌丝氨酸蛋白酶基因的同源性,首先利用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒,提取少孢节丛孢菌内蒙古株(Arthrobotrys oligospora CHIM)的DNA,然后根据GenBank中相应丝氨酸蛋白酶基因,分别设计上下游引物；再经PCR扩增后,纯化并回收扩增产物,然后进行序列测定并分析.结果表明:少孢节丛孢菌内蒙古株丝氨酸蛋白酶基因序列与少孢节丛孢菌瑞典株(AY444597)和少孢节丛孢菌云南株(AF516146)同源性分别为80.3％和84.1％；虽然这3株菌具有较高的亲缘性,但其差异也非常明显,这一结果说明少孢节丛孢菌在不同国家或地区间有差异. 相似文献
6.
类钙调蛋白(CaM-likeprotein,CML)在植物抵抗逆境中发挥了重要的作用,因此研究CML基因是植物抗逆分子育种的一个重要分子基础。本实验室在前期工作中筛选得到1个片段大小为264 bp的大豆CML基因,对该基因序列设计特异性引物,利用PCR技术对该基因进行扩增,并获得大小为264 bp的片段,利用无缝克隆技术连接到pMD18T载体上,获得克隆载体。通过对该基因的核苷酸序列分析,在NCBI上发现该基因序列与大豆Calcium-binding protein(CML38-like)基因序列相似度为98.53%。目前对CML38-like基因的功能还未见报道,本研究根据克隆测序得到的基因序列构建系统进化树并分析,随后对该基因的蛋白质二级结构和蛋白质三级结构进行预测,发现该基因可能对大豆抗旱有着一定的影响。最后通过克隆载体构建CML38-like基因的过表达载体以及RNA干扰表达载体。本研究为鉴定大豆CML38-like基因的功能和了解该基因对大豆的非生物胁迫反应的影响提供了理论依据。 相似文献
7.
为获得鲤鱼TLR8基因序列,并明确其在不同组织的表达情况。通过RT-RCR方法克隆了鲤鱼TLR8基因序列,利用荧光定量PCR分析了TLR8 基因的表达特征。结果表明：所得鲤鱼TLR8基因序列1349bp,开放阅读框（ORF）序列1113bp,GeneBank登陆号为KT886923。另外,该克隆序列与金钱鲃、斑马鱼的序列同源性分别达到91%、82%,但与人和鼠等哺乳动物的序列同源性却很低。表达分析显示,TLR8基因在所有被检测的鲤鱼组织中均表达,尤其是在肠道和脾脏中的表达水平显著高于其它组织（p＜0.05）。总之,本研究成功获得了鲤鱼TLR8基因序列,证明其在肠道、脾脏和皮肤中的特异性表达,为进一步研究TLR8基因在鲤鱼免疫应答中的作用提供了基础。 相似文献
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为获得鲤鱼TLR8基因序列,并明确其在不同组织的表达情况,通过RT-RCR方法克隆了鲤鱼TLR8基因序列,利用荧光定量PCR分析了TLR8基因的表达特征。结果表明:所得鲤鱼TLR8基因序列1349 bp,开放阅读框(ORF)序列1113 bp,Gen Bank登录号为KT886923。另外,该克隆序列与金钱鲃、斑马鱼的序列同源性分别达到91%、82%,但与人和鼠等哺乳动物的序列同源性却很低。表达分析显示,TLR8基因在所有被检测的鲤鱼组织中均表达,尤其是在肠道和脾脏中的表达水平显著高于其他组织(P0.05)。本研究成功获得了鲤鱼TLR8基因序列,证明其在肠道、脾脏和皮肤中的特异性表达,为进一步研究TLR8基因在鲤鱼免疫应答中的作用提供了基础。 相似文献
9.
为研究毛果杨半胱氨酸蛋白酶基因PtCP3的酶学特征和生理功能,本实验对PtCP3进行了基因克隆和原核表达分析。从毛果杨(Populus trichocarpa Torr.Gray)中克隆得到半胱氨酸蛋白酶基因PtCP3,将其克隆至pMD-18T载体。进一步构建原核表达载体pET30a-PtCP3,并在大肠杆菌(Escherichia coli)中成功诱导表达重组蛋白,然后通过包涵体洗涤法对目的蛋白进行纯化。测序结果表明,PtCP3基因CDS序列全长1074 bp,含有木瓜蛋白酶的保守催化位点和组织蛋白酶B的保守结构域。序列分析结果显示,半胱氨酸蛋白酶基因PtCP3编码357个氨基酸,预测N-末端含有长度为27个氨基酸残基的信号肽序列,去除信号肽后蛋白酶大小为36.515 kDa,理论等电点为7.44。SDS-PAGE电泳结果显示,可以检测到大小约为42 kDa的目的条带,并可通过包涵体洗涤法在体外得到了高表达量、单一的重组蛋白PtCP3。 相似文献
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摘 要：为了研究含有跨膜结构域TAT基因的重组奶牛神经肽Y融合蛋白的生物学活性。利用基因工程技术,在牛神经肽Y基因序列中插入TAT蛋白基因序列,构建原核表达载体pGEX-3X-NPY-PTD,导入到BL21宿主菌中,进行表达,对表达产物进行鉴定、表达条件优化和纯化。并且经过活性检测,融合蛋白对鸡胚血管生成的促进作用,表明含有PTD结构的重组奶牛神经肽Y具有生物功能活性,为动物试验奠定了基础。为了获得重组TAT-NPY融合蛋白,并研究其生物学活性。利用基因工程技术,从犊牛下丘脑组织中克隆得到神经肽Y基因序列,通过基因比对符合率为100%。同时,在牛神经肽Y基因序列中插入TAT蛋白基因序列,构建原核表达载体pGEX-3X-NPY-PTD,导入到BL21宿主菌中,进行原核表达,并对表达产物进行鉴定、表达条件优化和纯化。并且经过活性检测,融合蛋白对鸡胚血管生成起促进作用。表明含有PTD结构的重组奶牛神经肽Y具有生物功能活性,为下一步的研究提供了物质基础。 相似文献